实验4 细胞融合.ppt
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细胞融合
聚乙二醇 诱导
是化学试剂， 是化学试剂，使 用起来很方便， 用起来很方便， 诱导细胞融合的 频率比较高
电诱导
优 点 缺 点
有一定毒性， 有一定毒性， 对有些细胞 (如卵细胞)不 如卵细胞) 适用
影响因素较多， 影响因素较多， 例如培养液的 选择，温度、 选择，温度、 渗透压等都是 影响电融合的 因素。 因素。
请思考： 请思考：
植物体细胞杂交技术
1、过程
植物细胞A 植物细胞
去壁
植物细胞的融合
方法？ 方法？
融合 完成 的 标志
植物组织培养
原生质体A 原生质体A 原生质体B 原生质体
去壁
人 工 诱 导
融合的 原生质 体AB
杂种 细胞 脱 再 AB 分
生 出 细 胞 壁 化
愈 伤 组 织
再 分 化
杂 种 植 株
一、 动物 细胞 融合 过程
1.动物细胞融合的过程 动物细胞融合的过程
细胞A 细胞
物理法
细胞B 细胞
灭活的病毒 化学法
杂交细胞
2.动物细胞融合的诱导手段 2.动物细胞融合的诱导手段
①化学法： 聚乙二醇（PEG)等试剂 ②灭活 灭活病毒 灭活
• 仙台病毒 • 疱疹病毒 • 新城鸡瘟病毒
③物理法： 离心、 融合技术、振动、显微操作等 离心、电融合技术、振动、显微操作等
练习
C
思考下列问题： 思考下列问题：
• 1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞 、什么叫动物细胞融合？ 融合有什么不同呢？ 融合有什么不同呢？ • 2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合 、动物细胞在结构上有何区别？ 过程有什么影响？ 过程有什么影响？ • 3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否 、 相同？两者的融合过程是否也一样？ 相同？两者的融合过程是否也一样？
植物细胞融合(实验)
根据实验需要，准备适当 的化学试剂和酶溶液，如 细胞壁酶、离散剂、缓冲 液等。
准备仪器
准备适当的显微镜、离心 机、摇床、培养皿等实验 仪器。
分离原生质体
表面消毒
将实验材料表面消毒，以避免污染。
酶解
用适当的酶溶液处理实验材料，使细胞壁分解，释放 出原生质体。
分离
将酶解后的组织用离心机或过滤法分离出生质体。鉴定通过形态学观察、分子生 物学技术或免疫学技术等 方法对融合细胞进行鉴定。
培养与繁殖
将筛选和鉴定合格的融合 细胞进行培养和繁殖，以 备后续实验或应用。
03
植物细胞融合实验结果分 析
融合细胞的筛选结果
1 2
筛选方法
采用抗性筛选和荧光激活细胞分选（FACS）等 方法，从融合细胞群体中筛选出具有稳定融合特 征的细胞。
筛选和培育融合细胞
在融合后的细胞中筛选具有双亲遗传 特征的融合细胞，并进行进一步的培 育和筛选。
克隆和繁殖
对筛选出的融合细胞进行克隆和繁殖， 获得具有特定性状的植物个体。
02
植物细胞融合实验步骤
准备实验材料
01
02
03
选择实验材料
选择健康、无病虫害的植 物组织作为实验材料，如 根、茎、叶等。
准备试剂
植物细胞融合(实验)
目录
• 植物细胞融合实验简介 • 植物细胞融合实验步骤 • 植物细胞融合实验结果分析 • 植物细胞融合实验的应用与展望 • 结论
01
植物细胞融合实验简介
植物细胞融合的定义
01
植物细胞融合是指将来自不同植 物的细胞通过物理或化学方法诱 导融合，形成一个具有双亲遗传 特征的融合细胞的过程。
植物细胞融合技术可以用于新品种的培育和遗传改良，未来可以开展 相关研究，为育种工作提供新的工具和方法。
准备仪器
准备适当的显微镜、离心 机、摇床、培养皿等实验 仪器。
分离原生质体
表面消毒
将实验材料表面消毒，以避免污染。
酶解
用适当的酶溶液处理实验材料，使细胞壁分解，释放 出原生质体。
分离
将酶解后的组织用离心机或过滤法分离出生质体。鉴定通过形态学观察、分子生 物学技术或免疫学技术等 方法对融合细胞进行鉴定。
培养与繁殖
将筛选和鉴定合格的融合 细胞进行培养和繁殖，以 备后续实验或应用。
03
植物细胞融合实验结果分 析
融合细胞的筛选结果
1 2
筛选方法
采用抗性筛选和荧光激活细胞分选（FACS）等 方法，从融合细胞群体中筛选出具有稳定融合特 征的细胞。
筛选和培育融合细胞
在融合后的细胞中筛选具有双亲遗传 特征的融合细胞，并进行进一步的培 育和筛选。
克隆和繁殖
对筛选出的融合细胞进行克隆和繁殖， 获得具有特定性状的植物个体。
02
植物细胞融合实验步骤
准备实验材料
01
02
03
选择实验材料
选择健康、无病虫害的植 物组织作为实验材料，如 根、茎、叶等。
准备试剂
植物细胞融合(实验)
目录
• 植物细胞融合实验简介 • 植物细胞融合实验步骤 • 植物细胞融合实验结果分析 • 植物细胞融合实验的应用与展望 • 结论
01
植物细胞融合实验简介
植物细胞融合的定义
01
植物细胞融合是指将来自不同植 物的细胞通过物理或化学方法诱 导融合，形成一个具有双亲遗传 特征的融合细胞的过程。
植物细胞融合技术可以用于新品种的培育和遗传改良，未来可以开展 相关研究，为育种工作提供新的工具和方法。
细胞融合
Animal cell engineering
动物细胞工程
单克隆抗体
●二、单克隆抗体技术 二
◕B淋巴细胞不能在体外无限增殖。1975年 淋巴细胞不能在体外无限增殖。 淋巴细胞不能在体外无限增殖 年 Köehler和Milstein利用杂交瘤技术，使绵羊红 利用杂交瘤技术， 和 利用杂交瘤技术 细胞(SRBC)免疫后小鼠的 淋巴细胞和小鼠的 免疫后小鼠的B淋巴细胞和小鼠的 细胞 免疫后小鼠的 骨髓瘤细胞融合，建立产生抗SRBC单抗的杂 骨髓瘤细胞融合，建立产生抗 单抗的杂 交细胞株。它既具有B淋巴细胞产生特异性抗 交细胞株。它既具有 淋巴细胞产生特异性抗 体的能力， 体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的 特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。 特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。
Animal cell engineering
动物细胞工程
◑1B) 后天免疫反应的四个阶段： 后天免疫反应的四个阶段：
◔ 遭遇： 巨噬细胞把抗原分解成小片段，专一地表现给 TH 遭遇： 巨噬细胞把抗原分解成小片段， 细胞。 细胞。 ◔ 动员： TH 细胞动员 TK（TC）细胞及 B 细胞，后者生产 动员： 细胞， 专一性抗体。 专一性抗体。 ◔ 扫荡： 抗体及 TK 细胞攻击入侵的抗原。 扫荡： 细胞攻击入侵的抗原。 ◔ 休止： 完成清除抗原后，免疫细胞休息。 休止： 完成清除抗原后，免疫细胞休息。
Animal cell engineering
动物细胞工程
细胞融合
●二、细胞融合的意义 二
◕ 细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘 细胞融合能把亲缘关系较远， 关系的生物体细胞融合在一起， 关系的生物体细胞融合在一起，打破了仅仅依 赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了 赖有性杂交重组基因创造新种的界限， 遗传物质的重组范围。 遗传物质的重组范围。是改善细胞遗传物质的 有力手段。 有力手段。
第4章-细胞拆合与重组-1PPT课件
-源自34.2 基本概念
胞质体（cytoplast）： 除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 植物去核原生质体又称微质体（mini-protoplast） 或亚原生质体（subprotoplast）
-
4
4.2 基本概念
微细胞（microcell）： 只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一 层完整的细胞质膜的核质体
-
5
4.2 基本概念
细胞重组（cell reconstruction): 将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介 子的诱导下，使胞质体与完整细胞合并 ，或胞质体与 核体重新组成，构成细胞的过程。
-
6
4.2 基本概念
细胞重组的方式 1. 胞质体与完整细胞重组——胞质杂种（cybrid） 2. 微细胞与完整细胞重组——微细胞异核体（heterokaryon） 3. 胞质体与核体（karyoplast）重新组合
-
19
4.5 细胞重组及细胞质杂交
4.5.2 植物的细胞重组 使胞质体与核悬浮并沉淀在硝酸钙溶液中，除去上清 液，先把它们悬浮，然后以适当比例使核与胞质体在 试管中混合，离心，随后加入PEG处理使它们凝集，再 慢慢加入硝酸钙溶液，促使核的摄入，其后洗涤、培 养，把异核的原生质体培养成新的植株
-
20
采用适当浓度的有丝分裂阻抑剂（秋水仙碱、长春花碱等）， 使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期。数小时后，染色 体解开螺旋，形成外包有被膜的微核。通过酶解分离出微核化 的原生质体，再经过离心等技术分离出带有微核的微原生质体， 诱导其与受体原生质体融合（又称微原生质体融合）。根据融 合类型，在筛选培养基上进行筛选，诱导发芽、生根或体胚发 生，直至长成完整植株，从而实现部分基因组的转移
胞质体（cytoplast）： 除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 植物去核原生质体又称微质体（mini-protoplast） 或亚原生质体（subprotoplast）
-
4
4.2 基本概念
微细胞（microcell）： 只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一 层完整的细胞质膜的核质体
-
5
4.2 基本概念
细胞重组（cell reconstruction): 将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介 子的诱导下，使胞质体与完整细胞合并 ，或胞质体与 核体重新组成，构成细胞的过程。
-
6
4.2 基本概念
细胞重组的方式 1. 胞质体与完整细胞重组——胞质杂种（cybrid） 2. 微细胞与完整细胞重组——微细胞异核体（heterokaryon） 3. 胞质体与核体（karyoplast）重新组合
-
19
4.5 细胞重组及细胞质杂交
4.5.2 植物的细胞重组 使胞质体与核悬浮并沉淀在硝酸钙溶液中，除去上清 液，先把它们悬浮，然后以适当比例使核与胞质体在 试管中混合，离心，随后加入PEG处理使它们凝集，再 慢慢加入硝酸钙溶液，促使核的摄入，其后洗涤、培 养，把异核的原生质体培养成新的植株
-
20
采用适当浓度的有丝分裂阻抑剂（秋水仙碱、长春花碱等）， 使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期。数小时后，染色 体解开螺旋，形成外包有被膜的微核。通过酶解分离出微核化 的原生质体，再经过离心等技术分离出带有微核的微原生质体， 诱导其与受体原生质体融合（又称微原生质体融合）。根据融 合类型，在筛选培养基上进行筛选，诱导发芽、生根或体胚发 生，直至长成完整植株，从而实现部分基因组的转移
《细胞生物学实验》PPT课件
35
备注
36
实验四 叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的：
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器 分离的一般原理和方法；
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟 悉荧光显微镜的使用方法。
37
二、 实验原理
组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是 分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降 速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以 及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一 时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依 次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中 的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。
53
实验内容与实施过程
4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） ①取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净； ②将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无 菌蒸馏水漂洗5次； ③用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养 皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
49
②原生质体分离纯化或融合后，在适当的 培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞 壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团， 长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其 中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体 培养中最基础也是最关键的环节。
50
三、实验仪器
台式离心机、 高压灭菌锅、 倒置显微镜、 超净工作台
26
③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒 体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧 化酶使染料保持氧化状态，即有色状态， 呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被 还原，成为无色状态
27
三、实验仪器
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、 双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖 玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
备注
36
实验四 叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的：
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器 分离的一般原理和方法；
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟 悉荧光显微镜的使用方法。
37
二、 实验原理
组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是 分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降 速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以 及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一 时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依 次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中 的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。
53
实验内容与实施过程
4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） ①取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净； ②将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无 菌蒸馏水漂洗5次； ③用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养 皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
49
②原生质体分离纯化或融合后，在适当的 培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞 壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团， 长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其 中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体 培养中最基础也是最关键的环节。
50
三、实验仪器
台式离心机、 高压灭菌锅、 倒置显微镜、 超净工作台
26
③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒 体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧 化酶使染料保持氧化状态，即有色状态， 呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被 还原，成为无色状态
27
三、实验仪器
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、 双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖 玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
细胞融合实验原理
3. 弃去上清，加入0.3ml的GKN溶液，制成细胞悬液； （也可以用血球计数板计数，用GKN液将其调整为 106个/ml）；
实验操作
5. 取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后放入 37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min；
6. 20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加 入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃ 水浴中保温20min；
弃去上清加入弃去上清加入gkngkn液少许混匀取少量悬浮于液少许混匀取少量悬浮于载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀3min3min盖上盖玻片观察细胞融合情况
细胞融合
实验原理
两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细 胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g， NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。
GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红 0.01g，溶于1000ml水中。
50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000） 放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至 50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混 匀，置37备用。
实验操作
1. 在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的 Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达1∶4， 混匀后可在冰箱中存放一周；
2. 取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85％生理盐水， 充分混匀，1500r/min离心5min，弃去上清，加入 1ml的0.85％生理盐水，重复上述条件离心两次。 最后弃去上清，加GKN液0.8ml，离心；
实验操作
5. 取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后放入 37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min；
6. 20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加 入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃ 水浴中保温20min；
弃去上清加入弃去上清加入gkngkn液少许混匀取少量悬浮于液少许混匀取少量悬浮于载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀3min3min盖上盖玻片观察细胞融合情况
细胞融合
实验原理
两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细 胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g， NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。
GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红 0.01g，溶于1000ml水中。
50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000） 放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至 50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混 匀，置37备用。
实验操作
1. 在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的 Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达1∶4， 混匀后可在冰箱中存放一周；
2. 取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85％生理盐水， 充分混匀，1500r/min离心5min，弃去上清，加入 1ml的0.85％生理盐水，重复上述条件离心两次。 最后弃去上清，加GKN液0.8ml，离心；
细胞融合技术
动物细胞融合
动物细胞融合
有 何 同 ？ 不 同 ？
植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
细胞工程 实质内容 植物体细胞杂交 动物细胞融合
改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品 使后代具有双亲 改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品(使后代具有双亲 的特性) 的特性 细胞膜的流动性;细胞增殖 细胞膜的流动性 细胞增殖 物理法：离心、振动、 物理法：离心、振动、电激 化学法： 化学法：聚乙二醇 生物法： 生物法：灭活的病毒 获得分离的单个动物细胞 (胰蛋白酶处理 胰蛋白酶处理) 胰蛋白酶处理 ↓ 诱导融合 ↓ 动物细胞培养 (细胞产品 细胞产品) 细胞产品 主要用于单克隆抗体的制备 (杂交瘤细胞 杂交瘤细胞) 杂交瘤细胞
细胞膜的流动性;植物细胞全能性 理论基础 细胞膜的流动性 植物细胞全能性 诱导手段 物理法：离心、振动、 物理法：离心、振动、电激 化学法： 化学法：聚乙二醇 去细胞壁 (纤维素酶、果胶酶 纤维素酶、 纤维素酶 果胶酶) ↓ 原生质体融合 (获得杂种原生质体 获得杂种原生质体) 获得杂种原生质体 ↓ 植物细胞培养 (获得植株 获得植株) 获得植株 获得白菜-甘蓝等杂种植物 获得白菜 甘蓝等杂种植物
单克隆抗体
（三）单克隆抗体的应用
①诊断疾病（识别作用， 诊断疾病（识别作用， 如同位素标记单克隆抗 可诊断肿瘤、 体，可诊断肿瘤、心血 诊断乳腺癌单克隆抗体 管畸形等）优点：准确、高效、简易、 管畸形等）优点：准确、高效、简易、快速 ②用于治疗疾病和运载药物 主要用于癌症治疗， （主要用于癌症治疗，也可运 载药物， 生物导弹” 载药物，如 “生物导弹”）
选择培养基上培养
专一抗体 检验阳性
多种杂交细胞
杂交瘤细胞有何特点？ 杂交瘤细胞有何特点？
PEG法诱导细胞融合
实验十PEG法诱导细胞融合一、实验目的1.了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。
2.通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：①病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);②化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol ,PEG）;③电场诱导的细胞融合；④激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。
该方法应用相对分子质量为400~6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。
融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
三、实验仪器、材料和试剂（１）仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。
（２）材料：成年家鸡。
（３）试剂1）0.85%NaCl溶液。
2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O，0.69 g NaH2PO4·H2O,2.0g葡萄糖,0.01g酚红,溶于1000ml重蒸水中。
3）50%（m/v）PEG溶液：①取50gPEG （相对分子量=4 000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min.②让PEG 冷却至50-60℃，勿让其凝固。