蛋白质类药物分析

Comparability Analysis by Peptide Mapping LC-MS/MS for a biosimilar mAb to its original mAb identified an amino acid mutation and several PTMs (oxidation and deamidation), shown by the red arrows, as compared to the biosimilar mAb.
第九章 蛋白质和多肽类药物的分析
第一节 概述

一、蛋白质和多肽重要理化性质 二、蛋白质和多肽类药物质量控制标准 三、蛋白质和多肽类药物的活性及测定方法
一、主要理化性质


高分子特性：是其胶体性、变性和免疫学特性基础
两性解离与等电点：影响多肽、蛋白质分离、纯化和 分析 颜色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应

样品：原液、成品 标准：不同生物活性测定方法的规定标准 测定方法 规定标准 动物基础的活性测定 70%~130%标示量 细胞基础的活性测定 80%~120%标示量 酶学基础的活性测定 85%~115%标示量 结合反应的活性测定 85%~115%标示量
（五）蛋白质药物的比活性

样品：原液 定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性 单位（IU/mg） 意义：真实反映有活性的蛋白质所占的比例， 厂家间、表达系统间、批间比较 便于配制成品


第二节 蛋白质和多肽类药物分析

一、鉴别 二、结构确证 三、检查 四、含量测定 五、残余杂质检测 六、安全性及其他检查
一、鉴别


鉴别药物的真伪
（一）化学鉴别：双缩脲反应（是否蛋白质/多肽 类）
（二）紫外吸收光谱扫描（Chp附录ⅡA）

样品：原液


方法：紫外扫描
标准：最大吸收波长与特征波长一致、批与
基酸种类和数量，从而知道Pr的C末端残基顺序

由于羧肽酶对不同的C末端氨基酸作用的速度不同，
且反应是连续的，不能停在某一步上，给正确判断
氨基酸顺序造成了一定困难
4种常用羧肽酶
羧肽酶 来源 专一性
CpA
CpB CpC
胰脏
胰脏
能 释 放 除 pro 、 Arg 和 Lys 以外的所有C端氨基酸 主要水解 C 端为 Arg 或 Lys 的肽键
1、蛋白质及肽水解方法

虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更
精确、更快速以及自动化方向发展和改进，
但还没有一种单独适用于所有残基的，并且 能在水解液中定量回收的水解方法出现，很 多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、 水解方法等对水解的完全程度均有影响
相当广泛，几乎能释放C端 植物或微生物 的所有氨基酸
CpY
面包酵母
可释放C端所有氨基酸
19种标准氨基酸色谱图
N-端序列分析，二硫键定位分析，检查位点修饰情况（如糖基化或磷酸化）
（三）肽图分析（Chp附录ⅧE）

概念：根据蛋白质、多肽的氨基酸排列顺序，使用 各种定位裂解方法将蛋白质、多肽裂解成大小固定 的多个小分子肽链，通过分离并检测，形成可供鉴 别的特征性指纹图谱 意义:一级结构，工艺稳定性 方法：溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE /CE/质谱法 标准：有特征性图谱/批与批间一致
（二）生物学活性测定方法分类




1、动物基础的活性测定 1）离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 2）体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞 2、细胞基础的活性测定 1）促细胞生长法：大多数细胞因子类 2）抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 3）间接保护细胞法：IFN保护WISH 3、酶学基础的活性测定：重组酶类 4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗 原决定簇与活性中心常不一致

等电点（PI）测定 紫外光谱扫描 末端氨基酸序列测定
肽图分析
氨基酸组成分析
（一）等电点测定（Chp附录ⅣD）

不同蛋白质或多肽具有不同等电点，可以表
征药物纯度

等电点测定是控制重组产品生产工艺稳定性 的重要指标：均一的重组蛋白质只有一个等 电点，有时因加工修饰等影响可出现多个等
电点，但应有一定的范围
HPLC pattern of S. aureus fingerprint of human (a) and bovine (b) insulin
（四）氨基酸组成分析

结构分析的辅助手段，质量控制的重要指标。对水 解后产生的氨基酸种类定量测定，获得各种氨基酸 摩尔比，对蛋白质/多肽进行鉴别 在试生产的头三批或工艺改变时应当测定 方法：HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定）+氨基酸 自动分析仪 标准：与理论值一致，批与批间一致


氨基酸组成分析步骤

3个步骤，即： 1 水解
在一定温度、酸 度等条件下， Pr/多肽的肽键 断裂，水解成游 离氨基酸
2 衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
3 色谱
利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析
Representative chromatograms for hydrolysate amino acids and free amino acids

方法：
1）等电聚焦电泳法（IEF）：
2）毛细管电泳法（CE）：该法用紫外检 测，适用于某些不易染色的Pr/多肽，如EGF、 hCGRP等制品的测定

标准:标准：有明显主带、理论值±0.5pH范 围、批与批间一致
（二）末端序列分析（Chp附录ⅧE）

作为重组蛋白质和多肽的重要鉴别指标，一般要求：

紫外吸收：280nm处最大吸收，可定量蛋白质和多 肽
（一）高分子特性

是其胶体性、变性和免疫学特性的基础
1、胶体性质
可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨
基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合
作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同
时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相
当稳定的亲水胶体（Φ1-100nm）。
Sequence coverage and Peptide-mass fingerprinting of CRM197 digested with acid hydrolysis and LysCby, respectively.
利妥昔单抗肽图分析
Tryptic peptide map analysis of stability monoclonal antibodies by hydrophobic interaction chromatography. Selected region of tryptic peptide maps of a stability sample held at 40°C for 0 weeks (black), 12 weeks (blue), or 24 weeks (red).
1、N-端测序


方法：Edman化学降解法-异硫氰酸苯酯 （PITC)法 样品处理： 1）纯度鉴定：≥97% 2）脱盐 3）巯基保护：碘代乙酰胺 4）去除N-端封闭的基团：酸水解、酶处理
268nm
2、C-末端测序

方法：羧肽酶法
羧肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链的C端逐个
水解氨基酸。根据不同反应时间测出酶水解所释放氨
疏水色谱
2、变性与复性
蛋白质高级结构是其理化特性及生物学功能基础 。当蛋白质受某些理化因素影响，其分子内原有高级 构象发生变化，蛋白质理化性质和生物学功能改变或
丧失，但一级结构未变，即变性作用(denaturation)
表征：生物活性丧失；物理（溶解度、粘度、扩
散系数、光谱特性）和化学（化学反应，被酶解性）
改变.
生物活性
wk.baidu.com、凝集（Aggregation）
（二）两性解离与等电点

影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析
（三）颜色反应

可用于蛋白质定量与定性分析
1）茚三酮反应
2）双缩脲反应 3）酚试剂反应
双缩脲反应
Cu2+
(碱性溶液)
红紫色络合物
（四）紫外吸收

蛋白质和多肽组成中常含有酪氨酸、色氨酸
和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在远紫外光区
1、N末端：15个残基（Edman化学降解法、Pr全 自动测序仪） 2、C末端：1-3个残基（羧肽酶降解法、RPHPLC），但在我国现有法规中C端不一定要测定

封闭N-末端测定（N-末端乙酰化、焦谷式N-末端）
标准：与理论值一致、批与批间一致
de novo Protein Sequencing


肽图裂解方法

化学裂解法：非特异性降解，裂解位点少 蛋白酶裂解法：特异性降解，裂解位点较多 特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂特殊产品
肽图分析方法

RP-HPLC CE HPLC-MS SDS-PAGE
Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase

标准：阳性
SDS-PAGE
Western blot
（四）HPLC法

根据待测样品（T）与标准品（S）/对照品方 法的保留时间（t0）的一致性进行定性分析

当T的t0与S完全相同，则能判定T可能与S为
同一物质；特别是如果色谱条件改变，T的t0
与S的t0仍能一致，则基本判定是同一物质
二、结构确证
批间一致

一级结构不含芳香族氨基酸重组药物，在 280nm附近没有最大吸收峰，可不做紫外 吸收光谱测定
重组脑利钠肽(rhBNP)
（三）免疫印迹

方法：通常用免疫印迹（immunoblotting）
和斑点免疫（Dot Immunobinding）进行
鉴定，特别当电泳出现两条或两条以上区带
时则应该用免疫印迹进行鉴定
（三）生物学活性测定方法选择

1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法 2、细胞染色标记方法：MTT＞3HThymidine＞流式细胞仪（测细胞周期） 3、定量法＞半定量法＞定性法 4、生物学活性不一定与临床药效类型一致

工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。 如rh-GH用HPLC
（四）生物学活性测定（Chp附录ⅩC）
（四）生物学活性测定
（五）蛋白质药物的比活性
（一）生物学活性及比活性测定

检测意义 获取准确的效价信息，保证产品有效 效价：有效性指标，反映药品效力 生物学活性才能真实反映生物技术药效价 原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定， 使得重量与效价不一致

生物制品技术药:单位（U、AU、IU）

分子量：还原型SDS-PAGE法（见Chp附录ⅣC）、
质谱法

外源性DNA残留量：≤10ng/剂量（见Chp附录ⅨB）

宿主蛋白残留量：≤0.1%，0.05%（见Chp附录ⅨC） 残余抗生素：不得检出（见Chp附录ⅨA） 细菌内毒素：≤10EU剂量（见Chp附录ⅫE凝胶限 量试验）



结构确证：等电点（见Chp附录ⅣD）、紫外吸收 光谱扫描（见Chp附录ⅡA）、N末端15个氨基酸 顺序、肽图（见Chp附录ⅧE）、氨基酸组成
（二）成品质量标准

鉴别试验：免疫印迹或斑点法，阳性 物理检查：外观、可见异物、装量 化学检查：水分、pH值 生物学活性：标示值的%范围 无菌检查：不得检出 内毒素检查：≤10EU剂量 异常毒性检查：符合规定
三、蛋白质和多肽类药物活性及测定方法

（一）生物学活性及比活性测定 （二）生物学活性测定方法分类 （三）生物学活性测定方法选择
（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一
特征吸收峰
二、蛋白质和多肽类药物质量标准

（一）原液质量标准 （二）成品质量标准
（一）原液质量标准

生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC）
蛋白质含量（见Chp附录ⅥD）


纯度：≥95%，非还原SDS-PAGE（见Chp附录
ⅣC）、HPLC法（见Chp附录ⅢB）