环氧化物水解酶
酶的固定化发展进程
固定化酶的发展进程Den Brady·Justin JordaanReceived: 2 April 2009/Received: 19 June 2009/Accepted: 22 June 2009/Published online: 10 July 2009 © Springer Science+Business Media B.V. 2009摘要改善当前酶的载体固定化的策略，如今发展的方向都是使用杂交技术也就是通过多位点连接，从而提高酶的连接效率和稳定性。
最新的商品树脂展现出了经改善的蛋白质的可结合量。
最新的酶的自固定化方法（包埋法、交联法）在载体材料选择上正在蓬勃发展。
除此之外还有酶固定化材料（载体）的回收和回收后材料的稳定性（可再生能力），和酶的固定化的出现带来的好处，例如提高酶的活性，经修饰（固定化）后的酶在底物的选择能力上和酶簇反应上。
这些进展预示了酶的固定化技术在工业生产中的应用前景，同时意味着打开了新技术的大门。
关键词生物催化剂、生物催化反应、酶、固定化介绍生物催化反应过程中，提高通过酶的固定化来实现酶的再生能力可在生产中减少成本，同时带来巨大额经济利益。
酶的固定化量的保持使固定化酶与产品的分离回收变得简单可操作，因此在生产中允许连续生产，同时减少了下游工程（分离工程）的困难性，也就是说减少了下游工程对蛋白质活性的影响。
酶的固定化在理想条件下（例如：酸、碱、有机溶剂和温度的提升）能提升酶的性能，同时这些因素阻碍着酶在工业化学合成上的应用。
不拘泥于在历史的长河中固定化酶明显的优点，估计只有20%的生物催化反应使用了固定化酶的技术。
然而在过去的几年中许多的令人感兴趣的新发展已经在文献上做了相应的报告并取得了专利许可，暗示着酶的固定化技术已经进展到令人兴奋的新篇章。
酶固定化类型包埋法包埋酶是一种典型的完成酶的聚合物的方法（图1），像是一个有机的聚合物或者是凝胶，它经常被看做是一个个体。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
卤醇脱卤酶研究进展
卤醇脱卤酶
来源
亚型
文献 编号
HheA
Corynebacterium sp. N-1074
A
HheAAD2
Arthrobacter sp. AD2
A
HheB HheBGP1
Corynebacterium sp. N-1074 Mycobacterium sp. GP1
B
B [10]
HalB
Agrobacterium tumefaciens
由红色变成黄色，利用分光光度计测定吸光值的变
的认识，对其他卤醇脱卤酶的结构和功能关系还未明
化,进而找到最优突变体，但是该方法容易筛选出假 确，因此该策略在其他卤醇脱卤酶的改造上存在较大
基于已有的蛋白质晶体结构，借助于计算机同源建模分了解酶结 构和功能的基础上，虽然可以快速找出与酶特性相关
0. 01%的苯酚红的2 mmol/L HEPES缓冲液作为反
的残基进行定点突变来提高其特性，但是到目前为
应缓冲液，随着反应的进行释放氢离子，体系的颜色 止,人们只对卤醇脱卤酶HheC的结构和功能有明确
Abstract: Halohydrin dehalogenase is the key biocatalyst to produce chiral epoxides and chiral and ^-substituted alcohol. Halohydrin dehalogenase can catalyze the dehalogenation of o-halo alcohol toproducechiralepoxidesfolowingtheintramolecularnucleophilicsubstitution mechanism It also can catalyze the opening ring reaction of halogenated epoxy compounds to synthesis chiral #substituted alcohol. The products , chiral epoxides and ^-substituted alcohol are key chiral building blocks for chiral pharmaceuticals and other chiral fine chemicals; The molecular evolutionandimmobilizationofthehalohydrindehalogenasecansignificantlyimprovetheenzyme activity stereoselectivity and stability which is very important to halohydrin dehalogenase application;In this review the research progress on the halohydrin dehalogenase source molecularevolution and immobilization in recent yearsis highlighted;The further research directionabouthalohydrindehalogenaseisalsopointedout;
《有机化学》有机合成方法研究进展
有机合成方法研究进展一、前言1.有机合成是有机化学中最富活力的领域有机合成是表现有机化学家非凡创造力的舞台。
有机合成是化学科学对人类文明作出重大贡献的领域。
资料：* 1900-2000年的100年中，化学合成和分离了2285万种化合物（包括天然产物、药物、染料、高分子化合物等）。
其中大部分都是有机合成的产物。
* 许多天然存在的有机化合物，包括复杂的天然产物，都可以用有机合成方法制得。
有机合成是有机化学中永不枯竭的研究资源：* 生命科学: 生物大分子，生物活性分子，生化分析试剂等* 医药学: 药物，药理、病理分析试剂等* 农业: 农药、农用化学品等* 石油: 石油化工产品等* 材料科学: 高分子化合物，功能材料等* 食品: 食品添加剂等* 日用化工: 染料，涂料，化装品等有机合成是推动有机化学发展的永恒动力：人类文明发展对新结构、新功能、新用途的有机化合物永恒的需求。
有机化学家在解决有机合成问题过程中，全面发展了有机化学：化学结构理论，反应理论，合成方法，分离纯化方法，结构鉴定方法等。
具有重要功能的复杂有机分子，如生物大分子、天然有机化合物、药物、染料、材料、特殊有机试剂、精细有机化学产品以及其它功能有机化合物的合成需要；结构与功能关系研究需要等是有机合成方法研究的基本动力。
例如：* 手性纯氨基酸的合成--------->不对称合成法* 多肽合成--------->固相合成法* 大规模药效筛选--------->组合化学法* 特殊结构化合物合成、零污染合成--------->生物有机合成法（酶法和基因工程法）2. 有机合成发展历史（1）1828年Wohler用典型的无机物合成了尿素。
开始了近代有机化学以及有机合成的历史。
（2）1917年，Robinson合成了托品酮。
开创了系统的有机结构理论、合成方法、反应机制和结构鉴定等的研究。
并第一次开设了有机合成课程。
（3）20世纪50年代NMR技术开始应用于有机化合物结构测定。
食品毒理学-第三章2 生物转化 (1)
（2）醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase ALDH）
能将醛类代谢成酸类 具有基因多态性 二硫化四乙基秋兰姆（戒酒硫）是抑
制剂
1
单胺氧化
(3) 单胺氧化酶（ Monoamine oxidase ）
存在于肝、肾、肠、神经组织的线粒体 中；
制作用大于诱导作用。
1
黄素单加氧酶
吡咯烷生物碱类物质、单响尾蛇毒蛋白等 物质经FMO代谢形成叔胺氮氧化物，属于解毒 过程；但经P450形成亲电化合物，属于增毒反 应。 —大鼠具有高活性的P450； —豚鼠则有高活性的FMO；
1
3、醇、醛、酮氧化-还原系统和胺氧化
（1）醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase ADH）： 位于胞浆、分布于肝、肾、肺、胃粘膜 – 能催化醇类转变为醛类，
CH3
H
R-N →R-N +HCHO
CH3 CH3
(5) 氧化基团转移：氧化脱氨、脱硫、脱卤素。
R—CH—NH2→R—C=O+NH3
│
│
CH3
CH3
1
细胞色素P450催化的反应
(6) 酯裂解（cleavage of esters）：羧酸酯、磷酸酯。
R1COOCH2R2→R1COOH+R2CHO
(7) 脱氢（dehydrogenation） O ║
1
还原反应
3 羰基还原 经羰基还原酶和醇脱氢酶作用。 外源性底物：氟哌啶醇、柔红霉素、华 法林、4-硝基苯乙酮等。 内源性底物：前列腺素。
1
还原反应
4 醌还原 NAD(P)H氧化还原酶 双电子还原,形成无毒性的产物。 NADPH-P450还原酶 单电子还原, 形成超氧阴离子等自由基； 百草枯、阿霉素的代谢活化。
脱卤酶的研究及应用
脱卤酶的研究及应用前言：有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一,主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。
在自然界中,大部分异生质卤化物自降解能力很差,同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。
传统的物理方法复杂且容易造成二次污染。
因此，如何应用微生物处理卤代有机物越来越成为研究热点。
1 脱卤酶参与微生物降解的有机卤化途径从1968年Castro等[1]首次发现以2,3-2二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobateriumsp1)菌株至今,人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物。
微生物不同，它们催化断裂碳卤的机制也不同，如以卤代烷烃脱卤酶和卤酸脱卤酶为代表的水解脱卤，还原脱卤通过还原反应脱卤通过水合作用脱卤。
l，3一二氯-2-丙醇、表卤醇和1，2一二溴乙烷等许多重要的环境污染物的生物降解途径中。
1968年Castro首次在以2，3一二溴丙醇作为惟一碳源而生存的黄杆菌(Flavobaterium sp．)菌株中发现了卤醇脱卤酶，这种菌株可以将2，3一二溴丙醇分解为甘油(图1A)[61。
此后，人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物F-O]。
其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)菌株ADl和节杆菌(Arthrobacter sp．)菌株AD2，以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacterium sp．)菌株N一1074等。
研究表明，这几类微生物降解有机卤化物的途径存在明显差异。
例如，在菌株ADl 和AD2的代谢途径中(图lB、D)，都是先生成3一氯一1，2一丙二醇，然后转化成甘油，且都不需要辅因子或氧原子参与脱卤过程。
但对于AD2，前者是个缓慢的化学水解，后一步为卤醇脱卤酶所催化；而对于ADl，由表氯醇到3一氯一1，2一丙二醇快速反应由环氧化物水解酶所催化，相关的基因已被克隆、测序和表达嘲。
保幼激素环氧水解酶基因在
王胜男，张茂森，周 磊，等．保幼激素环氧水解酶基因在 蝽滞育过程中的表达模式及其功能研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（６）：４３－５１．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０６．００６保幼激素环氧水解酶基因在 蝽滞育过程中的表达模式及其功能研究王胜男１，２，张茂森２，周 磊１，井晓宇２，３，张洪志２，李玉艳２，吴惠惠１，张礼生２（１．天津农学院，天津３００３８０；２．中国农业科学院植物保护研究所／农业农村部植物病虫害综合治理全国重点实验室，北京１００１９３；３．吉林农业大学，吉林长春１３０１１８） 摘要：保幼激素（ｊｕｖｅｎｉｌｅｈｏｒｍｏｎｅ，ＪＨ）缺乏是引发昆虫生殖滞育的主要原因，保幼激素环氧水解酶（ＪＨＥＨ）作为ＪＨ的主要降解酶，通过调控ＪＨ滴度水平在昆虫滞育中发挥重要作用。
为研究ＪＨＥＨ在 蝽生殖滞育中的调控功能，克隆获得了 蝽ＪＨＥＨ基因（ＡｃＪＨＥＨ），该基因编码４５２个氨基酸，具有典型环氧水解酶结构特征，无跨膜结构域，存在１个信号肽位点。
同源性及系统进化分析结果表明，ＡｃＪＨＥＨ在不同物种间具有较高保守性，与茶翅蝽（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａｈａｌｙｓ）的ＪＨＥＨ相似性较高，达６５．４６％。
利用ＲＴ－ｑＰＣＲ技术测定了ＡｃＪＨＥＨ在 蝽不同组织及滞育不同时期的表达量，发现ＡｃＪＨＥＨ表达量在滞育诱导期先下降后升高，滞育诱导２０ｄ时表达量最低；滞育初期（诱导４０ｄ）表达量最高，滞育维持期（诱导５０～６０ｄ）的表达量稳定在较高水平，与成虫初羽化时水平接近。
ＡｃＪＨＥＨ在滞育 蝽的头部表达量最高，其次是中后肠和脂肪体，在卵巢中表达量最低。
利用ＲＮＡｉ敲降 蝽初羽化成虫的ＪＨＥＨ基因表达后，雌虫体内的卵黄蛋白原（ｖｉｔｅｌｌｉｏｇｅｎｉｎ，Ｖｇ）基因表达量上升，卵黄沉积明显，推测滞育诱导期高表达的ＪＨＥＨ基因可能通过抑制Ｖｇ基因的表达，抑制卵黄蛋白沉积和卵巢发育，从而促进 蝽的生殖滞育。
环氧水解酶在不对称有机合成中的应用进展
果令人满意 ｌ 虽 然 ｍＥ ３ Ｊ Ｈ已被人们所熟知 ，但 是 由于其来
源较为 困难 ，因而 限制 了 ｍ Ｈ在有机合成 中的应用 ，研究 Ｅ
主要集 中： ｍＥ 生 Ｈ的新陈代 谢 、作用机制等 生物学方 面： 目
白介 素 Ａ Ｈ （ ＡＴ Ｅ ；（ ）胆 固醇 Ｅ ｚ Ｅ Ｌ ４ Ｈ） ４ Ｈ； （ ）Ｈ ｐｘ ｉ ５ ｅｏｉｎ ｌ Ｈ ｄｏ ｓ 目前研 究 报道 较 多的是 从 肝脏 中获 得 的 ｍ Ｈ． ｙ ｒｌ ｅ ａ Ｅ 它是 由一 条分 子量 为 ４ ，５ ０—４ ，５０道 尔 顿 的肽链组 ８ ０ ９ ０ 成 ，其催化反应最适 宜 的 Ｄ Ｈ为 ８ ９ 。ｍ Ｈ中不包含 —９ ５ Ｅ 任何辅基 ．也没 有铁 、铜 、镁 、锰 、锌 等金 属 离子组 成 的
１ 哺乳动物环 氧水解酶 在 目前所 有 已测 试 过 的哺乳 动 物 体 内都 发现 了 Ｅ ｓ Ｈ．
由于它们参 与了哺乳 动物 体内有 害异体 物质 的代谢 ，而引 起人 们的重视 。现 在 已被确定 的有 ５种类 型 的哺 乳动物类 Ｅ ：（ ）可溶性 Ｅ （Ｅ ；（）微粒体 Ｅ （ Ｈ ；（ ） Ｈｓ １ Ｈ ｓ Ｈ） ２ Ｈ ｍＥ ） ３
表２
Ⅺ ）∞ ｓ ／ Ｍ Ｉ ２ ６对 于 取 代 的 直 链 Ｄ Ｏ ｋ Ｂ Ｉ１ Ｃｆ
维普资讯
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武警医学院学报 （ ｃａＡ ａｅ ａ ｄ ｉａ Ｐ Ｐ １１ Ｎ Ａ ｔ ｅｄｍｉ Ｍｅ ｉｎｅＣ Ａ Ｆ １Ｖｏ．１ ０２ ｅ ｃ
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环氧 水解酶在不对称 有机合成 中的应用进展
Ｐｒ 。 ｓｏ ｐ ｘ ｄ ｙ ｏ ａ ｅ ｎ ａ ｙ ｕｎ ｔ ｉ ｒ ａ ｉ ｙ ｈ ｓｓ ｆｅ ｏ ｉ ｅ ｈ ｄｒ ｌ ｓ ｓ ｉ ｓ ｎ ｅ ｒｃ ｏ ｇ ｎ ｃ ｓ ｎｔ ｅ ｉ
理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用
表 １ 酶工程中常用的定向进化方法 Ｔａｂｌｅ １ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
定向进化方法 易错 ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ， ｅｐ－ＰＣＲ） 致突变菌株产生随机突变（ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ） ＤＮＡ 改组（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） ＤＮＡ 同源改组（ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 外显子改组（ｅｘｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 体外随机引发重组（ ｒａｎｄｏｍ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＲＰＲ） 交错延伸（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ＳｔＥＰ） 过渡模板随机嵌合生长（ｒａｎｄｏｍ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｅｍｐｌａｒｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ， ＣＬＥＲＹ） 渐增切割法产生杂和酶（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， ＩＴＣＨＹ） 不依赖序列同源性的蛋白质重组（ｓｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＳＨＩＰＲＥＣ） ＳＣＲＡＴＣＨ 技术 合成改组（ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 简并同质双链重组（ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ＤＨＲ） 短片断上的重组延伸（ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｎ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ， ＲＥＴＴ ） 以寡核苷酸为基础的随机化过程 （ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ＭＡＸ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ） 密码子改组（ｃｏｄｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） 序列饱和突变（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ＳｅＳａＭ） 设计的寡核苷酸的装配（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＡＤＯ） 依赖重组的指数扩增 ＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＲ， ＲＤＡ－ＰＣＲ） 突变和单一方向的装配（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ， ＭＵＲＡ） 不依赖序列的定点装配（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ， ＳＩＳＤＣ ） 以结构为基础的重组蛋白工程（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＳＣＯＰＥ）） 提高交叉的 ＳＣＲＡＴＣＨ 技术（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ＳＣＲＡＴＣＨＹ）
化学生物学第四章 生物转化资料
化学生物学 化学物质在生物体代谢转化的复杂性: • 多数化学物质的代谢转化需经多个连续反应，不同反 应可先后进行； • 同一种化学物质在体内可有多种代谢途径; • 可以在不同的组织器官先后发生不同反应，生成不同 的代谢产物； • 机体与外来化学物质相互作用是在分子水平上进行的； • 化学物质的分子结构可发生下列改变: • 活性功能基团的增减或改变; • 整个分子的降解; • 与某些内源性化学物质结合等。
大连民族学院生命科学学院
Prof. Dr. J.T. Liu
化学生物学 二、还原反应 化学物质在哺乳动物组织内的还原反应，在无氧条 件下易于发生。所需的电子或氢由还原酶 (NADH) 或还 原型辅酶(NADPH)供给。 • 肠道细菌和肠壁细胞的还原酶活性较高，当某些化学 物质进入肠道或化学物质在肝内结合反应后的代谢物随 胆汁排出时，在肠道可被还原。 常见还原反应类型： • 硝基还原 • 偶氮还原 • 还原脱卤
大连民族学院生命科学学院
Prof. Dr. J.T. Liu
化学生物学 4. 氨基酸结合：含羧基(-COOH)化合物，如苯乙酸、苯 甲酸、苯丙烯酸和杂环羧酸等，在酰基辅酶A合成酶 作用下，与乙酰辅酶 A形成酰基酸辅酶 A ，然后在酰 基转移酶作用下与氨基酸(甘氨酸、谷氨酸等)结合。 • 如苯甲酸在体内转化为苯甲酰辅酶A后，与甘氨酸结 合生成马尿酸，易于排出体外。剧毒的氢氰酸也可与 半胱氨酸结合而解毒。
大连民族学院生命科学学院 Prof. Dr. J.T. Liu
化学生物学 结合反应的主要类型
结合类型 糖苷结合 结合基团 UDP-葡糖醛酸 3′-磷酸腺苷-5′-磷 酸 S-腺苷甲硫氨酸 （SAM） 反应底物类型 酚、醇、羧酸、 芳香胺、硫醇 酶定位 微粒体
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微生物环氧化物水解酶引言环氧化物水解酶广泛分布于动物界（包括人类），在肝脏中，环氧化物水解酶主要分布在内质网网上，最近的研究表明，它也分布于肝细胞的核膜、胞浆中，而在环氧化物酶体、溶酶体和线粒体中缺失。
环氧化物水解酶以多种同工酶形式存在，酶的单体相对分子量为48k-54k之间，没有血红蛋白和黄素做辅基。
环氧化物水解酶也可催化内源性和外源性的环氧化物，其中对内源性环氧化物的速率远大于外源性的环氧化物。
因为环氧化物水解酶在致癌物的形成中扮演一定角色，所以被作为肝癌的早期标志二受到广泛关注！环氧化物(epoxide)在多种生物体的代谢过程中广泛存在，又在多种生物活性物质的合成中被广泛应用，它们是一类很有价值的手性有机合成砌块和中间体。
环氧化物具有环氧乙烷三元环，该环中各原子的轨道由于不能在正面充分重叠，而是以弯曲键连接，因而具有较强的张力，其碳氧键具有很强的亲电性，故其能与各种亲核试剂反应，通过选择性开环及官能团转换，就可以很方便地合成很多种光学活性物质，而且它们的反应活性高，其开环反应中通常具有极好的位置选择性和立体选择性。
环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)又称环氧化物水合酶(epoxide hydratase)或环氧化物水化酶(epoxide hydrolase)，能立体选择性地将水分子加到环氧底物上生成相应的手性1,2-二醇。
应用此酶，能够得到具有光学活性的剩余环氧化物和相应的二醇化合物。
该酶在生物体内的外源性化合物代谢中起着重要的作用。
因此，环氧化物水解酶在生物体内，尤其是微生物体内，是普遍存在的。
一、选育对细菌EH的研究最早是在1967年，Schroepfer等人在Pseudomonad(NRRL.2994)中发现了EH，并利用该酶成功催化水解了环氧油酸。
此后奥地利的K.Faber研究小组开辟了对微生物环氧化物的研究。
细菌环氧化物水解酶在自然界中普遍存在，分组成型和诱导型两大类。
前者的底物适用性较广，可以很高的对映体选择性水解各种2取代的环氧化物，例如：1,1-二取代，2,2-二取代和2,3-二取代，但其比活力都不高，但是对于无分支的末端l,2-环氧化物的选择性较低，且对于内消旋环氧化物的活性较低。
后者的底物域相对较窄，是和诱导物结构相似的环氧化物，比活力较高。
对用真菌环氧化物水解酶进行环氧化物的不对称水解反应的研究开始得更早。
始于1972年日本Suzuki等人用Helminthospsrum sativwn对一种萜类环氧化物10,11-环氧法呢醇进行对映体选择性开环。
但是对其真正的研究是在1993年由法国的Furstoss等展开的。
真菌环氧化物水解酶一般是组成型酶，一般可以用廉价的普通碳源进行大规模培养生产。
其底物范围相对较广，对取代脂环族、芳香族和无分支的脂肪族末端l,2-环氧化物具有特别高的立体选择性。
其中真菌中的酵母细胞由于培养简便且易于从发酵液中分离，适合大规模的工业化生产，具有良好的应用潜力。
研究发现，许多丝状真菌的环氧化物水解酶是组成型酶，其底物范围广，对映体选择性高，尤其是对含有芳香基团、取代脂环基的环氧化物的选择性很高，是一种非常具有潜力的工业用生物催化剂。
二、酶学特性1 理化特性(1)温度目前的环氧水解酶基本都是常温酶。
通常情况下酶在室温下是比较稳定的，反应温度较低时，适当提高温度，会加速反应的进行，但继续提高反应温度，会导致酶的失活加剧，并极大地降低酶的对映选择性。
但也有某些酶，对温度比较敏感，在这种情况下，可选择较低的温度，如在4℃进行酶催化水解反应。
(2)pH 环氧化物比较活泼，在酸性条件下容易自发水解，这种化学水解是非选择性的，它将极大地降低酶催化水解产物的对映选择性(ee值)，这极大地限制了环氧水解酶催化反应的pH范围。
此外，过酸性或过碱性的环境也容易引起酶的失活，故环氧水解酶催化的反应，通常都是在中性或偏碱性条件下进行。
(3)助溶剂大部分环氧化物的水溶性很差，添加水互溶性的有机助溶剂可部分地解决这个问题，增强底物的水溶性，消除传质的限制，加速反应的进行。
但助溶剂的添加也会造成酶的失活，且随着助溶剂浓度的提高，其失活效应加强。
助溶剂对反应的影响是上述两个效应共同作用、平衡的结果。
(4)表面活性剂表面活性剂同样可以提高水不溶性物质在水中的分散度。
阴离子表面活性剂会降低酶的活性，同时降低其选择性;两性离子表面活性剂对酶活和选择性有轻微的促进效应;而部分非离子型表面活性剂对酶活和对映选择性有显著的提升作用，尤其是当表面活性剂的浓度远高于临界胶束浓度时，在一定浓度范围内，其对酶活和对映选择性的提升效果随表面活性剂浓度的升高而提高。
此外阳离子表面活性剂对酶有较强的负面影响。
(5)底物浓度当酶催化剂/底物一定时，通常随着底物浓度的升高，酶的对映选择性提高，可用界面激活效应进行解释。
当底物浓度相同时，通常随着催化剂浓度的提高，反应选择性上升。
2催化特性(1)对映体选择性(Enantioselectivity)对映体选择性指环氧水解酶可以选择性地水解底物的某种构型，所筛选的各种酶中，微生物来源的酶普遍优先水解R-构型的环氧化合物，留下S-构型底物，而来源于人体以及几种植物的环氧水解酶则优先水解S-构型环氧化物。
(2)区域选择性(Regioselectivity)对于大多数酷的动力学拆分来说，在反应过程中对映体中心的绝对构型总是保持不变。
但环氧水解酶催化的反应与此不同，环氧化物的酶水解可能通过对环氧乙烷的任一个碳进行攻击而发生，当亲核攻击发生在非取代的碳原子上，产物的绝对构型保持不变;与次相反，当亲核攻击发生在取代的碳原子上，产物的绝对构型发生反转，这种现象也称之为构型逆转。
(3)对映会聚(Enantio convergent)和选择性互补(Selectivity complementary)对映会聚现象是指使消旋的混合物变成单一的对映体的现象。
选择性互补是指两种酶催化同种环氧化物时，一种优先选择R-构型，而另一种优先选择S-构型，则这两种酶是选择性互补酶用两种选择性互补的环氧化合物水解酶共同催化环氧化合物的水解，可以实现对映会聚。
三、催化机制要研究EH催化环氧化物开环反应的作用机制，就应先对EH的结构进行研究。
现在已经有90多种环氧化物水解酶被分离纯化和测序，其中一半以上被确定是蛋白质。
从前面的研究结果分析判断，EH结构中的核心部分．亲核基团和组氨酸残基的位置是基本一致的，不同之处在于羧酸残基的位置。
大多数EH属于a/β折叠型水解酶。
随着实验设备及技术的不断提高改进，根据序列分析、定点突变和X．射线衍射等实验，研究者们发现了EH的微观结构，如图所示。
EH由两个功能域组成：帽子结构和核心结构。
帽子结构由五个螺旋组成，其大小在5.59个残基之间，核心结构从N末端到C末端，是由8个D折叠片组成的区域，其长度在16.57个残基之间，具有一个催化性的三元组合，即：一个亲核性的天冬氨酸残基，一个组氨酸残基和一个传递电荷的天冬氨酸残基。
到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应二醇的反应122刃1。
其催化过程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如黑曲霉EH，如图1．3所示。
催化反应从共价结合的乙二醇．单酯．酶中间体开始。
首先位于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶的一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯．酶中间体，酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。
通过180标记实验，证实环氧化物水解产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。
已报道的一种黑曲霉环氧化物水解酶的催化中心到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应二醇的反应。
其催化过程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如黑曲霉EH，如图所示。
催化反应从共价结合的乙二醇．单酯．酶中间体开始。
首先位于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶的一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯．酶中间体，酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。
通过标记实验，证实环氧化物水解产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。
前面叙述了EH拆分外消旋环氧化物的两种机制，而并没有涉及EH在拆分环氧化物时的位置和立体选择性问题。
EH拆分环氧化物的实质是一个动力学拆16分问题。
可以理解为EH对外消旋体R和S之一的选择性更高，其被水解为二醇的速度就快，二者水解速度的不同而达到分离尺和S的目的。
之间涉及到一个速度差的问题，即动力学拆分，如下所示：S—Lx R—L Y E：魄／昧当昧大于砖时，说明外消旋体中R水解为二醇的速率大于S。
E是对映体比率，表示拆分的效率，其值越大，说明该酶的对映体选择性越强。
在EH动力学拆分外消旋环氧化物，还涉及到一个手性中心构型改变的问题。
根据上述EH的催化机制，环氧化物水解时有两条不同的途径，如下图1．4所示Fig．1-4 The two different hydrolyze approaches of epoxide hydrolaseR(A)被活化的水分子进攻取代较少的手性碳原子时，生成的二醇其手性中心构型保持不变；(B)羟基进攻取代较多的手性碳原子时，产物二醇的手性中心构型发生翻转。
上述两种途径中，羟基都是以反式方式进攻的。
只适用于环氧环中只有一个手性碳原子的情况。
若构成环氧环的两个碳原子都是手性分子，则无论羟基的进攻方式如何，产物二醇中的两个碳原子的构型都将发生翻转。
有报道，使用来自A．nige，．和Beauveria sulfurescens两种立体选择性互补的环氧化物水解酶水解苯乙烯环氧化物，结果得到了ee值大于90％的R型对映体，且实现了得率大于50％[251。
四、应用早期的研究工作主要集中在哺乳动物细胞中的EH,但是由于哺乳动物的酶量少,来源有限,制约了它的实际运用。
随着微生物EH种类的增多,其应用方面的研究也逐渐增多。
许多学者使用高的底物浓度和不同的反应体系来扩大拆分外消旋环氧化物的规模。
Justine Deregnaucourt等使用A. nigerEH拆分三氟甲基取代苯基环氧化物,采用两相反应体系(有机相-水相体积比为1:5),底物-酶的质量比为58,底物浓度为360g/L (1.8mol/L), 4h后ee值可达到99%。