基于结核菌素与CFP10／ESAT6的牛IFN-γ检测法在牛结核病诊断中的比较研究

・１２－　中国奶牛・２ＯＯ８年第６期　基于结核菌素与ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６的牛ＩＦＮ一　检测法在　牛结核病诊断中的比较研究　

陈颖钰－．　，邓铨涛　．一，郭爱珍１，２，晁彦杰　，一，匡有吉　．一，于清龙　．一，陈焕春１，２　（１．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０；２．华中农业大学动物医学院预防　兽医学省重点实验室，武汉４３００７０）　

中图分类号：￥８５５．２文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—４２６４（２００８）０６—００１２—０２　摘要：本研究通过比较三种刺激物（牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６对结核菌素皮　内变态反应阳性牛的ＩＦＮ一＾ｙ刺激反应，探讨ＩＦＮ一＾ｙ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集２２头结核　菌素皮内变态反应阳性牛的血液，肝素抗凝。每ｌｍＬ全血与ｌｍＬＲＰＭＩ　１６４０完全培养基混合均匀，并加入ｏ－１ｍＬ（２０　ｇ１　ＰＨＡ（阳性对照孔）、０．１ｍＬ（２０　ｇ　ＰＨＡ）ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６融合蛋白、０．１ｍＬ（２０００Ｕ）牛结核菌素（ＰＰＤ／Ｂ）、０．１ｍＬ（２５００Ｕ）禽　结核菌素（ＰＰＤ／Ａ）￣等量ＰＢＳ（无刺激阴性对照），３７￣Ｃ３＠养过夜。次日用夹心ＥＬＩＳＡ法检测各刺激组０．１ｍＬ培养上　清的ＩＦＮ－－＾ｙ，以ＯＤ６３ｏ表示ＩＦＮ－，Ｙ浓度。结果，特异性抗原ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６刺激组与牛结核菌素（ＰＰＤ／Ｂ）刺激组的ＩＦＮ一　＾ｙ反应具有良好的相关性．相关系数为０．８４。但ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６刺激组ＩＦＮ一＾ｙ浓度与牛和禽ＰＰＤ的比较反应（以两　刺激组ＩＦＮ一＾ｙ浓度差值表示）间无相关性，相关系数为一０．１ｌ。分析禽ＰＰＤ组的ＩＦＮ一＾ｙ反应，发现实验牛中有少数　牛对禽ＰＰＤ有反应。以ＯＤ￣ｏ＝０．１７为阳性反应切割值，牛ＰＰＤ检出阳性牛２１头，ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６检出２０头．牛和　禽ＰＰＤ比较反应（以ＯＤ值差值表示）检出１４头，禽ＰＰＤ阳性反应３头。扣除禽ＰＰＤ阳性反应牛后．牛和禽ＰＰＤ　比较反应与牛ＰＰＤ刺激组的相关系数增至０．５４。结果表明，牛ＰＰＤ的ＩＦＮ一＾ｙ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛　型结核菌与环境分枝杆菌混合感染时．应用牛和禽ＰＰＤ比较反应检测牛结核的准确度低．混合感染牛被误判为结　核阴性牛。而基于ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６的ＩＦＮ一＾ｙ释放反应不受环境分枝杆菌的影响，检测具有良好的特异性与敏感性。　关键词：牛结核：ＩＦＮ—ｙ；牛结核菌素。ｉＣＦＰ１０：ＥＳＡＴ６；禽结核菌素　

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＰＰＤ　ａｎｄ　ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６　Ｂａｓｅｄ　ＢｏｖｉｎｅⅡ　Ｎ—　Ａｓｓａｙｓ　ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｂ０ｖｉｎｅ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｃｈｅｎ　Ｙｉｎｇｙｕ　。，Ｄｅｎｇ　Ｑｕａｎｔａｏ　。，Ｇｕｏ　Ａｉｚｈｅｎ１２，Ｃｈａｏ　Ｙａ￣ｉｅ’。，Ｋｕａｎｇ　Ｙｏｇｉ１２，Ｙｕ　Ｑｉｎｇｌｏｎｇ１２，Ｃｈｅｎ　Ｈｕａｎｃｈｕｎ　。　（１｜Ｔｈｅ　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０；２．Ｔｈｅ　Ｈｕｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ－Ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｔｅｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ，ａｖｉａｎ　ＰＰＤ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＦＰＩＯｔＥＳＡＴ６　ｉｎ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ￣　ｎｌｅ　ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ　ｆｒｏｍ　２２　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＣＯＷＳ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｔｌｌ　ＰＰＤ　ｓｋｉｎ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｅａｃｈ　ｌｍＬ　ｂｌｏｏｄ　ｉｎ　ｌｍＬ　ＲＰＭＩ　１６４０　ｗａｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．１ｍＬ（：　曲ＰＨＡ（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ１），Ｏ．１ｍＬ￣Ｏ００Ｖ）　ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ＇０．１ｍＩ４＇２５００Ｕ）ａｖｉａｎ　ＰＰＤ，Ｑ１ｍＩ　Ｏ　ＣＦＰＩＯｔＥＳＡＴ￣ｏｒ　ｅｑｕａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ＰＢＳ（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ１）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　ａｔ　３７ｑＣ．　ｎｌｅ　ＩＦＮ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＬＳ＆Ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ａｇｒｅｅｍｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ　ａｎｄ　ＣＦＰ１０　ＳＡ　ｒ６　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｍｃｉｅｎｔ（ｒ）ｏｆ　０．８４．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＩＦＮ－　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅＰＰＤ　ｇｒｏｕｐａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅＩＦＮ—一ｖｒｅｌｅａｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅ　ｄｉｆｒｅｒｅｎｃｅ　ｏｆｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄ　ａｖｉａｎＰＰＤｗｉｔｈ　ｒｖａｌｕｅ　ｏｆ—＿Ｑ２４’Ｓｏｍｅ　ｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ　ｒｅａｃｔｏｒｓ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｄ　ｔｏ　ａｖｉａｎ　ＰＰＤ　ｅｉｔｈｅｒ．　Ｉ＇ａｋｅｎ　ＯＤ￣＝０．１７　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｕｔｏｆｆ　ｖａｌｕｅ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　２１　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｏｒｓ　ｔｏ　ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ．２０　ｔｏ　ＣＦＰ１　ＥＳＡＴ６，ａｎｄ　３　ｔｏ　ａｖｉａｎ　ＰＰＤ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＩＦＮ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｏｎｌｙ　１４　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＣＯＷＳ．Ｉｆｔｈｅ　７　ａｖｉａｎ　ＰＰＤ　ｒｅａｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｌｌ　０Ｄ锄ｏｖｅｒ　０．１　ｗｅｒｅ　ｅｘｃｌｕｄｅｄ，ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＩＦＮ—　ｒｅｌｅａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｏ　０．６９，ａｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＣＦＰＩＯｔＥＳＡＴ６　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　

收稿日期：２００８—０３－０１　基金项目：国家９７３项目（２００６ＣＢＳ０ａ４００）：国家“十一”科技攻关奶业重大　专项（２Ｏｏ６ＢＡＤ（　ＡＯ５；２００６ＢＡＤＯ４ＡＩ２）；武汉市科技攻关课题　（２００６６００２０５６）。　通讯作者：郭爱珍。　

ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＩＦＮ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｏ　０．６１．Ｉｎ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ　ｂａｓｅｄ　ＩＦＮ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｉｓ　ｍｏｓｔ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＩＦＮ－￣　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｌｅａｓｔ．Ｗｈｅｎ　ＣＯＷＳ　ａｒｅ　ｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１３ｏｔｈ　ｂｏｖ／ｓ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＣＯＷＳ　ｗｉｔｈ　Ｍ．ｂｏｖｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｌｉｋｅｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｆａｌｓｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂｙ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ＩＦＮ－－￣ｒｅｌｅａｓｅ．　

维普资讯 http://www.cqvip.com 中国奶牛・２００８年第６期　・１３・　Ｉｎ　ｃｏｎｔｒａｓｔ，ＣＦＰＩＯ／ＥＳＡＴ６　ｂａｓｅｄ　ＩＦＮ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｉｓ　ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｂｏｖｉｎｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＩＦＮ－￣；Ｂｏｖｉｎｅ　ＰＰＤ；ＣＦＰＩＯ；ＥＳＡＴ６；Ａｖｉａｎ　ＰＰＤ　

牛结核病是主要由牛型结核分枝杆菌引起的一种　人兽共患的慢性消耗性传染病．严重威胁着动物和人的　健康　人可通过呼吸空气中的带菌尘埃或饮用带菌牛奶　而感染【”。近年来，我国奶业发展迅速，奶牛养殖规模　不断扩大．牛结核病的流行具有上升与蔓延趋势　国务　院已下达了《关于促进奶业持续健康发展的意见》（国发　￣２００７３３　１号），强调“完善奶牛重大疫病防治和扑杀政策，　将患布氏杆菌病、结核病而强制扑杀的奶牛，列入畜禽　疫病扑杀补贴范围”。然而，牛结核病净化必须依赖快　速、敏感、特异和准确的诊断方法　结核菌素皮内变态反应由结核菌素发明者Ｒｏｂｅｒｔ　Ｋｏｃｈ于１８９０年建立，用于结核病诊断迄今已有１１８年　的历史四．目前仍是各国及国际兽医局（ＯＩＥ）指定的法定　检疫方法。该方法虽然敏感性高，但存在明显缺陷．包括与　环境分枝杆菌存在交叉反应、操作时间长（需３ｄ以上）、劳　动强度大、难以普查、结果决断主观性强等。在牛结核根除　计划中．提高特异性以避免淘汰假阳性牛．及提高敏感性　避免保留假阴性牛都很重要。同时，在我国某些经济发　达地区．避免在判读结核菌素皮内变态反应结果时弄　虚作假骗取政府补偿金的行为也成为牛结核根除计划　实施中的一种社会需求。为此．非常有必要开发新型牛　结核病诊断方法作为牛结核菌素皮内变态反应的辅助或　替代方法。在多种牛结核实验室诊断方法中　，牛　干　扰素（ＩＦＮ　）以其高敏感性与特异性已越来越受到重视　ＯＩＥ推荐使用牛ＰＰＤ与禽ＰＰＤ比较ＩＦＮ一　释放反应作　为牛结核的试验室辅助诊断方法。同时，基于牛型结核菌　特异性抗原ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６的ＩＦＮ　释放检测法也被发　达国家如澳大利亚、新西兰、英国、美国等用于牛结核病的　特异性诊断与监测　虽然国际市场上已有牛ＰＰＤ与禽　ＰＰＤ比较ＩＦＮ一　释放反应试剂盒供应，但价格昂贵。国　内部分学者也开始了本领域的研究嘲．但该方法还需要　在中国牛群中广泛使用，以确定其应用前景。　本研究通过比较ＯＩＥ推荐的牛与禽ＰＰＤ及本实　验室自制的牛型结核菌特异性抗原ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６融合　蛋白三种刺激物对结核菌素皮内变态反应阳性牛外周　血白细胞的ＩＦＮ一　释放反应，探讨ＩＦＮ一　体外释放检　测法在我国牛结核病诊断中的应用前景　１材料和方法　１．１　抗原　牛型与禽型结核菌素分别购自于中国兽医药品监　察所，按产品说明书稀释与使用．牛型与禽型结核菌素　的终浓度分别为２０００Ｕ／０．１ｍＬ与２５００Ｕ／０．１ｍＬ　重组牛　型结核菌特异性分泌性蛋白ＥＳＡＴ６，ＣＦＰ１Ｏ融合蛋白由　本实验室自行制备［６１，使用终浓度为２０￣ｇ／ｍＬ全血　１．２体外刺激培养　抽取全血于肝素抗凝管中　将全血与完全１６４０培养　基１：１混合后分别加入２４孔细胞培养板中，每孔２ｍＬ。向　各孔中分别加入２０１ｘｇ植物血凝素（ＰＨＡ）（阳性刺激对　照）、２０００Ｕ牛型结核菌素、２５００Ｕ禽型结核菌素、２０　ｇ　ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６及等量ＰＢＳ（阴性刺激对照），轻微混合，于　３７ｏＣ、５％ＣＯ　细胞培养箱中培养过夜。次日收集培养上　清液用夹心ＥＬＩＳＡ检测ＩＦＮ一　【５ｌ。ＩＦＮ一　的结果判断　标准为：当ＯＤ阳性对照≥０．５、ＯＤ阳性对照一ＯＤ空白　对照＞１０．５时，检测结果有效。每种刺激物的ＯＤ值为实　际ＯＤ值与空白孔的ＯＤ值差。ＰＰＤ比较ＩＦＮ一　释放反　应定义为牛ＰＰＤ的ＯＤ值与禽ＰＰＤ的ＯＤ值差　１．３统计学分析　对两组不同数据间差异显著性进行ｔ检验．并作线　性回归分析，以证实不同刺激源的ＩＦＮ一　释放反应间　的相互关系　２结果　用不同刺激源分别诱导２２头结核菌素皮内变态　反应检测阳性牛的外周血白细胞，并比较ＩＦＮ一　反应。　以牛ＰＰＤ刺激组的１０倍ＯＤ　加值及ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６　刺激组的１０倍ＯＤ啪值作图，获得线性回归方程为：　Ｙ＝０．９９０４Ｘ一０．０９４，其中Ｘ为ＰＰＤ刺激组的１０倍ＯＤ　加　值，Ｙ为ＣＦＰＩＯ／ＥＳＡＴ６刺激组的１０倍ＯＤ　加值。二组　ＩＦＮ一　释放反应的相关系数（ｒ）为０．８４，表明具有较好的　相关性，数值间无统计学差异（Ｐ＞Ｏ．０５）（图１）。