牛结核病抗体检测试剂盒
QFT-中文说明书20110331
即用大量清水冲洗并迅速就医。 •有害物质：IFN‐γ 标准品及 100 倍浓缩结合剂。如果不慎误食可能会不舒服，或可能造成皮 肤刺痛。请配戴手套及穿着常规实验室防护服。 •处理人血液样本时，应视其为其具有潜在传染性。请遵从处理血液的相关规范。 •硫柳汞作为某些试剂中的防腐剂。误食、吸入、或皮肤接触有可能具有毒性。 •绿色稀释剂含有正常小鼠血清和酪蛋白，可能诱发过敏反应，应避免接触皮肤。 •未遵照本说明书进行测定可能会得到错误结果。请于使用前认真阅读说明书。 •使用前如果发现试剂瓶有任何破损或泄露现象，请勿使用。 •请勿混合或使用来自其它批次的试剂盒。 •应按照当地法规规定处理未使用的试剂及生物样品。 •请勿使用已过期的血液采集管或 ELISA 试剂盒。
注意事项 •仅供体外诊断使用。 •有害物质：酶底物溶液含有 3,3’,5.5’四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine），若摄入、吸入 及接触皮肤会对人体造成危害。对皮肤及眼睛有刺激性。诱变剂。须作为潜在致癌物处理， 使用时需配戴眼罩、手套。 •有害物质：终止液包含H2SO4。摄入、眼睛接触、皮肤接触或吸入会对人体造成危害。使 用时需配戴眼罩、手套并穿着常规实验室防护服。如果终止液不慎接触到皮肤或眼睛，应立
1 瓶 x0.3ml 1 瓶 x100ml 1 瓶x30ml 1 瓶 x15ml
其它所需材料及设备（未提供）
• 37°C培养箱，不需CO2。
• 可调式（10‐1000ųL）移液器及一次性加样枪头。 • 多通道移液（50 ųL、100ųL）及一次性加样枪头。 • 酶标板振荡器。
• 2L 去离子水或蒸馏水
6.操作步骤 第一阶段—血样孵育及血浆收获 已提供的材料 QuantiFERON ＠‐ TB Gold IT采血管（参见 3.型号及规格） 实验必须但未提供的材料 请见 3.型号及规格 步骤 1.如第 5 部分（标本采集及处理）所述，若采血后未能立即进行孵育，则孵育前必须再次立 即混匀采血管。 2.保持采血管直立，于 37°C孵育 16‐24 小时。培养箱不需CO2，也没有湿度要求。
四种副结核病ELISA试剂盒的比对试验及结果分析
一
Ｅ ＩＡ是 现 在测 定 副 结 核 分 枝 杆 ＬＳ 菌血清抗体最为敏感 而特异 的试验方 法【 】 】 目前市 售 的副结 核病 Ｅ Ａ试 剂 ＵＳ 盒 已有 很 多种 ．为检 测 试 剂 盒 的 有效 性 ，我 们对 四种 可 购置 到 的副 结 核 病 Ｅ Ｉ Ａ试 剂 盒 进 行 了 测 试 比对 试 验 ， ＬＳ 现 将测 试情 况 报告 如下 ：
王玉玲 侯 艳梅 （ 津 出入 境 检 验 检 疫局 ３０ ５ ） 天 ０４ ６
摘 要 ： 目前 副结核病 已较广泛 的采 用 Ｅ ＩＡ进行检 测 ， ＬＳ 为保证 实验 室检测 结果的可 靠性 ， 对四种 市售的副 结 核 病 Ｅ ＩＡ试 剂盒进行 了测试 比对试验 。结果表 明 ， ＬＳ 只有一种试 剂盒在 测试项 目中获得 满意结果， 其它三种试剂盒 都 存在 一 定 的 问题 。
关 键 词 ： 结 核 病 ； Ｌ Ｓ 试 剂 盒 副 Ｅ ＩＡ；
四 种 副 结 核 病 Ｅ Ａ试 剂 盒 对 ＵＳ 副 结 核 病 （ａａ ｂｒｕｏｉ ｏｎ 结 核 病补 体结 合试 验 能力 验证 测试 Ｐ ｒ ｕ ｅｃｌ ｓ ｈ ’ ｔ ｓｊ ｓｄ ｅｓ）是 由副 结 核 分 枝 杆 菌 引 起 样 品 ：共 ６份 ，依次编号为 ￥３ ￥ ４ ３ 测 试 样 品 的检 测 结 果 见 表 １ ｉ ａｅ ｓ ２ 、２ ４份 ￥ ８。 ２ ４ 讨 论 与 分 析 的反 刍 兽 的 慢 性 肠 炎 ［ 副 结 核 分 枝 １ 】 ． １ Ｓ ４测 试 血 清 是 来 自 ３ ９ ３３ 杆 菌 主要 引起 牛 （ 其 是 乳 牛 ） 病 ， １１ ２ ０ 尤 发 ． ５ ０ ５年 澳 大 利 亚 Ａ Ｑ Ｐ副 ４１ ｓ 一 １ ． Ｎ Ａ ＬＳ 共 头 进 口澳 大 利亚 种 牛 。 表 １ 的结 果 从 绵羊 、 山羊 、 驼等 动物 也可 发病 闭 结 核病 Ｅ ＩＡ 能 力 验 证 测 试 样 品 ： 骆 ， 为 多 种 动 物共 患 病 本 病 的显 著 特 征 ６份 ， 次 编 号 为 ￥ ９ ￥０ …￥ ４ 看 ．试剂盒 Ａ对 这 １ 依 ２ 、３ … ３。 ４份牛血清 的测 是 顽 固性 腹 泻 和 逐 渐 消 瘦 ． 粘 膜 增 １２ 试 剂盒 肠 ． 试结果为全部阴性 。 阳性率为 ０ 试 剂 ： 盒 Ｂ对 １ ４份 牛 血 清 的测 试 结 果 是 ３ 厚 并 形 成 皱襞 。 １ ． 试 剂 盒 Ａ： 由 国 外 Ａ 公 司 提 ．１ ２ 副结核病广泛分 布于世界各 地 ． 供 。 份 阳性 ， 阳性率为 ００ ％（／３ ３ ： ． ９ ３３ ９ ）试 ．２ ２ 可 般养牛地 区都 可能存在［ 中国于 １ ． 试 剂 盒 Ｂ： 由 国 外 Ｂ公 司 提 剂 盒 Ｃ 的 测 试 结 果 是 ４份 阳 性 ， ３ １ 疑， 阳性 率为 ０１ ％（／ ９ ）试 剂盒 ．２ ４３ ３ ； ３ １５ ９ ３年 首 次 报 道 发现 此 病 病 是 一 供 。 本 ．３ ２ 阳性率为 种不易被人察觉 的慢性传染病 ， 平时 １ ． 试 剂 盒 Ｃ： 由 国 外 Ｃ公 司 提 Ｄ的测试 结果是 ７份 阳性 ． ０２ ％（ ／３ ３ 说 明 试 剂 盒 Ａ 的 阳 ．１ ７３ ９ ） 不会造成 突如其 来的 、 引人 注 目的损 供 。 试 失 ．但 感染 地 区畜群 的死 亡 率可 达 １ ． 试 剂 盒 Ｄ： 由 国 外 Ｄ 公 司 提 性 检 出率 最 低 ． 剂 盒 Ｄ 的 阳性 检 出 ． ２ ４ 率最高 ， 试剂 盒 Ｂ和 Ｃ的 阳性检 出率 ２ １％， 重 时 可 至 ２ ％。 病 很 难 供 。 ％一 ０ 严 ５ 此 居 中。 从 畜 群 中根 除 ． 对 养 牛 业 所 造 成 的 ２ 方 法 其 按 照 四种 试 剂 盒 的 说 明书 操 作 ， ４ Ｓ ５ ￥ １ 试 样 品 为 副 结 核 病 ． ２ １一２ 测 损 失往往超过某 些传染病［ ２ １ 国将 我 ４份 测 试 样 品进 行 副 结 核 分 补 体结 合参 考 阳性血 清不 同稀 释度 其 列为二类动物 疫病［ 进 出 口国在 分 别 对 ３ ４ １ ＬＳ 的样 品 。从 检 测 结 果 看 ， 剂 盒 Ａ 只 试 输 入输 出牛 羊 等反刍 动 物时都 要求 枝杆菌血清抗体 Ｅ ＩＡ检测 。 能 检 测 到 Ｓ ９ １ ３ ） 阳 性 ， ２ １ １ （ ：２ 为 Ｓ ０（ ： ３ 果 检 验 副结 核病 啷
牛羊副结核病的诊断和防控
牛羊副结核病的诊断和防控牛羊副结核病是由副结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病，主要影响牛和羊等反刍动物。
下面将介绍牛羊副结核病的诊断方法和防控措施。
一、诊断方法：1. 体检：牛羊副结核病的患者通常出现消瘦、厌食、低热、乳汁减少以及咳嗽等症状。
体检时要注意观察动物的精神状态、体温异常以及呼吸道症状。
2. 实验室检测：（1）皮内反应：可以用结核菌素进行皮内注射，观察注射部位的皮肤是否出现明显反应，如红肿、硬结等。
（2）牛羊副结核病的血清学检测：可以采用ELISA或PCR等方法，检测血清中是否存在副结核分枝杆菌的抗体或相应的核酸物质。
3. 组织病理学检测：（1）活体检测：通过采集患兽体内组织（如皮肤、淋巴结）进行细菌分离培养，然后进行鉴定，确定是否为副结核菌感染。
（2）尸检检测：对死亡的牛羊进行尸检，检查其内部组织是否存在病变，并进行组织学检测，确定副结核菌的存在。
二、防控措施：1. 隔离观察：对发病的牛羊要进行隔离观察，防止疾病的传播，同时对发病动物要及时进行治疗，避免病情加重。
2. 消毒措施：对牛羊的饮水设备、饲槽、牛棚等环境进行定期彻底的消毒，杀灭病原体，减少传染风险。
3. 疫苗接种：可以使用副结核病活菌疫苗进行牛羊的预防接种，提高动物的免疫力，减少感染。
4. 关注饮食卫生：保证牛羊的饮食卫生，避免给予污染的饲料，同时要消除饲养环境中可能存在的污染源。
5. 定期体检：定期对牛羊进行体检，发现异常情况及时处理，减少疾病的发生和传播。
6. 强制消灭感染动物：对已经确诊的感染牛羊要进行强制消灭，以防止病情扩散和传播给其他健康动物。
7. 加强宣教：通过宣传教育，提高养殖者和兽医的防疫意识，加强对牛羊副结核病的认识和诊断能力，及时发现和防控疾病。
对于牛羊副结核病的诊断，一般可以通过体检、实验室检测和组织病理学检测等方法进行。
而在防控方面，可以通过隔离观察、消毒措施、疫苗接种、饮食卫生、定期体检、强制消灭感染动物以及加强宣教等措施来预防和控制牛羊副结核病的发生和传播。
肉牛副结核病的流行特征及防控方法
肉牛副结核病的流行特征及防控方法肉牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的发病率较低，但是感染率、致死率很高，是危害肉牛养殖的重要疫病之一。
该病潜伏期长、病程时间长、发病率低，并且初期发病不是很明显，诊断不准确、不及时，易误导治疗，导致该病长期潜伏在牛群中。
一旦出现外部及内部诱因，促使带菌牛发病，治愈率非常低。
因此，在肉牛养殖过程中，应对该病开展流行病学、临床特征、实验室诊断、防控方法的分析研究，以提高该病的防控水平，保障肉牛的健康生长。
1 流行病学特征1.1 流行特点病牛或病原携带牛，其分泌物、排泄物被病原污染的饮水、饲料、牛舍的基础设施等都是传染源。
道感染副结核分枝杆菌主要经消化道感染，也可通过子宫感染。
犊牛感染主要是通过母体感染，（1）吸吮病母牛的乳汁，（2）胎盘垂直感染。
该病好发生于春秋季节，但是无明显的季节性特征，发病肉牛与携带病原病牛可向外部环境排出杆菌，污染生活环境中的物品，导致该病散发，甚至引起地方性流行，对肉牛养殖业造成严重的损害。
1.2 病原特性肉牛副结核病别名为副结核性肠炎，病原为副结核分枝杆菌，该菌为放线菌，外形短粗，细长并稍有弯曲，形态一般不典型，长约0.5～1.5 μm，单个排列或是分枝状排列。
此菌无荚膜、无长鞭毛，培养难度大，培养基中无需加入抗酸细菌。
该菌对环境适应性强，在土壤中副结核分枝杆菌可生存1 年，在干燥环境中能存活长达17 个月，可长期在肉牛生存环境中潜伏，具有高的感染概率。
1.3 易感动物该病的易感动物，是牛、羊、骆驼和鹿。
尤以30～60 d 的犊牛易感，感染后长期潜伏在犊牛身体不发病，当犊牛长至3～5 岁时发病。
成年牛感染率较低，但此菌生存能力强，长期存在于肉牛的生活环境中，经由成年肉牛消化道感染，病原潜伏几个月后开始发病。
母牛感染后，在其妊娠、分娩、哺乳等期间好发病。
1.4 发病机理副结核分枝杆菌经消化系统进入肉牛肠道，然后入侵小肠粘膜，由于小肠分泌黏液较多，肠液较少且带有一定的酶，肠道环境适合该菌生存。
牛结核病的诊断方法
89牛结核病的诊断方法和灿兴(云南省丽江市玉龙县畜牧兽医局674100)摘要:牛结核病的病原为结核分枝杆菌,这是一种人畜共患传染病。
牛结核病的分布范围极广,发病率和死亡率也相对较高。
我国的畜牧业不断发展,牛的养殖规模逐渐增大,疫病防控变得更加重要。
本文就牛结核病的诊断方法进行了综述,意在帮助养殖户更好的防控和诊治该疾病。
关键词:牛;结核病;诊断方法结核分枝杆菌共有三个型,分别为牛型结核分枝杆菌、人型结核分枝杆菌以及禽型结核分枝杆菌,其中牛型结核分枝杆菌对牛的感染力最强,牛患结核病时多数是由此种病原导致的[1]。
患病牛只临床表现为低烧、咳嗽,伴有生产繁殖性能降低,如救治不及时则会导致牛只死亡。
人如果饮用了患有结核病牛的牛乳或肉质,则会感染该病。
牛结核病不仅对牛产业发展产生了巨大的影响,也严重危害人类的身体健康。
所以,找到快速、准确的检测方法是控制牛结核病发生、发展的重要手段之一。
1病原学方法患病牛的病变器官、痰液、尿液、粪便、乳汁以及多数分泌物中均有结核分枝杆菌的存在,可以通过无菌方法获得以上病料,做涂片镜检或细菌培养,必要时也可以进行动物接种。
涂片镜检法在这三种方法中是较为便捷且迅速的诊断方法,但是该方法检出阳性率较低,涂片后,在显微镜下观察很难分辨出细菌是活跃状态还是已经死亡[2],所以该方法仅作为诊断的辅助依据。
结核分枝杆菌的细菌培养对外在条件的要求较高,且在体外环境下该细菌生长较为缓慢,需要半个月到一个月的时间菌落才能被看见,这种方法耗时较长,一般不作为诊断方法。
2免疫学方法2.1结核菌素皮内变态反应这种方法是世界卫生组织推荐的用来检测牛结核病的诊断方法,结核菌素皮内变态反应是用牛结核菌素进行皮内接种,利用迟发性变态反应的原理,72~96h 后根据牛接种皮服的肿胀程度,来确定牛是否已经被结核分枝杆菌感染。
这种方法较病原学方法有很大的优势,不仅检出率高,而且耗时较短,但是这种诊断方法也有一定的缺点,就是接种后如果牛的接种部位受到物理性或化学性的刺激时也会表现为肿胀,这种肿胀很难与接种引发的肿胀相鉴别,所以容易产生一定的误差。
浅谈牛结核病的几种实验室诊断方法
方法（ 核酸探针、Ｐ Ｃ Ｒ等） ；免疫学方法有比较皮
一
般 在培 养 ３ ＂ － － ＇ ６ 周 出现 生长物 。通 过 分离培 养
动物结核病 的诊断方面 的报道 。Ｐ Ｃ Ｒ不仅 可 以直 低 下 的动物 也 易产 生假 阴性结 果 。并 且在 ３ ０ ｄ
接检测 样 品、染 色分析 或区分 Ｔ Ｂ复合 物 ，而 且 内，皮 内变态 反应不能重复 ，这 是 由于迟 发型变 广泛应用于起源鉴定 （ 根据菌落形态和 Ａ Ｆ 染色做 态 反 应 具有 滞 后 效应 。另 外 ，Ｐ Ｐ Ｄ的质 量 和 剂
省可用 的牛结核病诊断方法作一展望 。
种条件 限制导致检 出率较低 ，约有 ２ ０ ％代临床诊断需要 。 １ 病原学诊 断方法 １ ． １ 细菌学 方法 细 菌学检 查法主 要包括涂 片 １ ． ２ 分 子生物 学方法 目前 ，检测 结核杆 菌的 分 子 生物 学技术 主要 有 Ｐ Ｃ Ｒ方法 、Ｄ Ｎ Ａ分 析技
内变态 反应 、结核菌素皮 内变 态反应 、Ｉ Ｆ Ｎ 一 测 疑似结核牛代谢物 中的细菌 ，根据其特 征性的菌 定法 、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ等 。本 文将对这几种在 临床上广泛 落和 形 态可 作 出初步 诊 断 ，用 Ｐ Ｃ Ｒ和 分 子分 型
应 用 的牛 结核病 实验室 诊 断方 法逐 一作 简 要介 技 术如 Ｓ ｐ ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ ｔ ｙ ｉ ｎ ｇ 技 术 可进 行 确诊 。但 是 由于 绍 ，并结合辽 宁省牛结核病 防控现状 ，对未来全 结核杆菌生长 比较缓慢 ，耗费时间 ，而且 由于各
牛结核胶体金免疫层析快速诊断方法的建立及初步应用
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
ｂ ｒｕｉ ｓ ｉ ｅｔＴＳ ） ｅｃ ｌ ｋｎｔｓ ， Ｔ 是世 界 动物卫 生 组 织推 荐 ｎ 的牛结 核病 的诊 断方 法 ， 该 方 法存 在 明 显 的不 足 但 之处 ， 即检测时 易受 其他 非 致 病性 的分 支杆 菌 的 干 扰而 出现假 阳性 ； 染后期 的病牛 不敏感 ； 感 易受 人 为 操作 因素 影 响 ； 受 试 牛刺 激 大 等 ］ 对 。此外 ， 牛结 核病 的诊断 还有 细 菌培养 法 、一 扰 素 诊 断法 和 分 ７干 子生 物学检测 ［ 等方法 ， 细菌 培养法 耗 时长 ， 出 ５ 但 检 率低 ， 感 性差 ；－ 扰 素诊 断 法 成 本 高 ， 敏 ７干 收集 的 血样需短 时间 内进行 检 测 ； 子生 物 学检 测 技 术需 分 要 贵重 的仪器 设备 ， 术复杂 ， 技 对实验 室 和操作 人员 的要求较高 ， 这些 诊 断方 法 在牛 结 核 病普 查 中难 以
业 的发 展 ， 且 严 重 的 威 胁 到 食 品 安 全 和 公 共 卫 而 生 ］ 】。消 灭 牛 结 核 的惟 一 方 法 是 通 过 “ 疫 一 扑 杀 ” 检
种检 测结核病 的 间接胶 体 金 免疫 层 析 法 ， 该方 法
具有灵 敏度高 ， 异性好 等优点 。 特
措施淘汰 阳性牛 ， 因此 ， 准确 而及 时的诊 断方 法对该
ｍｇ ｍＬ； ／ 研制 的试纸条 不与牛的 其他疾病 的 阳性血 清反应 ， 具有较 高的特异 性 ； 试 纸条 的最 高栓 出稀释度 该
为 １： ４ ； ６ ０ 试纸 条与 ＴＳ Ｔ的符合 率为 ８ 。该 试纸条具 有敏 感 、 异 、 Ｏ 特 简便 、 速 的特 点 ， 用 于对 牛结核 快 适 病进 行普查 和检 疫 ， 有 良好 的应用前景 。 具
浅析奶牛结核病检测及防控措施
２ １ 病原分离 鉴定 ．
证 明齐全外 ，调 入后要 及时 向 当地 病 牛 的病 灶 、尿 、粪便 、乳及 其他 分泌物样 品 ，作 在 隔离期 问进行 检测 ，检疫 合格后 方可 投入生产 。引进奶 牛
抹片或 集菌 处理后 抹片 ，用抗 酸染 色法染 色镜 检 ，并 进行病 时 ，先就地检疫 ，阴性牛运 回后 ，必须 隔离 观察 ４ 以上 ，且 ５ｄ 原分离培养和动物接种等试验 。 经 牛型结核 分枝杆 菌Ｐ Ｄ皮 内变态 反应试验 检查 阴性者 ，方 Ｐ 可混群饲养 。 ２ ２ 皮 内变 态 反 应试 验 ． 牛 型结核分枝 杆菌Ｐ Ｄ皮 内变态反 应试验 是现今最 常用 ３ ３ 净化环境 Ｐ ． 的试验 方 法 ，对 出生 后２ 日龄 以上 的奶 牛均 可 应用 。 注射 ０ 严 格执行 兽 医防疫制度 ，成年 牛净化 群每年 春秋季 用牛 前 ，先 用卡尺侧量检 查奶牛左侧颈 中部上 １ ／ ３处皮肤 的厚 度并 型结核分枝 杆菌Ｐ Ｄ皮 内变态反应试验各进行 １次监 测。初生 Ｐ 记 录下来 。然后将提纯结 核菌素按规定剂量 （ 月龄 以内的０１ 犊 牛 ，应于２ 日龄时进行 第 １ 监测 ，并按 规定使用 和填 写监 ３ ． ０ 次
菌的灰尘，经呼吸道传染 ，小牛多因消化道感染 ，交配时会 ２ ３ 点 眼 检 查 ．
发 生接触 性传 染 。患子宫 结核 的病牛 ，可使 胎儿在 子宫 内感 该 方法是 以结核 菌素在 相 隔２～７ｄ ，先后 在 同一 眼进 行 染 。在 临床 上多表 现慢性 过程 ，以干咳 、消瘦 、体表淋 巴产 ２次点 眼 。点 眼剂量 为０２～０３ｍ ３～５ ），点 眼后分 别 ． ． ｌ（ 滴 结肿 大 、精 神不振 、被 毛粗糙 无光 、食欲 不振 、产 乳量 下降 于３ 、９及 ２ 各 观察 １次 。阴性 反应 ，眼 睛无 反应或 仅 、６ ４ｈ 等为 主要特 征 。因病原体 侵害 的组织 器官 不 同，病牛表 现不 结 膜轻微 反应 ，流 出少量 透 明浆 液性 分泌物 ；疑似 反应 ，眼 同 的临 床 症 状 。最 常 见 的有 肺 结 核和 肠 结 核 ，伴 有 淋 巴结 结膜无 明显水 肿或 充血 ，仅有 少量灰 白色 、半透 明的粘 液性 核 。患有肺结 核 的病牛初 期症状 不 明 显，有轻度 呼吸 困难 和 分泌 物 积 聚在 结 膜 囊 内 ，或 呈 粗粒 状 挂 在 眼角 外 ；阳性 反 短促 的干 咳 ，午后 或夜 间发低烧 。随着病 情 的发 展 ，食 欲减 应 ，结 膜 明显水肿 、充血 ，流 泪羞 明 ，有 纽带状 粘液或 脓性 退 ，消化功 能紊 乱 ，病 牛逐渐 消瘦 ，贫血 ，产奶 量减 少 ，呼 分 泌物 白眼 角 流 出 ，或 以粒 状 或 线状 存 在 于结 膜 囊 或 眼角 出的气体带 腐臭 味 。重 症时 呼吸似 “ 风箱 ”声 。肠 结核 多 内 。 拉 见 于犊牛 ，病 牛迅速 消瘦 ，常 出现腹痛 和顽 固性腹泻 ，粪 中 ３ 防控措施 混有 粘液 和脓 汁 。生 殖器 官结核 时 ，患 牛生殖 功 能紊 乱 ，流 ３ １ 做 好奶牛登记管理 ，及时组织检测 ． 产 ，阴道 常有黄 白色 絮片或 粘脓 性分 泌物流 出 ，或致 不孕 。 详 细掌握辖 区 内奶 牛 的饲 养范 围及流动 情况 ，对奶牛 进
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BOVIGAM TM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒牛结核病的体外诊断试剂盒，仅限兽医诊断实验室使用一、简介牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种疾病，世界各国均有发生，在奶牛业中具有非常重要的地位。
在一些国家，某些奶牛群的总体发病率接近60-70％。
二、描述BOVIGAM TM是一种牛结核病的体外快速诊断试剂盒，其原理基于血液T淋巴细胞对牛结核分枝杆菌PPD的细胞免疫反应。
结核菌素PPD抗原递呈到全血组织培养物中的淋巴细胞后，感染牛结核分枝杆菌的细胞就能产生IFN-γ，并通过基于单克隆抗体的夹心ELISA检测到。
未感染牛结核分枝杆菌的淋巴细胞不会产生IFN-γ，因此，γ-干扰素的检测与牛结核分枝杆菌感染相关。
BOVIGAM TM在牛结核菌素皮肤试验后使用。
在皮肤试验检测出阴阳性结果后3-30天，可用γ-干扰素试验来确诊。
三、现场研究用澳大利亚、美国、爱尔兰、新西兰、意大利和西班牙的13 000头牛进行田间试验，结果表明BOVIGAM TM在诊断牛结核病时更敏感，甚至能检出早期感染牛。
在USDA/ARS/国家动物疾病中心的家畜细菌病研究中心(美国爱荷华州Ames)，用20头对灭活牛结核分枝杆菌敏感的Hereford食用牛进行了实验室对照研究。
比较了BOVIGAM TM 对美国PPD和辉瑞澳大利亚PPD的反应，表明不管用美国的PPD还是用澳大利亚的PPD刺激，所有牛都表现为阳性。
另外，新西兰的研究表明，试剂盒的特异性不受皮肤试验的影响，在尾根皱襞试验（CFT）后3-30天使用时，本试剂盒比颈部皮肤试验（CCT）更加敏感。
四、试剂盒组成试剂盒储存于2-8℃。
除酶标结合物外，所有试剂在使用前恢复至室温(22° ± 5°C)。
用完后立即放回2-8℃。
1.酶标板（包被γ-干扰素抗体）2块96孔板 10块96孔板30块96孔板可直接使用2.牛γ-干扰素阳性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解3.牛γ-干扰素阴性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解4.绿色稀释液（血浆稀释缓冲液，含0.01%硫柳汞）1×15mL 1×60mL 1×175mL 可直接使用5.20×洗液（含0.01%的硫柳汞）1×100mL 3×125mL 2×500mL 用去离子水或蒸馏水稀释6.100×酶标结合物（HRP标记的抗牛γ-干扰素抗体，含0.01%的硫柳汞）1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解7a.蓝色稀释液（5倍浓缩的酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞）N/A 1×25mL N/A 用去离子水或蒸馏水稀释7b.蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞）1×30mL N/A 2X175mL 可直接使用8.底物缓冲液（含H2O2）1×30mL 1×125mL 2×175mL 可直接使用9.100倍浓缩的显色剂溶液（含溶于DMSO的TMB）1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 用底物缓冲液稀释10.终止液(0.5M H2SO4) 1×15mL 1×75mL 1×175mL 可直接使用五、试剂盒未提供的材料A. 采血1. 肝素锂真空管每头动物1支2. 18号针头－1寸每头动物1支3. 针管每位采血人员2-3支B. 血液培养1. 无菌的5或10mL移液器 每头动物1根2. 无菌的24孔组织培养板每8头动物1块3. 分装用的枪头（5mL）每群动物3支4. 无菌的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.2) 每头动物100µL5. Bovigam牛型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支6. Bovigam禽型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支C. 收获血浆1. 100-1000 µL枪头每头动物3支2. 用于储存血浆的1mL离心管(放在96孔板架上)和盖子每30头动物1个架子D. 牛γ-干扰素酶免疫试验1. 12道移液器吸头每头动物3支2. 各种规格的聚丙烯管、酶免疫试验的试剂反应槽和枪头实验仪器1. 37℃培养箱2. 精密可调移液器（1mL）3. 1mL、5mL、10mL的移液器4. 100mL、1L、2L的量筒5. 6L去离子水或蒸馏水6. 12道移液器（50µL-300µL）7. 微量振荡器（可选）8. 洗板机9. 酶标仪（必须含450nm和620-650nm的滤光片）六、试剂配制1. 抗原Bovigam试剂盒在美国已被批准用于牛结核病的诊断。
本试剂盒使用了特殊制备的禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原，对牛结核病的诊断非常有效。
除非其他抗原获得相关权威机构的批准，美国和加拿大的结核病必须用上述抗原进行诊断。
USDA批准的确认数据就是用Bovigam禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原进行的。
其他抗原在用于官方的诊断目的时必须首先得到确认（在诊断试剂需要强制注册的国家，还必须获得相关权威机构的批准）。
使用前彻底混匀，独立分装（0.3mg/mL），从冰箱拿出后可直接使用。
2. 酶标板允许酶标板在未开封前恢复至室温，可放置30min以上。
3. 阳性对照和阴性对照用1mL（2块板和10块板）或2mL（30块板）去离子水或蒸馏水重新溶解相应的对照样品。
保证完全溶解！溶解的阴阳性对照在3个月内可储存于2-8℃，但再次使用前必须恢复至室温并充分混匀。
4. 绿色稀释液恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。
5. 酶标结合物用0.5mL（2块板）、1.5mL（10块板）或2mL（30块板）的去离子水或蒸馏水重新溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。
保证完全溶解！充分混匀，尽量避免起泡！100倍浓缩的酶标结合物必须一直保存于2-8℃，溶解后的酶标结合物必须在3个月内用完。
注释：酶标结合物起泡过多会变性并降低试验效果。
仅用于10板的BOVIGAM TM试剂盒将5倍浓缩的蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液）恢复至室温并充分混匀。
将1份5倍浓缩的蓝色稀释液和4份去离子水或蒸馏水混匀，配制工作浓度的蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液）。
工作浓度的蓝色稀释液在3个月内可储存于2-8℃，但再次使用前必须恢复至室温并彻底混匀。
仅用于2板和30板的BOVIGAM TM试剂盒蓝色稀释液可直接使用。
按下面的试剂配制表，将适当体积的蓝色稀释液和溶解后的酶标结合物混合，制备酶标结合物工作液。
充分而轻柔地混匀，避免起泡。
酶标结合物工作液必须在配制完后的5分钟内使用，未用完的试剂应立即丢弃。
未用完的100倍浓缩的酶标结合物应立即放回至2-8℃。
表2 试剂配制表（用于稀释酶标结合物和显色剂）酶标板数量浓缩酶标结合物(100×)或显色剂(100×)的体积稀释液(蓝色稀释液或底物缓冲液)的体积1 0.12mL 12mL2 0.24mL 24mL3 0.36mL 36mL4 0.48mL 48mL5 0.60mL 60mL6 0.72mL 72mL7 0.84mL 84mL8 0.96mL 96mL9 1.08mL 108mL10 1.20mL 120mL20 2.0mL 200mL30 3.0mL 300mL6. 洗液配制工作浓度的洗液，将19份去离子水或蒸馏水加入1份20倍浓缩的洗液中，充分混匀。
工作浓度的洗液可在室温贮存2周，未用完的20×浓缩洗液应放回至2-8℃。
注释：20倍浓缩的洗液可能含有结晶盐。
37℃重新溶解结晶。
稀释前充分混匀。
7. 底物溶液将底物缓冲液和100倍浓缩的显色剂溶液恢复至室温，稀释前充分混匀。
按照试剂配制表，将适当体积的浓缩显色剂溶液和底物溶液混合，使用前配制。
底物溶液必须充分混匀且应当是无色的，如出现蓝色应丢弃。
在配制完后的10min内使用。
注释：如有可能，用灭菌的一次性聚丙烯塑料容器配制底物溶液。
不要使用聚苯乙烯容器或移液管。
盛底物的玻璃器具必须用1N H2SO4或HCl彻底清洗，然后用去离子水或蒸馏水冲洗3遍以上，保证没有酸的残留。
8. 试剂的安全处理所有废弃或剩余的试剂应根据州和地方的要求进行处理。
七、操作注意事项1. 除100倍浓缩的结合物外，所有待测血浆和试剂在使用前必须恢复至室温 (22℃+5℃)。
解冻的样品需小心涡旋，充分混和。
加热的温度不要超过37℃。
注释：一整瓶试剂恢复至室温需要几个小时。
用室温水浴箱可缩短平衡时间。
2. 试剂盒内所有成分都储存于2-8℃，使用完后马上放回2-8℃。
工作浓度的洗液在两周内可放于室温(22℃+5℃)。
3. 100倍浓缩的结合物必须一直放于2-8℃，即使在重新溶解时也是这样。
4. 为保证试验效果，必须使冻干试剂完全溶解。
溶解后的试剂至少需放置15分钟，然后轻柔颠倒混合4-5次；也可以使用滚动振荡装置混合。
使用前再次混匀。
注释：必须用高质量的去离子水或蒸馏水来溶解或稀释试剂，因为实验用水中常见的污广州市瑞品生物技术有限公司 广州市瑞品生物技术有限公司 染物易使辣根过氧化物酶失去活性。
5. 试验开始后不要中途间断。
6. 每份样品换一个一次性吸头，避免交叉污染。
7. 用12道移液器加样，保证待测血浆同时加入各孔中。
8. 酶标板应放在倒置的试管架或相似装置上进行孵育，使孔间误差降至最低。
9. 从酶标板第1列顶端开始，每份待检血浆在邻近孔（比如A行和B行）中做双份重复。
10. 牛γ-干扰素阳性和阴性对照在第4、5、6列的连续孔（如F行用于阳性对照，E行用于阴性对照）中做3份重复。
按照上面的建议，每块酶标板可双份重复检测15头动物的45份待测血浆。
八、检测步骤第一阶段—全血培养步骤：1. 采血采集单次皮内试验阳性牛3-30天内的血液。
将采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝的血液收集管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。
在室温（22±5℃，避免温度过高或过低）下运送到实验室并在采血后的30个小时内进行培养。
在任何情况下都不应该将血液贮存在冰箱中。
2. 血液分装分装前血液样品必须均匀混合。
在即将分装前，可用滚筒-振荡器混匀或轻轻颠倒试管10min。
注释：由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。
将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血（见表3）。