PCR有关技术
简述PCR技术的主要原理及应用
简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。
PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。
PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。
- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。
- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。
- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。
1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。
每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。
2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。
3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。
1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。
经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。
2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。
通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。
2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。
2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。
2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。
三种PCR技术
《反义PCR在肿瘤检测中的应用》 肿瘤患者总是存在转移灶而加速病情的恶化， 转移灶的检测对肿瘤患者的诊断分期、治疗、复发、 预后判断、术后综合治疗的选择都有极大的意义。 反义PCR是是近年来发展的一种在亚显微水平检 测隐匿性肿瘤转移的方法,具有高特异性、高敏感性、 操作简便的特点。 在临床检测中，从早期的IE染色到现在常用的免 疫组织化染色，都存在低估转移数目的局限性，如： 免疫组织化方法可以从2xl05个骨髓细胞中检 出1个McF-7细胞。而反义PCR法可从106个淋巴细胞中 检出1个McF--7细胞。 此外，反义PCR采用mRNA为标志物,反义PCR法 有效地解决了从多个正常等位基因中分离突变基因的 问题。
易错PCR存在的问题 碱基的变异具有倾向性：种碱基比例不平衡的情 况下，A.T--CG的变异比率通常高于CG--AT,的变 异比率 易错 PCR 产量和变异水平偏低 模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段 解决方法 寻找新的影响酶功能、同时又不带来碱基变异偏 好的因素，开发更多的易错 PCR方法 易错 PCR多种诱变条件的简化 《定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力 》
《反向PCR法扩增花粉特异表达基因PSG076启动子》 在植物的有性生殖过程中，花粉的正常发育受阻 将会产生雄性不育，这是杂种优势利用中的关键材料。 因此可利用花粉特异性启动子驱动破坏花粉生长的基 因表达，促使花粉败育，从而获得雄性不育转基因材 料。 PSG076是小麦花粉特异性表达基因，本研究对其 上游启动子序列进行分离，并选择了已知序列上有切 点的酶进行切割，获得了1.4Kb的上游启动子序列。
RNA提取：Trizol试剂方法提总RNA EV71和Cox.A16的鉴别诊断 RT-PCR
PCR技术
PCR1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase C hain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在D NA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR技术的原理及其应用
3
生物制药质量控制
PCR技术可用于生物制药过程中的质量控制，如 检测产品中特定基因序列的存在和表达情况。
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PCR技术挑战与发展 趋势
灵敏度、特异性及通量提升
灵敏度提升
通过优化反应体系、提高引物设计和使用高效的DNA聚合 酶等手段，可以降低PCR检测的限度，提高灵敏度。
特异性增强
采用更严格的引物设计、使用热启动PCR、增加退火温度 等方法可以减少非特异性扩增，提高PCR的特异性。
应用
实时荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、SNP分型等领域，具有灵敏度高、特异性 强、可定量等优点。
逆转录PCR
原理
逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA逆转录成cDNA，再进行PCR扩增的方法。该技术结合了RNA提取、逆转 录和PCR扩增三个步骤，可用于检测细胞中特定基因的表达情况。
DNA复制特点
DNA复制具有半保留复制、边解旋边复制以及需要引物等特 点。
引物设计与合成
引物设计原则
引物是PCR扩增的关键因素之一 ，设计时需要遵循一定的原则， 如长度适中、GC含量合理、避免 引物二聚体形成等。
引物合成方法
引物可以通过化学合成或生物合 成的方法获得，其中化学合成方 法更为常用，包括固相亚磷酰胺 法和液相合成法。
应用
逆转录PCR广泛应用于基因表达分析、病毒检测、RNA编辑等领域。通过比较不同样本或不同处理条件下的基因 表达差异，可以揭示生物学过程中的调控机制。
其他PCR变种技术
要点一
原理
除了上述常规PCR技术外，还有许多其他PCR变种技术， 如多重PCR、不对称PCR、热启动PCR等。这些技术通过 改进PCR反应条件或引入新的策略，提高了PCR的特异性 、灵敏度和通用性。
pcr三个步骤(pcr技术三大步骤)
pcr三个步骤（pcr技术三大步骤）本文介绍了PCR的详细操作流程，强调了实验中的注意事项，列举了常用缓冲液的配方。
帮助我们在理解实验的基础上更顺利的操作。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶（热启动酶）。
典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。
1.DNA模板2.特异性引物3.dNTP Mix4.PCR buffer5.热启动酶1.配置反应体系将各成分依次加入到0.5ml的离心管中扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。
2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定3.琼脂糖核酸电泳·将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子·根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）·在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中·室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样·在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡·样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔·按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳·电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小不同的琼脂糖浓度分离不同大小的DNA片段：引物引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：1.引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物的长度：15-28bp，长度大于38bp，会使退火温度升高，不利于普通Taq酶的扩增3.引物GC含量在40%-60%，Tm值最好接近72℃4.因密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好为T）5.碱基分布错落有致，3’端不超过3个连续G或C6.引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要BLAST验证模板PCR扩增对模板的要求不高，单链、双链DNA均可作为扩增片段，虽然PCR能够扩增微量的DNA，为了保证扩增的特异性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：模板可以是纯化后的样品也可以是粗制品，不同来源的模板采取不同的处理方法，实验模板的纯化越简单越好，但模板中如果含有任何的Taq酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等，会干扰反应。
PCR技术有哪些应用价值,请举例加以说明
PCR技术有哪些应用价值，请举例加以说明PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种重要的分子生物学技术，由美国科学家凯瑟琳·穆勒（Kary Mullis）于1983年发明。
PCR技术的核心是通过DNA聚合酶酶链反应的方式，在体外快速复制目标DNA片段，并进行分析和研究。
PCR技术被广泛应用于各个领域，具有重要的应用价值。
1. 医学诊断PCR技术在医学诊断中起着至关重要的作用。
通过PCR技术，可以迅速检测到微量的病原体DNA，从而实现对传染性疾病的早期诊断和治疗。
例如，在传染性疾病的流行期间，可以使用PCR技术对患者进行病原体的快速检测，如乙型流感病毒、新型冠状病毒等。
此外，PCR技术还可以检测遗传性疾病的突变基因，帮助医生进行基因诊断和治疗。
2. 法医学PCR技术在法医学中也有重要的应用价值。
通过PCR技术，可以从犯罪现场提取到微量的DNA样本，进行DNA指纹的分析比对。
这对于犯罪嫌疑人的识别、刑事案件的调查和破案起着至关重要的作用。
PCR技术的高灵敏度和高特异性使得法医学科学家能够从极其微量的DNA样本中找到关键信息，并帮助解决复杂的刑事案件。
3. 基因工程PCR技术是基因工程中的基础技术之一。
通过PCR技术，可以迅速获取所需基因片段，并进行进一步的基因克隆、基因表达和蛋白质表达等研究。
PCR技术在基因工程领域的应用非常广泛，如将特定基因片段插入目的表达载体中、构建基因突变、提高目的基因的表达量等。
PCR技术的快速、准确和高效使得基因工程的研究变得更加容易和可行。
4. 生物学研究PCR技术在生物学研究中也发挥着重要的作用。
通过PCR技术，可以快速扩增并检测感兴趣的基因或DNA片段，从而深入研究生物体的基因组结构和功能。
PCR技术广泛应用于基因表达研究、突变检测、种群遗传学分析、系统进化研究等领域。
例如，通过PCR技术可以检测特定基因的表达水平，分析基因调控机制；可以从环境样本中扩增目标DNA，研究物种多样性和环境功能。
pcr技术的原理及应用
PCR技术的原理及应用1. PCR技术概述PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种基因工程技术，用于在体外扩增DNA片段。
它是由美国生物化学家Kary B. Mullis于1983年发明的，已经成为现代分子生物学和生物医学研究中最基础和最重要的技术之一。
PCR技术的原理是通过逐渐增加DNA双链的方法，在体外扩增某一特定DNA片段，使之达到可以测定和分析的水平。
PCR技术的基本原理包括DNA的变性、引物的结合和DNA合成。
2. PCR技术的步骤PCR技术通常包括以下三个主要步骤：2.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，DNA样本被加热至高温（通常是94-98℃），使DNA双链变性，即将两个DNA链分离成两条单链。
2.2 引物结合（Annealing）PCR反应温度下降时，引物与目标DNA片段中的互补序列结合。
引物是短的DNA片段，以逆向互补的方式与目标DNA序列的两端配对。
引物的选择是PCR反应成功的关键，需要根据目标序列的特性进行设计。
2.3 DNA合成（Extension）在PCR反应过程中，酶（通常是热稳定的DNA聚合酶）通过引物作为起始点，沿着DNA模板合成新的DNA链。
该过程通常在高温下进行，使酶能够稳定在DNA链上进行复制。
每个PCR循环会产生两条新的DNA链，其中一条是目标序列的补充链。
3. PCR技术的应用PCR技术广泛应用于各个领域，包括基因检测、遗传学研究、医学诊断和法医学等。
3.1 基因检测PCR技术可以用于检测和鉴定各种基因突变、插入、缺失等基因变异。
通过PCR技术可以扩增出需要检测的基因片段，并可以通过其他技术（如DNA测序）对扩增产物进行分析和验证。
3.2 遗传学研究PCR技术在遗传学研究中起着重要的作用，可以用于DNA指纹鉴定、基因组重组、基因表达调控研究、基因治疗等方面。
例如，PCR技术被广泛应用于DNA 指纹鉴定，通过对DNA样本进行PCR扩增和电泳分析，可以确定个体之间的遗传关系。
高中生物选修三pcr技术
高中生物选修三pcr技术
PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它可以扩增DNA片段。
以下是高中生物选修三PCR技术相关的内容：
1. PCR反应原理：PCR反应利用DNA聚合酶对DNA序列进行复制和扩增。
主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
2. PCR反应体系：PCR反应需要的试剂包括DNA模板，引物（前向引物和反向引物），Taq DNA聚合酶，dNTPs和缓冲液等。
3. PCR反应步骤：
（1）变性：将DNA模板加热至95℃，使其解旋成两条单链。
（2）退火：降温至引物的退火温度，使引物与模板互补结合。
（3）延伸：加入Taq DNA聚合酶和dNTPs，开始扩增DNA片段。
4. PCR应用：PCR技术可以用于基因克隆、基因表达分析、基因诊断等领域，例如DNA指纹鉴定、疾病基因检测等。
5. PCR优化：PCR反应条件对扩增效率有很大影响，需要根据实验目的和样品特点进行优化，如引物设计、反应体积、温度梯度等。
希望这些信息对你有所帮助。
如有任何疑问，请随时询问。
重组pcr技术原理
重组pcr技术原理重组PCR技术是一种基因工程技术，它可以在不依赖于生物体的基因组或cDNA库的情况下，快速、高效地构建出目标DNA分子。
下面我将为大家详细介绍重组PCR技术的原理。
一、引物设计引物是重组PCR技术中最关键的部分。
引物需要与目标序列两端互补，并且具有一定长度（通常为20-30个碱基）和特定的序列。
在引物设计时，需要考虑到以下几个方面：1. 引物长度：引物应该足够长，以确保其与目标序列的互补部分结合牢固，并且不容易发生错配。
2. 引物温度：引物应该具有合适的熔解温度（Tm），以确保其在PCR 反应中能够稳定地结合到模板上。
3. 引物特异性：引物应该具有足够的特异性，以避免与非目标序列发生交叉杂交。
二、扩增反应重组PCR技术是一种多步扩增反应。
首先，在PCR反应中加入两个互补的外部引物，这些引物可以扩增出目标DNA分子两端的序列。
然后，在第一轮PCR反应后，将扩增产物与目标DNA分子的另一端序列互补的内部引物一起加入PCR反应体系中，进行第二轮PCR反应。
这样就可以扩增出完整的目标DNA分子。
在PCR反应中，需要考虑到以下几个方面：1. 反应条件：PCR反应需要在合适的温度、离子强度和pH值下进行，以确保引物和酶能够正常工作。
2. 酶选择：在PCR反应中使用合适的酶可以加速扩增过程，并提高扩增产物的质量。
3. PCR产物纯化：为了避免杂交和非特异性扩增，需要对PCR产物进行纯化处理。
三、连接反应连接反应是重组PCR技术中最后一个步骤。
在连接反应中，需要将两个不同的DNA分子连接成一个完整的DNA分子。
这个过程通常使用DNA连接酶来完成。
在连接反应中，需要考虑到以下几个方面：1. 连接条件：连接反应需要在合适的温度、离子强度和pH值下进行，以确保DNA连接酶能够正常工作。
2. 连接效率：为了获得高效率的连接过程，需要选择合适的DNA连接酶，并优化反应条件。
3. 连接产物纯化：为了避免杂交和非特异性连接，需要对连接产物进行纯化处理。
pcr技术的基本原理及其应用
PCR技术的基本原理及其应用1. PCR技术简介PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外扩增特定DNA序列。
PCR技术的出现革命性地改变了分子生物学研究的方式，广泛应用于基因测序、遗传变异检测、疾病诊断、法医学等领域。
PCR技术的核心原理是通过模板DNA、特异性引物和DNA聚合酶进行多轮循环扩增，产生大量目标DNA。
2. PCR技术的基本步骤PCR技术主要包括以下几个步骤：2.1 反应液的配制PCR反应液的主要组成包括模板DNA、引物、dNTPs（四个脱氧核苷酸），缓冲液和DNA聚合酶。
反应液的配制需要严格控制成分的比例和浓度，以保证反应的准确性和高效性。
2.2 热循环条件的设定PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
通过不同温度的变化来控制这三个步骤，就可以实现DNA的扩增。
一般的PCR反应条件为：98°C变性5分钟，然后循环30-40次以下三步骤：变性95°C 30秒，退火55-65°C 30秒，延伸72°C 1分钟，最后72°C延伸10分钟。
2.3 扩增产物的检测PCR反应结束后，通过电泳检测扩增产物。
利用电泳技术，可以将扩增产物按照大小分离，从而确认特定DNA序列是否被扩增成功。
3. PCR技术的应用PCR技术在各个领域都有广泛的应用，以下是几个主要的应用方向：3.1 基因测序PCR技术被广泛应用于基因测序中，可以对目标DNA片段进行扩增，为后续测序提供充足的模板。
同时，PCR反应也可以用于检测测序结果的准确性。
3.2 遗传变异检测PCR技术可以对基因的变异进行检测。
通过引物的设计，可以扩增出特定基因片段，然后通过电泳检测，确认是否存在特定的遗传变异。
3.3 疾病诊断PCR技术在疾病诊断中有着广泛的应用。
通过检测某些特定基因的变异，可以帮助医生对遗传性疾病进行准确的诊断和预测。
3.4 法医学应用PCR技术在法医学中常被用于DNA鉴定。
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PCR技术 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为扩增效率, n为循环次数。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
PCR反应体系与反应条件 PCR反应体系试剂： 1、反应缓冲体系：提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于 6.8~7.8之间。一般体系为：500mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl。Tris-HCl用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCL有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl对Taq DNA聚合酶有抵制作用。 2、 Mg2 : 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影响反应的特异性和产率。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。由于 PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度。Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的，故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性。通常Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2－2.5mmol/L。对于一种新的PCR反应, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。 3、 Taq酶保护剂：一般用乙酰化的BSA（小牛血清白蛋白100μg/ml），起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性及保护作用。或者改为 5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)。另外加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利。保护剂还有明胶(0.01%)和Tween- 20(0.05%~0.1%)。 4、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，小量分装， -20℃冰冻保存。经过两次冷冻-加热循环，会使dNTP降解，储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。在PCR反应中，dNTP应为20～200μmol/L。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低，降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。DNTP会络合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制Taq DNA聚合酶活性.理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. 5、 Taq酶： Taq聚合酶相对分子质量为94000，其最适pH值为8.3～8.5，酶活性较高大约为200000Umg，Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是72℃，转换数Kcat接近150nt，这种活性有明显的温度依赖性。目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，但保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。通过遗传工程，已获得了高保真度的Taq聚合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。另一种为大肠菌合成的基因工程酶。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。TaqDNA聚合酶虽然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定，保持着催化DNA合成的能力。有人试验证明在 92.5℃,95℃,和97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95℃（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80℃时，dNTP的掺入速度为35-100nt,最长延伸长度 7.6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70℃的延伸率高于60nt, 在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0.25和1.5 nt。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90℃以上）时，很少能合成DNA。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80℃，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5～5个单位/100μl，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 6、模板：PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，需先经过逆转录生成cDNA然后才能进行PCR反应。含有目标靶序列的模板 DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好). 由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般不要求很高，某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在如：蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；二价金属离子的络合剂（如EDTA）等；会与Mg2+络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。 7、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，但浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算： EM=A(16000)+G(12000)+C(7000)+T(9600) 8、 PCR促进剂： 据报道通过向 PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。