野牛草种子蛋白质组双向电泳样品制备方法的分析比较
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
以甘蓝型油菜"扬油6号"的叶片为试验材料,分别采用传统的TCA/Acetone(三氯乙酸/丙酮沉淀法)和改进的PEG(polyethylene glycol)分步提取法提取叶片可溶性总蛋白,并利用条件一致的蛋白质双向电泳体系进行比较.TCA/Acetone法提取的蛋白质双向电泳图谱背景中由于高丰度"housekeeping"结构蛋白的存在,特别是叶片中参与光合作用的Rubisco蛋白的干扰,图谱中低丰度调控蛋白受到了高度覆盖和遮蔽现象,影响双向电泳图谱的质量.而PEG分步提取法提取的蛋白质样品,可以剔除Rubisco蛋白,使获得的双向电泳图谱清晰,无斑点间的遮蔽现象,为油菜叶片蛋白质组定量和定性分析提供了丰富的信息.
作者：孔芳蒋金金吴磊葛才林王幼平作者单位：扬州大学生物科学与技术学院,扬州,225009 刊名：生物技术通报PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2010 ""(5) 分类号：关键词：油菜叶片总蛋白双向电泳图谱。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
蛋白样品制备
双向电泳之样品的制备2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。
目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。
当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。
通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。
在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。
样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。
脂类和多糖都可以通过超速离心除去。
透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
蛋白质电泳
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12%胶常用的低分子量标准蛋白
名称 磷酸化酶B 牛血清白蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 溶菌酶
原理
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Ø 蛋白质分子在溶液中由于其末端氨基、末端 羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒，并 可在电场内移动，其移动方向取决于蛋白质 分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨 基酸组成及所在溶液的pH值，携带的静电荷 不尽相同，致使它们在电场中的迁移率各 异，从而达到分理的目的。
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2DE仪器系统
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恒温水浴 垂直板电泳 仪（第二 向）
电源
等电聚焦仪 （第一向）
凝胶浓度和蛋白质分离范围
凝胶种类 分离胶浓度 浓缩胶浓度 交联度 （％T） （％T） （C%）
Tris-glycine 7.5
4
2.6
gels
10
4
2.6
12
4
2.6
15
4
2.6
4－15
－
2.6
4－20
－
2.6
10－20
4
2.6
Tris-tricine 16.5
4
3.3
gels
16
10
3
10-20
4
来源 兔肌肉 牛 鸡蛋清 牛 大豆 鸡蛋清
分子量 97400 66200 45000 31000 21500 14400
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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实验报告蛋白质电泳分析
实验报告蛋白质电泳分析实验报告：蛋白质电泳分析一、实验目的本次实验旨在通过蛋白质电泳技术，对不同样品中的蛋白质进行分离和分析，以了解蛋白质的分子量、纯度和组成等特性，为进一步的研究和应用提供基础数据。
二、实验原理蛋白质电泳是根据蛋白质在电场中的迁移率差异来分离蛋白质的一种技术。
在电场的作用下，带电荷的蛋白质分子会向与其电荷相反的电极方向移动。
迁移率的大小取决于蛋白质的分子量、电荷数量和形状等因素。
常用的蛋白质电泳方法有 SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和 NativePAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）。
SDSPAGE 中，蛋白质与 SDS（十二烷基硫酸钠）结合形成带负电荷的复合物，消除了蛋白质分子原有的电荷和形状差异，仅根据分子量的大小进行分离。
NativePAGE 则在非变性条件下进行，保持了蛋白质的天然构象和电荷状态，可用于研究蛋白质的活性和相互作用。
三、实验材料与设备（一）材料1、样品：待分析的蛋白质样品，如血清、细胞裂解液等。
2、标准蛋白：已知分子量的蛋白质标准品。
3、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺：用于制备凝胶。
4、 SDS（十二烷基硫酸钠）。
5、 Tris（三羟甲基氨基甲烷）。
6、过硫酸铵和 TEMED（四甲基乙二胺）：引发丙烯酰胺聚合。
7、电泳缓冲液：Tris甘氨酸缓冲液。
8、染色液：考马斯亮蓝 R-250 染色液。
9、脱色液：甲醇乙酸溶液。
（二）设备1、电泳仪：提供稳定的电场。
2、垂直电泳槽：用于容纳凝胶和进行电泳。
3、移液器和吸头。
4、离心管和离心机。
5、恒温水浴锅。
6、微波炉。
7、凝胶成像系统：用于观察和记录电泳结果。
四、实验步骤（一）制胶1、装配电泳槽：将玻璃板洗净、晾干，安装在电泳槽中，并确保密封良好，无渗漏。
2、制备分离胶：根据所需的浓度，将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TrisHCl 缓冲液、过硫酸铵和 TEMED 按比例混合，迅速摇匀后注入玻璃板之间，留出灌注浓缩胶的空间，然后用蒸馏水覆盖。
几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较作者：秦慧，刘霆，柳斌，宋鑫，黄欣，杨金亮，赵霞，魏于全【摘要】本研究对蛋白质染色法进行比较和分析，以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法。
实验采用2-D电泳分离急性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标准物，从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度，比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影响，探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素。
结果显示，银染检测灵敏度最高，但质谱鉴定相容性差，鉴定率近10%；改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也高，可达4 ng/spot，质谱鉴定率可接近55%。
结论：改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高，与质谱兼容好，能满足蛋白质组研究需要。
【关键词】蛋白质组Abstract The aim of this study was to compare and analyze protein staining in order to select the optimal staining method for proteomic research. Proteins from acute promyelocyticleukemia cell line NB4 and protein molecular weight marker were separated respectively by 2-D or 1-D electrophoresis and detected respectively by the typical Coomassie brilliant blue，the colloidal Coomassie brilliant blue，the modified Coomassie brilliant blue and the silver staining protocols. The protein detection sensitivity，compatibility with mass spectrometry (MS) and facility of the four staining protocols were compared. The results indicated that the silver staining exhibited the highest sensitivity and MS showed the lowest compatibility 10% of protein identification rate. The detection sensitivity of the modified Coomassie brilliant blue staining was superior to that of other two Coomassie brilliant blue stainings，close to but lower than the silver staining，however the compatibility with MS was better （protein identification rate about 55%）. It is concluded that the protein detection sensitivity of the modified Coomassie brilliant blue staining is high，and its compatibility with MS is better，this modified Coomassie brilliant blue staining is an optimal staining method for proteomic research.Key words proteomics；two-dimensional gel electrophoresis；protein detection；Coomassie brilliant blue staining；silver staining蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1） 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
D：剩余样本。
说明：
1.样品制备指可用通常程序处理的原样，如样品较特殊（需要去除核酸、盐等杂质或需要浓缩），价格将视进一步处理的难度和耗材用量另行商定；
2.建议客户提供的原样（组织、细胞、菌体等）湿重不少于100mg,如直接提供蛋白提取物，则浓度不少于4ug/ul，总量不少于5mg;
一、蛋白质组学双向电泳技术服务项目：
1.根据客户需求定制蛋白质组学实验方案
2.各种规格胶条长度的双向电泳
3.考麻斯亮蓝染色、银离子染色；
4.DIGE系统双向电泳。
5.图像分析
6.切胶质谱分析
二、说明
1.蛋白质组学实验的总体实验流程；
双向电泳结果提交
A：实验的试剂耗材、仪器设备、操作过程一份；
B:实验结果凝胶扫描图片；
(4)从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
(5)由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。
(6)将分离到的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
测序实验流程：
实验设备
双向电泳是目前为止最有效、使用最多的蛋白分离方法。差异蛋白质组学是在双向电泳后用考麻斯亮蓝、银离子或荧光染料等将蛋白斑点染色，然后比较差异。本公司在各类微生物、培养细胞、动植物组织（如动物软硬组织、体液、植物种子、叶子等）、亚细胞组分在各类微生物培养细胞动植物组织如动物软硬组织体液植物种子叶子等亚细胞组分的双向电泳分离及后续质谱鉴定中均有丰富的经验
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
实验技术简介：双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。[晶莱生物]
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中图分类号 Ｓ１８ ８ 文献 标识码 Ａ 文章编号 ０ １ ６ １２Ｏ ）３—０９２ ３ ５７—６ １（Ｏ９ １ ５８ —０
Ｂｕ ａｏ Ｇｒ ｓ ｅｄ ｆ ｌ ａ ｓＳ ｅ ｓ
Ｃｍｎｍｒ ｔ ｅＡｎ ｌｓｓｏ ｈ ｅ ａ ａｉｎ Ｍ ｅｈ ｄ ｆＢｉｉｅ ｔｏ ａ ｅ ｔｏ ｈ ｒｔ ａ ｐｅ ｆＰ ｏｅ ｍｅ６ ｉ ａｉ ａｙ ｉ ｎ ｔ ｅＰｒｐ ｒ ｔ ｔｏ ｓｏ ｖ ｏ ｄｒ ｃｉｎ ｌＥｌｃｒ ｐ ｏ ｅｉ Ｓ ｍ ｌｓｏ ｒ ｔｏ 硼 ｃ
（． １ 内蒙古农业 大学 ， 内蒙古呼 和浩 特 ００ １ ； ． １０８ ２ 内蒙古农牧业 科学院 ， 内蒙古 呼和浩特 ００ ３ ； ． １００ ３ 中国农业科 学院北京畜牧兽 医研究所 ， 北京
１０９ ； ． 农 业 大学 ， 肃 兰 州 ７１７ ；． ０ １３ ４ 甘肃 甘 ３０ ０５ 中国 农业 大学 ， 京 １０９ ） ３ 北 ０ １１
摘要 ［ 目的］比较野牛草种子 蛋白质的提取 方法。［ 方法］以“ 中坪一号” 野牛草种 子为试材 ， 分别采 用 Ｔ Ａ Ａ 三 氯 乙 丙酮 ） Ｃ／（ 沉淀法 和 Ｔｚｌ ｒｏ 法提取种子蛋 白． ｉ 并利 用条件一致 的蛋 白质双向 电泳体 系进行分析 比较 。［ 结果 ］ Ｃ ／ Ｔ Ａ Ａ法提取 的蛋 白质 双 向电泳 图谱 背景噪 音大 ， 清晰度差 ， 横向条纹较 多 ， 上呈现 多个形 状不规 则 的斑点 ， 色与 正常 蛋 白质 点有 区别 ， 图谱 杂 对其他蛋 白质点构 成 高度 覆盖 和遮 避． 影响 图谱信 息的准确 表达 ； ｉｌ Ｔ ｍ 法所提取 的蛋 白质样品 ， ｒ 其双 向电泳 图谱背景噪音 小 ， 向条纹 少， 横 非蛋 白类杂质 少， 无斑点 间的遮 避现 象， 白质 点数量 增 多， 蛋 为野牛草种 子蛋 白质组定 量、 定性 分析提供 了丰 富的信 息。［ 结论 ］与 ＴＡ／ Ｃ Ａ沉淀 法相 比， 改进 的 瞄ｚ 法 ０ ｌ 是野牛草种子蛋 白质提 取的适 用方法。 关键词 野牛 草； 种子蛋 白质组 ； 白质 双向 电泳 ； 蛋 图谱
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安 徽 农 业 科 学 。ｏｒａ ｏ Ａ ｈｉ ｇ ．ｃ．０９ ３ （３ ：９２—５８ Ｊｕ ｌｆ ｎｕ Ａ ｎ Ｓｉ２０ ，７ １）５８ ｎ ９４
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责 任校 对Biblioteka 卢 瑶 野 牛草种 子 蛋 白质 组双 向 电泳样 品制备 方法 的分 析 比较
孙 杰 ，一 ，刘永志 ， ２， ２ 康俊梅 ， 熊军波 ， 静 ， 会刚 ， 彦 沈 ４吕 孙
ｂ ｉ ｅｏａ ｅｅｔ ｈｒ ｉ ｓｓ ｍ ｗｔ ｎｏ ｏｄｔｎ ｆ ｒｔｉ．１ ｅｕｔ １ ｅｂｃｇｏｎ ｏ ｅｏ ｉｒｃｉ ａ ｅｅｔ ｈｍｓ ａ ｆｐ ｔｉ ｅ・ ｉｒ ｔｎ ｌ ｌ ｍｐｏｅ ｓ ｙｔ ｉ ｕ ｉｍｌ ｎｉｏｓｏ ｏ ｎ Ｒ ｓｌ ｈ ａｋｒ ｄｎ ｉ ｆ ｄ ｅｔ ｎｌ ｌ ｍｐｏ ｉ ｍ ｐｏ ｒ ｅ ｘ ｄｅ ｉ ｃ ｓ ｅ ｈ ｆ ｃ ｉ ｐ ｅ 』 ｕ ｓ ｂｉ ｏ ｅ ｓ ｏ ｎ
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