组氨酸缺陷型菌种筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的挑选和鉴定mutugenesis and isolation of auxotroph细菌革兰氏染色法gram stain酵母菌的形态构造观察yeast morphology培养基的配制和灭菌types of mddia and sterlization菌种保藏preservation of cultures细胞计数法conting of cell凝集反响agglutination reactions相差显微镜phase contrast microscope细胞交融cell fusion质粒DNA的提取isolation of plasmid DNA植物DNA的提取isolation of plant DNA多肽的末端分析analysis of terminal of polypeptidePCR扩增DNAPCR amplify DNA fragmentSDS-聚丙烯凝胶电泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis蛋白质的性质properties of protein植物组织培养plant tissue cultureBL-410生物机能实验系统简介the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备preparation methods for nerve-muscle specimen of frog人ABO血型的鉴定Identification of humankind ABO blood group蟾蜍心室肌的期前收缩与代偿性间歇compensatory pause and ventricular extrasystole of ventricular muscle for toad 果蝇的两对因子的自由组合pair factors for free combination of Drosophila植物姊妹染色单体及染色体的区分sister chromatid of plant and differentiate of chromosomeβ-半乳糖苷酶基因〔lac-Z〕的定点突变site-directed mutagenesis of β-galactosidase gene〔lac-Z〕β-半乳糖苷酶的固定化及应用application and immobilization of β-galactosidase大肠杆菌感受态细胞的制备及转化the preparation and transformation of competent cells from Escherichia coli质粒DNA的提取及酶切extraction of plasmid DNA and its detection植物基因组DAN的提取extraction of plant genome DNA小鼠巨噬细胞吞噬实验的观察experimental observation of macrophage cell分小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能phagocytosis of mice peritoneal macrophage cell动物骨髓细胞染色体标本的制备preparation method of chromosomes for animal marrow cells细菌的形态观察bacteria morphology植物叶绿体色素含量的测定determination of chloroplast pigment in plant根的形态构造morphology of root茎的形态构造morphology of stem植物的各种组织tissus of plants氨基酸的别离鉴定-纸层析法the isolation and identification of amino acid- paper chromatography蛋白质的颜色反响coloration reaction of proteins白菜的组织培养tissue culture of cabbageHigh School Biology Experiment IdeasBy Jennifer Eblin, eHow Contributorupdated: April 28, 20211.One idea involves testing the effects of different substances on plants.High school level biology covers all aspects of biology, including animals, plant life and humans. That should mean it's easy to come up with ascience fair project or a classroom research project, but the amount oftopics sometimes makes it even harder. When you first start researching, you'll find thousands of ideas and it's difficult to decide which one is best for your situation. Provided that you know what you want to do and what your teacher or judges are looking for, it's easy to come up with a greatbiology experiment.Effects on Plants2. Test the effects of different substances on plants. Place plants from thesame source in pots of the same size, then use different types of materials.You can test different types of potting soil against regular dirt or use the same type of potting soil and test other substances. Water the plants with different types of bottled water and tap water from your home and other homes or add a small amount of vinegar and other liquids to see how the plants react to those substances. Observe the effects of the differentsubstances on the plants and measure how quickly each plant grows in comparison to the others.Water Bottles3. Test the amount of germs and toxins found when you refill a water bottle.Start by taking a sample swab from the outside lip of the bottle and looking at the water under a microscope for any bacteria or impurities. Then drink from the bottle as you otherwise would and test the bottle each time you refill it with extra water. Student athletes can even use the same plasticwater bottles they carry with them to practice every day. Each time, you'll want to swab the inside lip of the bottle and look at the swab under amicroscope. Identify any bacteria or toxins by looking at the examplesfound in your textbook.Public Germs4. You might be surprised when you check different public areas for germs.Take swabs at public bathrooms, in your classroom, on the door handles at stores and even books at the public library. Look at the swabs under a microscope and see what types of germs you find. Then offer acomparison of the germs and explain your findings. Discuss which germs are harmful and what levels of germs you found.Hair5. Do a biology experiment focusing on how the hair reacts to differenttypes of products. Test shampoos, conditioners, hair gels, hair sprays and other products. Look for residue left behind by the product, but take a few sample hairs before you begin. Check the consistency and health of the sample hairs under a microscope and compare those results against hairs after using the products. Observe any changes you notice in the look or feel of your hair, as well. Then look for signs that the hair has becomemore damaged or healthier since you used the product. You'll need tonarrow it down to just a few products, but if you have more time, use one product for several days before switching to anotherRead more: High School Biology Experiment Ideas | eHow。
L2组氨酸产生菌的选育
第21卷第5期2002年9月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.21 No.5Sep. 2002 文章编号:1009-038X (2002)05-0533-03 收稿日期:2002-03-20; 修订日期:2002-07-01.作者简介:顾正华(1974-),男,江苏江阴人,助理工程师,学士;3责任作者.L 2组氨酸产生菌的选育顾正华, 张伟国3(江南大学生物工程学院,江苏无锡214036)摘 要:以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteri um gl utam icum )A TCC 213761为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES )和亚硝基胍(N TG )诱变处理,D 2组氨酸(D 2His )、62氮鸟嘧啶(62AU )等结构类似物平板和以L 2组氨酸(L 2His )为惟一氮源平板定向筛选,获得一株L 2组氨酸产生菌H 224(D 2His r 62AU r Hisase -).在加有150g/L 葡萄糖、35g/L 硫酸铵以及10mL/L 玉米浆的发酵培养基中发酵72h ,产L 2组氨酸1.6g/L.关键词:谷氨酸棒杆菌;化学诱变;育种;发酵;L 2组氨酸中图分类号:Q 933文献标识码:ABreeding of L 2Histidine Producing MutantGU Zheng 2hua , ZHAN G Wei 2guo(School of Biotechnology ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China )Abstract :L 2Histidine producing mutants were derived from Corynebacteri um gl utam icum A TCC 213761,by means of mutagenesis with N 2methyl 2N ’2nitro 2N 2nitrosoguanidine (N TG )and diethyl sul 2fate (DES ).The mutants were selected on the agar plates containing D 2histidine ,62Azauracil and L 2histidine medium plate.A L 2histidine producing mutant H 224(D 2His r 62AU r Hisase 2)obtained can accumulate about 1.6g/L L 2histidine in a medium containing 150g/L glucose ,35g/L ammonium sulfate and 10mL/L corn steep liquor.K ey w ords :Corynebacteri um gl utam icum ;chemical mutagenesis ;breeding ;fermentation ;L 2histi 2dine L 2组氨酸属于半必需氨基酸,对于婴幼儿及动物的成长尤其重要.成人及已成长动物的膳食或饲料中无组氨酸亦能维持其氮平衡.目前L 2组氨酸主要应用于医药、食品和饲料等方面,国内仅有提取法少量生产,尚无研究发酵法.本实验以一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteri umgl utam icum )A TCC 213761为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES )和亚硝基胍(N TG )多次诱变处理,获得产L 2组氨酸的产生菌H 224(D 2His r 62AU r Hisase -).1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌种 以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteri umgl uta 2m icum )A TCC 213761为出发菌株.1.1.2 培养基(g/L )1完全培养基:葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,NaCl 5,琼脂20,p H 7.0. 种子培养基:葡萄糖25,(N H4)2SO45,玉米浆40,KH2PO41,MgSO4・7H2O0.5,CaCO310,p H 7.0.发酵培养基:葡萄糖150,(N H4)2SO435,玉米浆10,KH2PO41.0,MgSO4・7H2O0.5,CaCO330, p H7.0.1.1.3 主要试剂1亚硝基胍(N TG)、D2组氨酸(D2 His)、62氮鸟嘧啶(62AU)均为美国Sigma公司产品.1.2 方法1.2.1 诱变方法1常规化学诱变法[1].1.2.2 平板筛选结构类似物变异株的获得:将诱变处理后的菌液涂布于加有结构类似物的基本培养基上,培养2～3d,挑出单菌落,即得结构类似物抗性变异株.组氨酸酶缺陷型变异株的筛选:将诱变处理后的菌液涂布于完全培养基上,培养2d,挑出单菌落后,对照移接于以L2组氨酸为惟一氮源的基本培养基上,挑出不能在组氨酸平板上生长的菌株,即得组氨酸酶缺陷型变异株.1.2.3 种子培养1接一环斜面种子于装有40mL 种子培养基的250mL三角瓶中,于往复式摇床上30℃振荡培养11h,频率85次/min,振幅90mm.1.2.4 摇瓶发酵1接1mL种子液于装有25mL 发酵培养基的500mL三角瓶中,于往复式摇床上30℃振荡培养72h,频率100次/min,振幅90mm.1.2.5 分析方法葡萄糖:菲林试剂法[2].L2组氨酸:纸层析测定,用Pauly试剂显色[3],氨基酸自动分析仪测定.2 结果与讨论2.1 L2组氨酸产生菌H224的选育从一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteri um gl u2 tamicum)A TCC213761为出发菌株,采用N TG和DES诱变处理,使之具有D2His r62AU r Hisase-等遗传特性,得到一株L2组氨酸产生菌H224,在适当的发酵条件下,产酸达1.6g/L.选育谱系如图1.2.2 L2组氨酸摇瓶发酵试验对H224进行摇瓶发酵试验,结果发现,碳源和氮源不足影响产酸,在添加了足够的葡萄糖150 g/L和硫酸铵35g/L时,主要影响产酸的因素是玉米浆和生物素.从图2可看出,当玉米浆添加量为10mL/L 时,产酸最高,多于或少于此量时,产酸均下降.从图3的生物素试验可看出,由于培养基中已添加玉米浆,因此没有必要再添加生物素;当生物素添加质量浓度达100μg/L时,几乎不积累组氨酸,其原因可能与组氨酸酶有关;当培养基中生物素质量浓度较大时,组氨酸酶活增大,生成的组氨酸便被分解.菌株L2组氨酸质量浓度(g/L)谷氨酸棒杆菌A TCC2137610↓H24(D2His r)0.1↓H253(D2His r62AU r)0.3↓H224(D2His r62AU r Hisase-) 1.6 D2His r.D2组氨酸抗性;62AU r.62氮鸟嘧啶抗性; Hisase-.组氨酸酶缺陷图1 L2组氨酸产生菌H224的选育谱系Fig.1 The pedigree of the strain H224图2 添加玉米浆对产酸的影响Fig.2 The effect of corn steep liquor on histidine pro2duction图3 添加生物素对产酸的影响Fig.3 The effect of biotin on histidine production 在此基础上,对发酵培养基进行调整,效果均不明显,这可能是因为菌种产组氨酸水平还不高,而所选配比也接近最佳配养基.所以通过实验, L2组氨酸发酵比较合适的培养基(g/L)如下:葡萄糖150,(N H4)2SO435,玉米浆10,KH2PO41.0, MgSO4・7H2O0.5,CaCO330,p H7.0.发酵72h,产组氨酸1.6g/L.435 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第21卷2.3 讨 论2.3.1 解除反馈抑制和反馈阻遏L 2组氨酸的生物合成途径[4]如下图所示.由PRPP 和A TP 生物合成组氨酸共11步反应,有2个酶是双功能酶,共有9个酶催化.组氨酸操纵子的9个酶的基因表达由同一个操纵基因控制.L 2组氨酸合成途径中的第一步反应是由磷酸核糖2A TP 焦磷酸化酶催化的限速反应(由PRPP 与A TP 合成磷酸核糖2A TP 的反应),关键酶磷酸核糖2A TP 焦磷酸化酶受L 2组氨酸的反馈抑制.当组氨酸量超过微生物生理需要时,终产物组氨酸还会反馈阻遏参与组氨酸生物合成的所有酶的生成,这种阻遏属于协调阻遏. 52磷酸核糖焦磷酸 三磷酸腺苷 (PRPP ) (A TP )↓磷酸核糖2A TP↓磷酸核糖2AMP↓磷酸核糖亚甲胺基252氨基咪唑242甲酰胺核苷酸↓磷酸核酮糖亚甲胺基252氨基咪唑242甲酰胺核苷酸↓52氨基咪唑242甲酰胺核苷酸↓咪唑甘油磷酸↓咪唑磷酸丙酮醇↓磷酸组氨醇↓组氨醇↓组氨醛↓组氨酸图4 L 2组氨酸的生物合成途径Fig.4 The pathw ay of histidine biosythesis L 2组氨酸的结构类似物D 2组氨酸的作用是替代L 2组氨酸,对磷酸核糖2A TP 焦磷酸化酶起反馈抑制作用并参与组氨酸生物合成所有酶的反馈阻遏,使得在加了D 2组氨酸的基本培养基上L 2组氨酸反馈抑制和反馈阻遏的菌株不能生长.只有解除反馈菌株方能生长.从而得到解除L 2组氨酸反馈抑制和反馈阻遏的菌株,这个菌株才能积累L 2组氨酸.2.3.2 增加前体的合成152磷酸核糖焦磷酸(PRPP )和三磷酸腺苷(A TP )是L 2组氨酸合成的前体,PRPP 的合成受到鸟嘧啶的抑制[5].选育鸟嘧啶结构类似物62氮鸟嘧啶(62AU )抗性菌株,PRPP 合成量增加,从而使L 2组氨酸合成增加.2.3.3 切断产物的代谢途径微生物中组氨酸的代谢主要通过组氨酸酶进行脱羧和脱氨[6],生成组胺和咪唑乳酸.利用以L 2组氨酸为惟一氮源的平板筛选不能分解L 2组氨酸的Hisase -突变菌株H 224,结果产酸得到较大幅度提高.在实验过程中,发现组氨酸的代谢对组氨酸积累影响极大.这与其他氨基酸产生菌的选育不同.在解除组氨酸合成途径的反馈抑制和反馈阻遏后,所合成产物基本被分解,而切断产物的代谢途径后,组氨酸才有较多积累.Kazumi Araki 等人的实验中均未提及L 2组氨酸代谢对积累组氨酸的影响,仅解除反馈抑制和反馈阻遏,便积累至8g/L ,可能其所用菌种与作者所用在代谢上有所不同.为此,作者将作进一步工作,根据此菌株的生理特性,继续提高菌种水平,以达到应用水平.参考文献:[1]章名春.工业微生物诱变育种[M ].北京:科学出版社,1984.77-96.[2]无锡轻工业学院,天津轻工业学院,大连轻工业学院等.工业发酵分析[M ].北京:轻工业出版社,1980.[3]华家柽.实用蛋白质化学技术[M ].上海:上海科学技术出版社,1982.180-187.[4]K AZUMI ARA KI ,KIY OWA HA KKO.A biochemical characterization of histidine auxotro phs of Corynebacterium glutamicum[J ].Agri Biol Chem ,1974,38(11):2219-2225.[5]K AZUMI ARA KI ,SETSU KO SHIMOJO ,KIY OSHI NA K A Y AMA.Histidine production by Corynebacterium glutamicumMutants ,multiresitant to analogs of histidine ,tryptophan ,purine and pyrimidine[J ].Agri Biol Chem ,1974,38(4):837-846.[6]沈仁权.基础生物化学[M ].上海:上海科学技术出版社,1980.602.(责任编辑:杨勇)535第5期顾正华等:L 2组氨酸产生菌的选育。
营养缺陷型菌株的筛选
CM
MM
３、夹层法
先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基， 凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒 一 薄 层 MM 琼 脂 培 养 基 ， 培 养 24h ， 将 出 现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养 基，再培养。这时第二批长出的菌落就可 能是缺陷型。
此法缺点是，结果有时不明确，而且将
（4）将CM和MM在恒温箱中培 养。
（5）二平皿相同方位进行比较， 即 可 发 现 在 MM 平 皿 上 长 出 的 菌落少于CM平板上的。MM上 未长而相应于CM上长出的那几 个菌落就可能是缺陷型。
此法要求平皿上菌落不能太多，
菌落之间应有一定间隔。
CM
MM
２、点种法
用接种针或牙签将CM上长出的菌 落在MM和CM两副平板上接种，依 次在相应位置点种，然后一起培养， 观察其生长情况。
MM
MM+F
无营养缺陷
CM
其他营养 缺陷
１、影印法
将一较平皿直 径小1cm的金 属圆筒蒙上一 层灭菌的丝绒， 用金属夹夹住， 灭菌。
完全培养基上 长出的全部菌 落在丝绒上轻 轻一压，使之 成为印模，标 记方位。
将基本培养基 平皿和完全培 养基平皿在标 记的同一方位 上先后轻轻一 压，此菌印模 即复印于上。
1、野生型菌株（wild type strain） 2、营养缺陷型（auxotroph）：
指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如 氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基 本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长 的变异株。 3、原养型（prototroph）：
营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生 的菌株，其营养要求在表型上相同。
与之有关的培养基有三类
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选是一种重要的技术，主要应用于基因组学研究、菌种鉴定、病
原学研究及微生物资源保护。
营养缺陷型菌株是有针对性的，可作为正常菌株的突变体，
以提高实验在病原性、耐受性等方面的准确性。
因此，有效的筛选营养缺陷型菌株不容忽视。
营养缺陷型菌株的筛选包括实验法和非实验法两种。
实验法是采用固定条件，通过控
制外源营养物质完全缺乏或有限，使某一肽或多肽水平落到特定值，从而引起营养缺损型
菌株的筛选；非实验法则是依据基因数据库中发现的营养物质代谢路径分析，筛选出能够
诱导营养缺陷菌株的基因。
具体步骤如下：
1、构建营养培养基：根据需要，选择对营养缺陷型菌株的实验特异性的培养基，将
培养基进行稀释，以减少营养物质的含量。
2、处理营养缺陷型菌株：分离菌株，以营养缺陷型菌株为【测试菌】，无营养缺陷
的正常菌株为【对照菌株】。
3、培养对照菌株
将对照菌株接种于稀释的培养基中，摇匀，加热37℃翻转培养，室温培养12—18小时，待菌落出现，观察是否有正常菌落形成。
若有正常菌落出现，在16小时后再次观察，确定营养缺陷型菌株存在可能性。
5、数据分析：根据营养缺陷型菌株的表型分析结果，确定可能存在营养缺陷型菌株
的培养基形式，进行深入分析，以便更好地了解营养缺陷的突变机理。
营养缺陷型菌株的筛选是一项复杂的工作，仅依靠一种筛选方法是不够的，为了使筛
选更有效率和准确，应该综合使用上述多种筛选方法，全面分析各种可能的内因、外因对
营养缺陷型菌株发生的影响，以实现科学准确的筛选结果。
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型菌株的筛选过程
• 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野 生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
• １诱变剂处理
• 诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变 处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很 低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素 法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌 株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。
3营养缺陷型的检出方法夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法影印接种法影印接种法逐个检出法逐个检出法1影印法影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上经培养后长出菌落然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具将长出菌落的平皿倒转过来在丝绒上轻轻按一下转接到另一基本培养基平板上经培养后比较这两个平皿长出的菌落
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选生命科学学院09级生物技术1班余振洋200900140156指导老师：林建群同组者：潘红芳摘要营养缺陷型菌株是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，计划通过诱变得到并筛选出营养缺陷型，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤并掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词营养缺陷，诱变，生长谱测定，大肠杆菌（E.coli）1．引言1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。
由于营养缺陷型不能合成某种末端产物，解除了合成代谢的反馈抑制作用，限量添加所需生长因子克服生长障碍后，可选择性大量合成积累所需的中间代谢产物。
因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。
营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得原养型。
1.2 紫外线诱变紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。
紫外线是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。
紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。
由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。
15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。
低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。
紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。
在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。
当细胞中的DNA分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变。
营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型突变株的筛选一、与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体①营养缺陷型：原菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷，失了合成某种代谢产物的能力，必须在培养基中外源补加该物质才能生长，这类突变菌株，叫营养缺陷型突变株，简称营养缺陷型。
②野生型：变异前的原始菌株。
③原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产性的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，表示方法亦同野生型。
二、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
②补充培养基：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。
③完全培养基：可满足该菌种各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
三、筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法①诱变：变常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。
②淘汰野生型a)抗生素法某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。
如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。
b)菌丝过滤法适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。
在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。
将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10h-12h, 使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的。
③检出缺陷型的常用方法a)逐个测定法(点种法)：把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
b)夹层培养法：经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平板中，待凝固后，再加上一层不含菌的基本培养基。