杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理
膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)
Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
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细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
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膜片钳前期调研综述
膜片钳前期调研综述膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个)离子通道分子活动的技术。
作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。
应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。
1．膜片钳技术原理膜片钳技术(patch-clamp technique)是在电压钳技术的基础上发展起来的，采用记录流过离子通道的离子电流，来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。
该技术将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附在只有几平方微米的细胞膜上，通过在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使与微电极尖开口处相连的细胞膜的小区域(膜片)与其周围的细胞膜在电学上完全分隔。
将膜片内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个膜片钳放大器测量此电流强度，就得到单一离子通道电流。
原理（见图1）2.膜片钳技术发展历史膜片钳技术是在电压钳（voltageclamp）技术的基础上发展起来的，电压钳技术由Cole和Marment设计，后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究。
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1981年Hamill和Neher等人对最早的膜片钳方法和电子线路做了较大的改进和完善，使其电流测量的灵敏度达到1pA，时间和空间分辨率分别达到10μs和1μm，并已逐步发展出几种适合不同需要的记录模式。
根据膜片与电极之间的关系，将这些记录模式分为四种:细胞吸附式、膜内面向外模式、膜外面向外模式、全细胞模式四种。
3.膜片钳技术优缺点膜片钳技术对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率，信息含量大；能够改变细胞膜电位，进行单细胞记录，同时可以控制改变细胞的内外溶液成分，灵活性好；应用范围广，可以分析检测所有的离子通道类型；能记录到pA级电流变化和单通道开关状态，因此具有很高的高灵敏性；相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性。
细胞生物学膜片钳电生理技术方案
探密神经元：细胞生物学膜片钳电生理技术想要深入了解神经元的内部世界，细胞生物学膜片钳电生理技术是必不可少的工具。
本文将为您详细介绍这一技术的流程和应用。
一、细胞生物学膜片钳电生理技术的流程
1. 细胞分离：使用一定的方法，将某特定细胞（比如神经元）从组织中分离出来。
2. 制备膜片钳：将玻璃毛细管拉制成1-2微米孔径，然后加热拉扯形成一个特定形状的膜片钳。
这个过程需要高超的技术和经验。
3. 吸管过程：将制备好的膜片钳接在一根吸管上，启动吸管的吸气功能，使得膜片钳固定上细胞表面。
4. 测量：通过膜片钳的电学特性测量细胞膜上的电流、电势变化等信息，以了解神经元在不同环境下的生理活动情况。
二、细胞生物学膜片钳电生理技术的应用
1. 突触传递：了解神经元之间信号传递的机制，通过刺激突触区域，测量膜片钳电生理信号，可以得知该突触区域对应神经递质的释放和再吸收等生理和病理过程。
2. 离子通道：如钾、钠、钙等离子通过通道进出神经元，参与神经元兴奋、抑制等生理过程。
细胞生物学膜片钳电生理技术则可以揭示这些离子通道的运转方式和动力学特点。
三、细胞生物学膜片钳电生理技术的注意事项
1. 技术难度较大：这种技术需要较高的专业性和技术能力，并且需要功能完备的设备。
2. 实验操作需谨慎：对细胞的操作需要精确细致，防止对细胞产生不必要的损伤。
同时操作过程中注意安全，防止伤害自己和他人。
细胞生物学膜片钳电生理技术是目前神经元研究最重要的技术手段之一。
实践证明，通过这一技术手段，可以更好地探究神经元内部的运作机制和行为特点，以及有针对性地进行药物筛选等工作。
电压钳制和膜片钳制技术讲解
膜片钳放大器主要组成:
电极电流监视器、灵敏度开关、滤
(1)测量部分： 波器开关、方式选择开关 。
(2)串联电阻补偿部分：用于于电校极正和全细细胞胞内记之录间时的通，路由
(3)电容补偿部分：用
ห้องสมุดไป่ตู้
电阻所造成的膜电位 来补偿电压突然改
(二)电压钳方法
电容器电流
电阻器上电流
Ic=d（CmV）/dt
IR
流过膜的电流总量 I
dv / dt = 0
所有的电流将都是流过 膜电阻的，这种电流将能反 映离子的流动。
电压钳技术的基本原理
电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放 大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连 接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离 子电流，通过电流监视器测量电流。
(三) 细胞膜的空间常数（space constant）
空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志 电压依距离而衰减的程度的一个常数。即: 膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流 电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的 速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到 37%所需要的距离。细胞直径越大，空间常 数越大。
膜片钳技术原理示意图
Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是 封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以 上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线） 内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
膜片钳与电压钳的区别
第二节 电压钳制技术
Voltage clamp technique
patch clamp膜片钳技术的原理和应用(超全的哦)
第二部分
一：应用学科
膜片钳技术的应用
膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规 方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直 接或间接为临床医学研究服务， 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科 学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物 细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高 通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命 力。
5.对药物作用机制的研 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内 或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可 能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物 生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的 领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理 的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法 观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大 脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺 血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通 道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型 钙通道有阻滞作用。
膜片钳技术概述
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境 的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。 有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光 敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进 行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色 布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜 优点： 具有较好的视觉效果 便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。 具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出 荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子 结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的 荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算 出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的 方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该 细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞 膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析 这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的 电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为 快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2， 由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因 跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产 生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时， 可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。 膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它 把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大 器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形 式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种 典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪 声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。
膜片钳技术原理及相关基本知识0306
失活 状态
Inactive state
复活
recovery
静息 状态
resting state
开放 状态
激活
activation
open state
离子通道的功能
(Function of Ion Channels)
1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。
2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、 学习和记忆 3.维持细胞正常形态和功能完整性
• 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞
• 水通道
2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
电生理学研究简史：
• 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 • 1825 年， Nobili 发明了电流计，用其证实了肌 •
肉有电流存在。 1912 年， Bridge 确定了 AP 的“全或无”现象。 同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生 理学研究，获1932年Nobel奖。
• 1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴 •
离子通道结构研究：目前，绝大
多数离子通道的一级结构得到了阐明 ，但最根本的还是要搞清楚各种离子 通道的三维结构，在这方面，美国的 二位科学家彼得· 阿格雷和罗德里克· 麦 金农做出了一些开创性的工作，他们 利用X光绕射方法得到了K离子通道的 三维结构，二位因此获得2003年诺贝 尔化学奖。有关离子通道结构不是本 PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通 道药理学≫和Hill的≪ Ionic Channels Of Excitable Membranes ≫. .
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
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杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理
杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理
一、概述
膜片钳电生理技术是一种用于检测神经元功能的有效技术，它可以记录神经元细胞内的电位变化，从而获得神经细胞活动的定量信息。
膜片钳电生理技术可以在培养皿内对神经元进行长时间观察，以及在体内对神经元的活动机理进行研究。
膜片钳电生理技术通过把膜片钳电极插入细胞的膜片中，电生理技术可以实现对神经元功能的定量化研究。
膜片钳电极可以准确地测量因果物质和电解质释放而引起的膜片内电位变化的大小，从而可以提高细胞膜膜反应的准确性。
它为神经细胞活动的研究提供了可靠的定量信息，也是目前研究神经通路和药物作用的重要工具。
二、工作原理
膜片钳电生理技术是一种定量的技术，通常用于实验室中的神经生物学研究，可以检测细胞的多种活动指标，可以在实验室中研究神经通路和药物作用的机制。
膜片钳电生理技术是利用膜片钳电极插入神经细胞膜的特点，来检测神经元细胞内膜电位的变化。
膜片钳电极可以非常精确地检测因果物质和电解质释放而产生的膜内电位变化，比如神经元细胞内的乙酰胆碱，胆碱能，神经肽和突触可塑性的变化。
膜片钳电生理技术的原理是将膜片钳电极插入神经细胞膜中，电位变化会被膜片钳电极的两端传递给记录仪，由记录仪转换为电信号，
记录仪会对这些转换的电信号做记录，最后就可以实时记录神经细胞内膜变化的电压。
通过膜片钳电生理技术，可以准确地检测到神经元细胞内的膜电位变化情况，从而给出神经元细胞活动的定量信息，帮助研究者深入研究神经元细胞的活动机理。