武汉大学医学部膜片钳安装培训V剖析
华中科大仪博生命科学仪器 pc2c 膜片钳放大器 说明书

3 安装…………………………………………………………………………………………...7
3.1 初始检查…………………………………………………………………………………..7 3.1.1 检查包装内的部件…………………………………………………………………...7 3.1.2 初始测试……………………………………………………………………………...7 3.2 膜片钳实验系统的安装…………………………………………………………………..9 3.2.1 安装探头……………………………………………………………………………...9 3.2.2 接地…………………………………………………………………………………...9 3.2.3 连接其他仪器设备………………………………………………………………….10 3.2.4 电极夹持器和电极银丝的处理…………………………………………………….11 3.2.5 浴池参考电极……………………………………………………………………….12
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华中科大仪博生命科学仪器有限公司
2 探头和主机面板
2.1 探头
PC2C 的探头装配在一个小的封闭金属壳体中,探头可根据用户所使用的微操纵器,通 过本公司提供的有机玻璃绝缘垫块安装, 一般需要在绝缘垫块的适当位置打孔, 然后用螺钉 固定探头。 探头的前端可以直接与本公司提供的电极夹持器扣接, 电极夹持器与记录微电极 实现电连接,取得膜片钳信号,并将其输入到探头内部的前置放大器。探头内部包括实现电 流-电压转换的高灵敏度前置放大器,实现 50GΩ/0.5GΩ电控切换的电子开关,以及向放大 器注入补偿、测试信号的元件。在探头上有以下电连接器: 1. 输入插座(Input connecter) :这是一个聚四氟乙烯(Teflon)绝缘的标准Q9 型(与 国际BNC型兼容)插座,本公司提供的H1 型电极夹持器(中国专利号:ZL 01 2 12489.3) 可直接插入该插座。芯线为放大器信号输入线,屏蔽层接命令电压VP。 注意: 应避免手指直接接触探头的输入端芯线, 因为人体所带静电可能会损害探头的输 入电路。 2. 命令电压输出插座(REF. Output) :这是一个带有 1mm内径镀金插孔的红色塑料插 座,与命令电压VP相连。该命令电压同时驱动探头的屏蔽外壳。 注意: VP信号的输出电阻为 90Ω,过重的负载(过小的负载电阻)会使命令电压衰减 过大,也就使电极电压过小。一般不能将此信号接于低于 10kΩ的负载电阻上,否则电极电 压将明显低于主机电压表显示的电压值。特别需要注意,探头外壳不能与周边设备(如:微 操纵器的探头安装平面等)有电接触,否则VP将会对地短路。 3. 地线插座(GND connecter) :这是一个带有 1mm 内径镀金插孔的黑色塑料插座,与 整个放大器高质量的信号地线直接相连。 该地线插座可用于连接浴池参考电极接地线和附近 装置的屏蔽,这样连接不会形成地线环路,从而避免地线环流对放大信号产生的干扰。第 3 章将对接地有详细说明。 注意:探头内部及电缆已经良好屏蔽,用户无需再对它做任何其他屏蔽。探头外壳的屏 蔽并未与地线相连,而是与命令电压VP相连。
膜片钳常见问题解答讲解

膜片钳常见问题解答(一)1.什么是电压钳与膜片钳,有什么区别?答:电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流,抵消离子通道开放时所产生的离子流,从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反,因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”,是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触,使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离,这大大降低了背景噪声,使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值,可记录到单通道电流。
从这点上看,膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展,它已经不仅仅局限于“膜片”的概念,也不仅仅采用电压钳技术,还常采用电流钳技术。
2. 离子通道电导的单位是什么?如何换算?答:离子通道电导的单位是西门子(Siemens, S),旧称姆欧,即安培/伏特。
常用皮西门子(pS),1pS=10E-12 S,1,000 pS=1 pA/mV。
3. MultiClamp 700A中,在放大器和信号器的连接中,放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output,raw output有什么区别?答:Raw output为原始信号输出,放大器输出的信号没有经过处理(如滤波、放大等),scaled output为定标输出,输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大,因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output,你可将其与数模转换器(你所说的信号器)的ANALOG IN连接,这样放大器的输出信号就能传送给计算机了,此时已经没有必要再使用Raw output了。
若你想记录两个输出,则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中,Step和ramp各有什么适用范围?答:Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作,如多用于钾、钙离子通道。
膜片钳技术数据处理与分析 ppt课件

高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。
带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时,对其 它频率的噪声进行滤波。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Notch 带阻滤波:削弱某一特定频率(如50 Hz交流) 信号。 中心频率(Center frequency):10-3,000 Hz。 频率宽度(–3dB width):频率宽度。 -3dB width越窄,滤波需要的数据点越多,滤波 效果越好。
8
膜片钳实验数据的处理
(3)Subtract fixed value(去除固定值法)
(4)Adjust manually(手工调零法)
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
基线调零的注意事项 (1)有些只相对值(如电流幅度的变化值),不需要将基线调零。但多数 情况需要基线调零,建议都要进行基线调零。 (2)对于基线变动复杂的数据,基线调零可能会用到上述的几种方法。 (3)对于某些基线变动,Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。 建议最好在采集数据时就设法调整好基线。
Patch clamp training class
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示Average Traces功能
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Analyze/Segmented Average 可对几个Trace中的某一相同时段(如Epoch A)或Cursor 1-2之间的时间段进行平 均,平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。
2023年细胞生理学和膜片钳技术解析

膜片钳技术
• 膜片钳技术:从一小片(约几平方微米) 膜 获取电子学方面信息的技术,即保持跨膜 电压恒定——电压钳位,从而测量通过膜 离子电流大小的技术。通过研究离子通道 的离子流, 从而了解离子运输、信号传递 等信息。
基本原理
• 利用负反馈电子线路, 将微电极尖端所吸附 的一个至几个平方微 米的细胞膜的电位固 定在一定水平上,对通 过通道的微小离子电 流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
• Voltage clamp ( 电 压 钳 技 术 ) 由 Cole 和 Marmont 发明,并很快由Hodgkin和Huxley完 善,真正开始了定量研究,建立了H-H模型 (膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 1948年,Katz利用细胞内微电极技术记录到了 终 板 电 位 ; 1969 年 , 又 证 实 N - M 接 触 后 的 Ach以“量子式”释放,获1976年Nobel奖。
通道蛋白——离子通道
• 环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合,激活腺苷酸环化酶,
产生cAMP,开启cAMP门控阳离子通道(cAMP-gated cation channel),引起钠离子内流,膜去极化,产生神经 冲动,最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道,另一类是剪切力敏 感的离子通道,前者几乎存在于所有的细胞膜,研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等,后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖: Pete Agre、 Roderick MacKinnon
• 1976年,德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp(膜片钳)。并在蛙横纹肌终板部位记 录到乙酰胆碱引起的通道电流。
膜片钳技术讲座幻灯92页PPT

谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人,越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智,自知者明。胜人者有力,自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
膜片钳技术讲座幻灯
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ;权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊,可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
Hale Waihona Puke
膜片钳技术(研究生平台课)

生物电现象研究简史
18 世 纪 末 , 意 大 利 医 生 和 生 理 学 家 Galvani 首先在生物体 ( 蛙 ) 发现了生物电 现象。 1902 年, Bernstein 提出了细胞生物电产 生的膜学说。 1936年,英国剑桥Young描述了头足软 体动物枪乌贼支配其外套膜肌的巨大轴 突直径可达1mm。
电压门控离子通道(voltage-gated ion channels)的开启或关闭受膜电位的变化 决定,具有电压依赖性,同时通道往往还 与电位变化的时程有关,即具有时间依赖 性。这 类通道在决定细胞的兴奋性、不 应期和传导性以及维持细胞正常体积等方 面发挥重要作用。电压门控离子通道一般 以最容易通过的离子命名,如钠离子通道、 钙离子通道及钾离子通道等。
Patch clamp
Erwin Neher 1944~
Bert Sakmann 1942~
一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法 六、与膜片钳技术相结合的其它研究 方法
一、离子通道的概念
1955年,Hodgkin和Keens在研究神经轴 突膜对钾离子通透性时发现,放射性钾 跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄孔 洞的运动,并提出了“通道”(channel) 的概念。 细胞膜对离子通道的通透性(膜电导) 的 直 接 测 定 是 从 应 用 电 压 钳 ( voltage clamp)技术以后开始的。
A.L.Hodgkin
A.F.Huxley
1914~1998
1917~
1972年Katz通过记录神经肌接头终板 膜上乙酰胆碱噪声,发现ACh的量子性 释放引起的终板电位及微终板电位,指 出其与离子通道的电导、开放时间及开 放频率的对应关系,获1970年诺贝尔生 理学或医学奖。
武汉大学医学部 膜片钳安装培训 V

膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进, 引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使 该技术更趋完善,具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月 《Single-Channel Recording》一 书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献,荣获 1991年诺贝尔奖。
Capillary Top channel Casptiollapry stop-extracellular Breather
Breather
Breather
Waste
REF
MEAS
BoRtetaorm(intrcahceallnulnare) l -intrfalocweclhluanlanerl
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器 示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
电压钳-电容的充放电波形
全细胞模式下等效电路
全细胞电压钳的各个电流波形
补偿原理:提供另一支路
快电容(电极电容)补偿
慢电容(膜电容)补偿
电流波形补偿全图(200B)
电流波形补偿全图(700B)
串联电阻??
串联电阻引起的钳位误差
串联电阻补偿(200B)
串联电阻补偿(700B)
武汉电生理膜片钳原理

武汉电生理膜片钳原理武汉电生理膜片钳原理是一种在细胞内用于夹取和定位膜片的技术。
这种技术使用精密的微电子设备,可以在细胞中操作小到几十微米到数毫米的膜片,并可以控制膜片的位置或者把膜片吸附到细胞表面上。
这种技术包括两个部分:一部分是使用一种叫做“微电子抓取”的微电子设备,它可以夹取细胞表面上的膜片;另一部分是使用一种叫做“光学抓取”的微电子设备,它可以夹取细胞内的膜片。
微电子抓取是一种用于夹取膜片的方法,它使用一种叫做“微电子抓取”的微电子设备,可以夹取直径小于50微米的膜片,并将膜片放置到细胞表面上。
这种设备是一种微电子机械装置,它可以精确地夹取膜片,并将膜片放置到细胞表面上。
而光学抓取则是一种用于夹取膜片的方法,它使用一种叫做“光学抓取”的微电子设备,可以夹取直径小于50微米的膜片,并将膜片放置到细胞内的特定位置。
这种设备是一种光学机械装置,它可以精确地夹取膜片,并将膜片放置到细胞内的特定位置。
武汉电生理膜片钳原理也可以用于细胞内电生理实验,例如测量细胞内电位、电流和其他电生理变化,以及实时检测细胞内的信号转导途径。
由于膜片钳可以夹取精确的膜片,因此可以在细胞内进行更准确的电生理实验,从而更好地理解细胞内的电生理机制。
与传统的电生理膜片技术相比,武汉电生理膜片钳原理的优势在于可以夹取精确的膜片,而不是整块膜片,并且可以控制膜片的位置或者把膜片吸附到细胞表面上。
这样,可以更加精确地检测细胞内的电生理变化和信号转导途径,从而更好地理解细胞内的电生理机制。
总之,武汉电生理膜片钳原理是一种用于细胞内夹取和定位膜片的技术,可以更精确地检测细胞内的电生理变化和信号转导途径,从而更好地理解细胞内的电生理机制。
该技术的应用为细胞生物学研究提供了一种新的手段,进一步推动了细胞内电生理实验的研究。
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细胞膜内侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录(single-channel recording) 可方便地通过改变浴槽灌流液(此时相当于细胞 内液)来了解药物对离子通道的影响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离 子通道的影响
外面向外式
计算机控制的微电极放大器 双电极探头
MultiClamp Commander
液接电位调零 电极电容补偿 细胞膜电容 膜电阻补偿
电极电阻补偿
Sutter公司
MP-225
电动式微操
$6,500
美国TMC公司
什么是膜片钳(Patchclamp)?
膜片钳技术是一种通过微电极与细胞 膜之间形成紧密接触的方法,采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。
内尔(Neher) (1944-) (德国细胞生理学家)
萨克曼(Sakmann) (1942-)
(德国细胞生理学家)
一个典型的实验过程
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
细胞 外面向外式
膜片钳电生理技术与设备
神经元
微电极
FBR
_
+ Amplifier
Technical The high gain operational amplifier is connected in the circuit so that the current flowing through the ion channel is measured as a voltage drop across the feedback resistor (FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very small currents (10-12 A)
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器 示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
1.脑片撕裂法(Slice rending method)
2.表面清洁法
3. 红外微分干涉相差显
(Surface cleaning 法) 微镜法(IR-DIC法 )
a
4.盲法 (Blind 法)
10μM
b
(引自:Ascher P, 1989)
10μM
(引自: Stuart et al., 1993)
膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进, 引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使 该技术更趋完善,具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月 《Single-Channel Recording》一 书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献,荣获 1991年诺贝尔奖。
Outside-out configuration
细胞膜外侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录(single-channel recording) 可方便地通过改变外液来了解药物对离子通道的影 响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离子 通道的影响
电压钳(Voltage Clamp)
当细胞膜上的离子通道开放,产生跨膜电流;但是跨膜电流会引起膜电 位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量;同时也会影响 离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记 录到的电流受多方面因素的影响,很难进行分析。
微电极电极与膜
膜片钳技术发展简介
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时,记录到ACh激活的单通道离子电流, 从而产生了膜片钳(patch clamp)技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引,得到10-100GΩ的高阻封接 (Giga-seal),大大降低了记录时的噪声,实现 了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的 突破。
(引自:The Axon Guide》,1993。 有改动)
海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象
海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象
神经元
微电极
举例一
离子通道研究
channel current (pA)
---------Voltage-depended
Ca2+ ion channel
-10
-20
-30
-40
-50
-60
I/V curve
-70
-80
-60 -40 -20
0
20
40
60
depolarization potenial (mV)
三、常见离子通道电流的记录:
1. Na+通道电流:全细胞记录
离子通道动力学性质的研究
(以海马脑片全细胞记录模式为例)
电压钳是保持细胞膜电位不变,同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨 膜电流是由Na+, K+, Ca2+, Cl-离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。
双电极电压钳原理图
Vc
e VVmm==VVcc
Na+
Vm
+
+
-+
- Na+ -
Im
e
+-
Cl- - + Ag/AgCl
+- -
+
-+ +
脑片膜片钳技术
细胞贴附式
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不损害细 胞膜的完整性; 用于单通道记录(single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
全细胞式记录
Whole-cell recording
将电极尖端的膜片打穿,电极内液与细胞内液 交换。 在电压钳制模式下,记录整个细胞的电流和不 同的离子通道电流 在电流钳制模式下,记录膜电位和动作电位 是最常用的记录方式 可以进行细胞外给药或将药物加到电极液中, 进行细胞内给药。