樟子松赤枯病拮抗真菌的筛选

中国森林病虫　２０１７年５月　第３６卷第３期　樟子松赤枯病拮抗真菌的筛选　徐阳　，赵贺新　，宋义前　，于庆帆　，刘雪峰　（１．新疆生产建设兵团农四师农业科学研究所，新疆伊宁市８３５０００；２．东北林业大学，黑龙江哈尔滨１５００４０）　摘要：在健康的樟子松针叶上分离得到２５种真菌，从中选出具有生防潜能的１１种用于控制樟子松　赤枯病的病原菌拮抗菌株的筛选。拮抗真菌与病原茵的平板对峙试验结果表明：长枝木霉　－　ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、血红毛壳Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｃｒｕｅｎｔｕｍ和印度毛壳Ｃ．ｉｎｄｉｃｕｍ能有效抑制该病　原茵，其中长枝木霉对病原菌茵丝的抑制效果最强，抑制率为７２．８１％，后２种的抑制率分别为　４９．１６％和４２．３６％。　关键词：樟子松赤枯病；病原茵；拮抗真菌；抑制率　中图分类号：￥７６３．１５文献标志码：Ａ文章编号：１６７１—０８８６（２０１７）０３—０００１—０４　

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉａ　ｒｅｄ　ｂ￣ｇｈｔ／ＸＵ　Ｙａｎｇ，ｅｔ　ａ１．（Ａｇｒｉ—　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，　ｙｉｎｉｎｇ　８３５０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｉｖｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｆｕｎｇｉ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｎｅｅｄｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃａ，ａｎｄ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　１　１　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｏ￣ｎｔｉａｌ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏ—　ｎｉｓｔｉｃ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｏｆ　ｒｅｄ　ｂｌｉｇｈｔ　ｉｎ　Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃａ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｏｎｆｒｏｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｃｒｕｅｎｔｕｍ　ａｎｄ　Ｃ．ｉｎｄｉｃｕｍ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ，ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｍ，　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｈｙｐｈａ，ｉｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　７２．８　１％，ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　Ｃ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ　ａｎｄ　Ｃ．ｉｎｄｉｃｕｍ，　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　４９．１６％ａｎｄ　４２．３６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃａ　ｒｅｄ　ｂｌｉｇｈｔ；ｐａｔｈｏｇｅｎ；ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ；ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｒａｔｅ　

樟子松Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃａ赤枯病在　世界广泛分布，主要危害杉、柏苗木及多种松树的针　叶，樟子松苗木和大树均可受害。何秉章…等人首　次在黑龙江省帽儿山林场的樟子松上发现病害症　状，经鉴定该病害由两种病原菌引起，即拟盘多毛孢　属Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ．和截盘孢Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ　ｓｐ．真菌。　近年来，随着樟子松栽植面积不断扩大，樟子松赤枯　病的危害越来越严重，不仅引起针叶枯死，树势减　弱，而且引起林产品品质下降，造成重大经济损失。　据王桂珍　调查，辽宁省沈阳东陵铁路林场一年生　樟子松苗发病率３０％以上，重者苗木枯死，对苗木　生产威胁很大。目前该病害主要靠化学防治来控　制，但因容易造成环境污染而受到限制，寻找科学的　防治方法是亟待解决的新问题。近年来随着防治技　术的迅速发展，森林植物病害的生物防治技术在生　产上受到广泛重视。以细菌、放线菌和真菌为生物　源的生物防治　，对土传病害、叶部病害和枝干病　害均取得了较好的防治效果。真菌病害生防制剂已　经开发成商品并大面积推广应用的有木霉，线虫病　害的生防菌有厚垣轮枝霉、淡紫拟青霉等。为寻找控　制樟子松赤枯病具有开发价值的生防菌株，作者进行　了从樟子松叶上分离并筛选拮抗菌株的研究。　

１材料与方法　１．１　供试材料樟子松赤枯病病原菌柠檬拟盘多　毛孢Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｃｉｔｒｉｎａ（ＭｅＡｉｐｉｎｅ）Ｎａｇ　Ｒａｊ从哈　尔滨帽儿山实习林场的樟子松病叶上分离得到，保　存于东北林业大学林学院森林病理实验室。植物材　

收稿日期：２０１６—０５—２５；修回日期：２０１６—０７—１５　基金项目：新疆兵团第四师科技项目（２０１６）“伊犁地区地下真菌的　筛选与块菌（松露）的引种栽培”　作者简介：徐阳（１９８８一），女，助理研究员，硕士，主要从事林果病虫　害及森林病理学方面的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：３１４７６２１４＠ｑｑ．ｃｏｍ　通信作者：刘雪峰，研究员，主要从事森林病理学及真菌分类方面的　研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｕｅｆｅｎｇ６３＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。　・２・　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｅｓｔ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｍａｙ　２０１７　Ｎｏ．３　料为帽儿山实习林场的樟子松１—３年生针叶。　ＰＤＡ培养基：马铃薯２００　ｇ，葡萄糖２０　ｇ，琼脂　２Ｏ　ｇ，水１０００　ｍＬ，ｐＨ自然，１２１　ｏＣ高压灭菌　３０　Ｉｎｉｎ［　。　

１．２叶栖真菌分离及纯化将健康的１年生、２年　

生和３年生樟子松针叶剪成０．５　ｃｍ左右的小段，用　纱布包起放入漂白粉（１：１４）消毒液中消毒３０　Ｓ，取　出用无菌水漂洗３次，用吸水纸吸干。接至ＰＤＡ培　养基上，每皿５段，放人２５℃培养箱中避光培养。　每个处理６次重复。　

分离率（％）＝　×１００　当接种材料周围生出明显的菌丝时，采用尖端　菌丝挑取法和单孢分离法　一　挑取形态不同的菌落，　接人ＰＤＡ培养基内，２０—２５℃避光培养。最后转到　ＰＤＡ斜面保存，用以进一步鉴定及后续试验。　１．３形态鉴定将分离、纯化所得的真菌接种在　ＰＤＡ培养基上，２５℃培养数日后，对已经产孢的真　菌，直接挑取孢子，制成水载片；产生子实体的真菌　做徒手切片，制成水载片；在显微镜下观察子实体、　分生孢子梗、产孢细胞以及孢子的形态特征，结合其　培养特性及菌落特征，参考相关真菌分类资料进行　形态学鉴定　。　１．４樟子松赤枯病病原菌的拮抗菌筛选　拮抗菌　株初筛采用平板对峙法¨　。将培养８　ｄ的病原菌、　１１种内生真菌，用７　ｍｉｌｌ打孔器切取等质量的菌饼，　采用两点对峙法，分别接至ＰＤＡ培养基的中心两　侧，两点相距４　ｃｍ，一侧接入病原菌，另一侧接入待　测的内生真菌菌株；以接７　ｍｍ的水琼脂的菌饼与　病原菌的为对照；放入２５℃培养箱中避光培养。每　个处理重复５次。２４　ｈ后测量，每２４　ｈ测量１次。　每日记录、观察ｌ１种待测菌株与病原菌的生长情　况。并分别测量记录内生真菌菌株指向病原菌的半　径、病原菌指向内生菌菌株的半径以及对照病原菌　的半径，５　ｄ后开始计算内生菌菌株对病原菌的抑　制率。若两菌落相交，要观察并记录内生真菌菌株　对病原菌的抑制、包围，以及病原菌对拮抗菌株包　围、侵占的反作用。抑菌率的计算公式如下：　相对抑菌率（％）＝（病原菌对照菌落半径一病　原菌菌落指向对峙菌的半径）÷病原菌对照菌落半　径×１００　被抑菌率（％）＝（拮抗菌菌落半径一与病原菌　对峙菌的趋向半径）÷拮抗菌菌落半径×１００　根据参考文献［１２］的拮抗系数、抑菌率和被覆　盖程度筛选出适合的生防菌株。拮抗系数的分级标　准见表１。　表１　拮抗系数的分级标准　级数　Ｉ　Ⅱ　Ⅲ　Ⅳ　Ｖ　分级标准　拮抗菌株菌丝占满平皿　拮抗菌株菌丝占平皿＞２／３　拮抗菌株菌丝占平皿＞１／３—２／３　拮抗菌株菌丝占平皿≤１／３　病原菌菌丝占满平皿　２结果与分析　２．１　叶栖真菌群落组成经形态学鉴定，从校园健　康樟子松针叶上分离到的叶栖真菌共２５种，其中，　子囊菌３种为血红毛壳Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｃｒｕｅｎｔｕｍ、印度　毛壳ｃ．ｉｎｄｉｃｕｍ和散囊菌Ｅｕｒｏｔｉｕｍ　ｓｐ．，接合菌１　种为根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｐ．，其余２１种为半知菌，以Ｐｅｎ—　ｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．，Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｐ．，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．瓤Ｐｅｓ—　ｔａｌｉｔｉｏｐｏｓｉｓ　ｓｐ．为优势种，分离率依次为１９．７％，　１５．２％，１５．５％和１０％，这些优势种在不同年龄的　针叶上分离频率差异较大（表２）。　表２樟子松叶栖真菌分离率　％　

注：一表示没有分离到该菌株。　樟子松针叶真菌群落物种较丰富，１年生的针　叶分离鉴定出真菌１２种，２年生针叶上的真菌１６　中国森林病虫　２０１　７年５月　第３６卷　第３期　种，３年生针叶卜的真　１８种　．　川年龄松针　Ｉ　菌组成和分离频率差异也较大，随苻针叶年龄增』Ｊｆ１　真菌种类增多。在不同年龄针叶　叶柄真菌　／ｆｒ　６种，占总数的２８％，为链格孢　、芽枝锩属、敞囊先　属、青霉属、拟青霉属和色串他　。共有　（种）链　格孢属、散囊壳属和色串孢属真闲随针叶年龄增大　分离率逐渐增大，　有属（种）肯撼和拟　多毛孢　的真菌随针Ｉ：Ｉｆ‘年龄增大分离剑的次数减少，共有　（种）芽枝霉属从针叶中分离到的次数ｌｆｔ大剑小依　次为：１年生，３年生，２年牛。１年、２年，　的针口ｆ一肯　霉属真菌排第１位，３年　的针ｆ叶拟青霉　真　排　第１位。　２．２拮抗真菌筛选　从分离、纯化的真　一＿｝１选…　１　１种真菌与樟子松赤枯病病原菌柠檬拟艇多毛孢　Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｃｉｔｒｉｎａ对峙培养，结果见　３。这１　１　种真菌对柠檬拟盘多毛他菌丝体均有　程度的抑　制作用，其中长枝木霭Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ　ＫＭ菌株３　ｄ后将病原菌完令役盖，完企【　领ｒ痫　原菌全部营养空问，拈抗系数和覆盖率都达到最商。　血红毛壳和印度毛先在４　ｄ后对柠檬拟艇多毛孢的　抑制作用逐渐增强，有明　的抑　带，川抑　牢、拈　抗系数和覆盖率３个指标米评价　札红毛先ＩＺ￣Ｉ］度毛　壳的抑菌效果更叫妊．．散囊　属Ｅｕｒｏｔｉｕｍ　ｓｐ．　Ｉ链　格孢属Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ　ｓｐ．小但对柠檬拟髓多毛孢产ｔｔ　・３・　拈抗作川较小，反而被柠檬拟盘多毛孢所抑制，说明　这　种生防菌没有抑制病原菌的作用，反而能在一　定程度一Ｉ　促进病原菌菌丝的生长。在柠檬拟盘多毛　他的ｆ｛我埘峙中，发现柠檬拟盘多毛孢并没有相互　融合，而足自我抑制，出现明显的抑菌带，并且抑制　效果也卡Ｈ对较为明显。而青霉Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．、拟盘　多毛孢Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ．、茎点霉Ｐｈｏｍａ　ｓｐ．、枝顶孢　Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．、鹰壳孢Ｄｉｃｈｏｍｅｒａ　ｓｐ．和盾壳霉　Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ　ｓｐ．埘柠檬拟盘多毛孢的抑制效果不　【９】　，抑菌率较低。　表３拮抗菌株与樟子松赤枯病病原菌对峙培养　８　ｄ的抑菌率、覆盖程度