猪胰蛋白酶地分离纯化与鉴定

猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

一、实验目的

1、掌握等电点沉淀、盐析及离子交换层析原理及操作。

2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程。

3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。

二、实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

猪胰蛋白酶的分子量约为23400，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，胰蛋白酶在pH3条件下较稳定，在pH5以上易自溶，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。

本实验以猪胰脏为材料，首先用酸性水溶液抽提组织，在Ca2+离子存在条件下，以少量胰蛋白酶结晶激活所得的酶原，再以硫酸铵盐析获得粗胰蛋白酶。经过透析除盐，以羧甲基纤维素柱阳离子交换层析进行纯化，即可获得较纯的胰蛋白酶。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收值做对照，根据酶活力蛋白的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在280nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。

三、试剂和器材

1、试剂：

（1）pH2.5乙酸酸化水：在酸度计监测下，向蒸馏水中加入乙酸，使pH达2 .5。（2）10%（V/V）HAc 溶液

（3） 2.5 mol/L H

2SO

4

（4）5 mol/L NaOH

（5）2 mol/L HCl

（6）0.001 mol/L HCl

（7）0.01 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取41mL 0.01mol/L柠檬酸溶液（2.10 g H

3C

6

H

5

O

7

·H

2

O/L），

加入59 mL 0.01mol/L柠檬酸钠溶液（2.9 g Na

3C

6

H

5

O

7

·2H

2

O/L）混匀，

用酸度计检查pH值是否为5.0。

（8） 0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取8.2 mL 0.05mol/L柠檬酸溶液（10.5 g H

3C

6

H

5

O

7

·H

2

O/L），

加入11.8 mL 0.05mol/L柠檬酸钠溶液（14.705 g Na

3C

6

H

5

O

7

·2H

2

O/L）

混匀，用酸度计检查pH值是否为5.0。（9） 0.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取19 mL 0.1mol/L柠檬酸溶液（21 g H

3C

6

H

5

O

7

·H

2

O/L），

加入81 mL 0.1mol/L柠檬酸钠溶液（29 g Na

3C

6

H

5

O

7

·2H

2

O/L）混匀，

用酸度计检查pH值是否为6.0。

（10） 8％三氯乙酸

（11） 10 mg/mL酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加13 mL 0.5 mol/L NaOH溶液, 0.1 M Tris－HCl缓冲液，pH8.0 40 mL，置85℃水浴加热至溶解，放至室

温后，加上述缓冲液40 mL,用1 N HCl小心调pH为8.0，用缓冲液定

容至100 mL。

（12）不同pH值缓冲液的的配制

Ⅰ 0.1 M磷酸缓冲液：pH6.0、6.5、7.0、7.5

a.0.1 M磷酸氢二钠的配制:

称取Na

2HPO

4

·12H

2

O（358.14 g/mol） 17.9070 g

加水定容至 500 mL b.0.1 M 磷酸二氢钠的配制:

称取 NaH

2PO

4

·2H

2

O (156.01 g/mol） 7.8005 g

加水定容至 500 mL

c.二者互兑至相应pH值

Ⅱ 0.1 M Tris－HCl缓冲液：pH8.0、8.5、9.0

称取Tris 12.11 g

加入水 60 mL

用3N HCl调至所需pH

加水定容至 100 mL

Ⅲ 0.1M NaCO

3－NaHCO

3

缓冲液：pH9.5、10.0、10.5

a. 0.1M NaCO

3

的配制：

称取 NaCO

3

5.2995 g

加水定容至 500 mL

b.0.1M NaHCO

3

的配制：

称取 NaHCO

3

4.2005 g

定容至 500 mL

c. 二者互兑至相应pH值

（13）SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）所需试剂(无需配制)

① 30%储备胶溶液：将29.0g丙烯酰胺（Acr）和1.0g N-N′亚甲双丙

烯酰胺（Bis）溶于60 mL水中，于37℃溶解，

定容至100 mL, 棕色瓶存于室温。

② 1.5 mol/L Tris－HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH

2

O溶解, 浓盐

酸调pH至8.8，定容至100 mL。

③ 1.0 mol/L Tris－HCl(pH 6.8)： Tris 12.11 g加ddH

2

O溶解, 浓

盐酸调pH至6.8，定容至100mL。

④ 10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH

2

O 68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，