蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)
蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定
蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定蛋白质是一个关键的生物分子，是所有生命活动的重要组成部分。
它们由氨基酸组成，在细胞内负责许多生物功能，如构建细胞结构、代谢、信号传递和基因表达调节。
正因为如此，对蛋白质复合物的研究和分析，对于广泛的生物医学领域都有着极其重要的意义。
蛋白质复合物是由两个或多个蛋白质相互结合而成的复合物。
在生物系统中，不同的蛋白质通过相互作用或结合形成复合物，然后再与其他生物大分子分子（如核酸，碳水化合物等）进一步相互作用。
因此，蛋白质复合物的功能相对于单独的蛋白质单元，具有更高的特异性和活性。
然而，要研究和分析这种复杂的物质，需要提取、分离、纯化和鉴定它们的化学结构。
这里我们来介绍蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定方法。
蛋白质复合物分离纯化的方法分离纯化蛋白质复合物需要采取一系列方法，这些方法包括离心、柱层析、电泳、质谱等。
这些方法不仅能对蛋白复合物进行有效的分离纯化，而且能够提供关于蛋白复合物结构和功能的详细信息。
离心离心是利用重力作用将不同大小的颗粒分离开的一种方法。
这个原理也可以用于分离不同大小的蛋白质复合物。
采取极高速度离心的形式，离心能够快速分离出高度纯化的复合物，以便进行后续分析。
然而，该方法的限制在于它仅能分离基于大小差异的蛋白质复合物。
柱层析柱层析是一种利用化学性质或大小/形状差异区分蛋白质的方法。
常用的柱层析包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析和尺寸排斥层析等。
其中凝胶层析是一种分离蛋白质的最常用方法。
它是通过将样品在列有多种聚合物（如凝胶、聚丙烯酰胺等）的柱上运行，使蛋白质基于他们的大小差异，以一定的速率向下流动，根据质量、形状、电荷或亲和力进行分离。
电泳电泳是一种通过在电场中将分子带动移动，根据它们的电荷和分子重量分开的方法。
离子电泳和凝胶电泳是最常用的两种电泳方法。
离子电泳利用离子的运动在不同的pH值下移动的速度承载的差异来分离分子。
凝胶电泳则是将样品分离到高聚合物凝胶上，并使用电场将它们从凝胶带到电极上的一种分离方法。
第二章 蛋白质分离纯化技术(2)
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
温度
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
7.8 93.8
101
1）硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类
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2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫 酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂 蛋白，纯度提高了四倍。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白 质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降 解作用。
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5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
1) 盐浓度（即离子强度）：
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋 白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在 纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增 加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的 活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了 溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
不稳定蛋白颗粒
蛋白质复合物的提取与鉴定方法综述
蛋白质复合物的提取与鉴定方法综述蛋白质复合物是由两个或多个蛋白质相互作用形成的具有特定功能的非共价结构。
在细胞中，蛋白质复合物扮演着关键的结构和功能角色，它们通过与其他分子相互作用，调节各种生物进程，如代谢、信号传递和运动等。
因此，提取和鉴定蛋白质复合物的方法对于了解其生物学功能、研究相关疾病以及开发新的治疗方法具有重要意义。
本文将从提取和鉴定两个方面对蛋白质复合物的研究方法进行综述。
一、蛋白质复合物的提取方法1. 离心法离心法是一种最常见的蛋白质复合物提取方法。
它通过高速离心来分离不同分子量的蛋白质和蛋白质复合物。
和单个蛋白质不同，蛋白质复合物由于其分子量较大，相对分子量大于100 kDa，通常需要较高的离心速度和长时间离心以保持完整性。
此外，离心法还可以通过在梯度离心中分离不同组分的形式提取蛋白质复合物。
2. 亲和层析法亲和层析法是一种利用某些化学分子与蛋白质复合物特定结构的相互作用来分离和纯化蛋白质复合物的方法。
例如，抗体与相应的抗原结合，亲和树脂与诱导因子相互作用等。
这种方法通常需要先进行预处理，将所需的组分（例如诱导因子）与标记（例如荧光染料）相结合，以便在后续层析过程中进行检测。
3. 摩擦法摩擦法通常用于大量提取蛋白质复合物。
该方法基于蛋白质复合物在特定条件下的高亲和力，如酶和血红蛋白的相互作用。
摩擦法在样品中添加专门的摩擦液，并通过重复离心和平衡来分离蛋白质复合物。
二、蛋白质复合物的鉴定方法1. 常规SDS-PAGE和蛋白质标记法常规SDS-PAGE通常用于鉴定蛋白质复合物的组成，SDS-PAGE将蛋白质分离成单个蛋白质単体，这样便于通过其他方法确认特定的蛋白质。
使用蛋白质标记法可以在蛋白质上标记某个特定分子（如荧光染料）来检测其存在和定位。
2. 其他电泳技术在常规SDS-PAGE之外，电泳技术有很多变形，如双向电泳和脂肪酸-乙酰化。
一般而言，这些技术都可以用于鉴定蛋白质复合物的组成和酶活性。
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
实验二蛋白质的分离与鉴定
四、操作步骤
4.1 植物组织蛋白质提取方法 1）根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取 液，可根据材料不同适当加入），准备提 取液放在冰上。 2）把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后 加入提取液中在冰上静置（2-3小时）。 3）用离心机离心8000rpm 40min 4℃ 或 11100rpm 20min 4℃ 4）提取上清液，样品制备完成。
生物技术综合实验
实验二 蛋白质的分离与鉴定
一、目的和要求
1、掌握细胞蛋白质分 离的方法。 2、了解蛋白质的性质。
二、实验原理
1.
蛋白质的提取与纯化
蛋白质是两性电解质，在不同的pH条 件下所带电荷不同。在一定的电场条件下 蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向 移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷 的 数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动 的越远。
通过本试验，熟悉蛋白质的提取及检测 方法，尤其可以结合生物化学的方法进行 定性检测。
七、思考题，完成实验报告
1．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲
反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出 什么结论? 2．能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的主要试剂 1、 蛋白质提取液：300mL （1） 1M Tris-HCl（PH8）45mL （2）甘油（Glycerol）75mL （3）聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 2、 10%NaOH溶液。 3、 1％CuSO4。 4、考马斯亮蓝染液300mL
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子
脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得 到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类 化合物都有双缩脲反应。
分离纯化蛋白质的方法及原理
体育委员述职报告合集七篇体育委员述职报告篇1尊敬的老师、同学们：我是法学__班体育委员__，今天在这里向大家述职。
大一上学期转瞬即逝，担任法学__班体育委员一个多学期以来确实学到了不少东西。
在辅导员的带领、其他班委的协助还有全班同学的支持下，我能够成功的搞好班级的各项体育活动，帮助同学们进行适当地锻炼，让大家以积极地心态、饱满的热情投入到工作和学习中。
下面汇报我担任体育委员以来开展的工作：第一，组织班级同学积极备战学校举办的运动会。
为了我们进入大学的第一个运动会也是进入大学以来的第一个校级活动，首先，我积极向同学们宣传参加体育活动的益处，号召大家踊跃报名参加。
其次，及时向同学们下达院内对备战运动会的各项通知，做好同学与院内的沟通桥梁。
另外，带领同学们进行赛前训练。
通过20多天的努力，由于一些客观因素虽然虽然我们无法在一些单项上获得荣誉，但是我们的团体项目成绩喜人；虽然我们不能取得第一，但是这段日子让我们的友谊更加坚固。
这项活动不仅增强了同学们的身体素质而且还增强了班级同学之间的凝聚力，而且使同学们的眼界开阔了许多，认识到了许多东西比如团队合作精神，如何使一个团队走向成功。
第二，配合院学生会，以班级为单位开展“法学杯”篮球联赛。
通过这次活动不仅激发了同学们的篮球热情，使我们的班级更加团结，还使我们和我们的对手即我们的学长们就建立了不错的友谊。
第三，协助其他班委开展其他班级活动。
本学期以来，我们班举行了两次班级聚会，即一次班级聚餐和还有一次“庆圣诞，包饺子”活动，这两次聚会让同学们深刻体会到法学1103班如家般的温暖。
另外，我们班在院里举行的“魅力班级“评比活动中也获得了不错的奖项，让我们充满了集体荣誉感。
当然在以上开展的工作中我也有很多不足的地方。
首先号召力还不强，比如在各项活动的报名中，不能激发同学们的参加热情，有的同学还是对参加集体活动不感兴趣。
其次，工作中存在一些失误，例如第一次运动会赛前训练时，没把人员及时通知到位，造成训练延误。
trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
TRNA结合蛋白质的分离、纯化和鉴定是一个复杂的过程，需要涉及许多技术和实验步骤。
以下是一般的实验流程：
1. 细胞培养和TRNA结合蛋白质提取：首先，需要选择一种可供TRNA结合蛋白表达的细胞。
表达TRNA结合蛋白的细胞可以通过病毒转染、质粒转染或基因编辑等方法获得。
然后，需要经过一系列的细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取的步骤，获得含有TRNA结合蛋白的蛋白提取物。
2. 蛋白质组学分析：使用蛋白质组学技术如SDS-PAGE、2D-PAGE等，可以对提取物进行蛋白质分析，并定位TRNA结合蛋白的位置。
3. 亲和层析纯化：从蛋白提取物中纯化TRNA结合蛋白，可以使用亲和柱层析技术。
通常，这种方法是基于TRNA分子与TRNA结合蛋白具有特异性相互作用的原理，通过对纯化物进行一系列精简的层析、洗脱和再结晶等步骤，纯化出TRNA结合蛋白。
4. 电泳分离和氨基酸测定：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化的TRNA结合蛋白进行分离。
分离出的蛋白质可以通过氨基酸测定，获得每个氨基酸残基的位置和序列。
5. 质谱分析：使用质谱技术，可以用于分析TRNA结合蛋白的完整的序列和特
定结构。
通过使用MALDI-TOF质谱、毒蕈碱胶板电泳或其他质谱技术，可以得到蛋白质的分子质量、残基序列等信息。
6. 功能分析：最后，通过功能实验，可以确定TRNA结合蛋白通过哪些方式与其靶标mRNA或其他蛋白分子相互作用，并参与哪些细胞生物学或生物化学过程中。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
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蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二）
一、层析技术
1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。
如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。
然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。
注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。
2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。
这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。
用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。
注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。
该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。
将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。
洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。
要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。
3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。
构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。
然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。
然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。
4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。
“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
柱上的时间越长。
反相层析则在固相表面引入不同长度的烷基(C4，C8，C12，C18)，使固相表面呈疏水性，烷基与被分离的化合物表面的疏水基团相互作用。
不同的蛋白质分子表面的疏水基团量和空间分布不同，因此不同蛋白质的疏水性不同，疏水性越强，在反相柱上的滞留时间越长，疏水性越弱，在反相柱上的滞留时间越短。
用反相层析技术可将疏水性不同的蛋白质分开。
反相层析的分辨率非常高，若不考虑蛋白质的活性，反相层析是非常有效的分离和纯化的手段。
反相层析技术也可用于鉴定蛋白质纯度。
反相层析技术串联质谱是当今鉴定蛋白质分子的重要手段。
要注意的是，该技术对样品的制备要求非常高，样品必须是纯净无颗粒物，样品制各的质量直接影响分离，若样品制备差，会直接损毁柱子；要考虑反相柱的孔径(pore size)，选择适合分离蛋白质的反相柱。
二、电泳分离技术
1.SDS-PAGE常用于鉴定蛋白质的纯度和分子量，也可用于蛋白质的纯化。
SDS-PAGE凝胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。
浓缩胶的作用是将样品中的蛋白质压成个薄层，分离胶将各种分子量不同的蛋白质分开。
SDS带负电，当SDS与蛋白质混合后，SDS与蛋白质分子结合形成复合物，复合物中SDS 所带的负电荷大大超过了蛋白质分子所带的电荷，因此在电泳时，蛋白质电泳速率与蛋白质分子量的对数成反比，而蛋白质所带电荷对电泳速率的影响可忽略不计。
SDS-PAGE的分辨率非常高。
该技术要注意4点：
①配胶时，所有溶液都要脱气。
丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的交联需要自由基的催化，自由基由过硫酸铵和TEMED(四甲基乙二胺)产生。
空气中的氧气可有效清除由过硫酸铵和TEMED产生的自由基，因此抑制丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺的多聚化(polymerization)。
不脱气也将导致凝胶质量的批次间差异。
②SDS的质量非常重要，SDS中的不纯物(C10，C14，C16 alkyl sulfate)可导致一个蛋白质形成多个条带。
③SDS不要过量，如30～50μl样品中SDS量不要多于200μg，不然蛋白质的条带会变宽，影响分辨率。
④过硫酸铵不稳定，需在使用前配制。
2.等电聚焦蛋白质是两性电解质，当某个蛋白质在某一pH值时，其所带正电荷和负电荷数相等，净电荷为零，这一pH值就是该蛋白质的等电点。
各种蛋
白质的碱性和酸性氨基酸残基的量存在差异，这种差异导致蛋白质的等电点不同。
根据这一特性可将等电点不同的蛋白质用等电聚焦方法分离。
IEF也可用于分离修饰与否的蛋白质，如蛋白质可被磷酸化(加入电荷)、乙酰化(中和电荷)，IEF可将修饰与否的蛋白质分离开(反相层析法也可以)。
IEF对样品的制备要求是，要预防同种或不同种蛋白质形成蛋白复合物，尽可能去除样品中的非蛋白质离子。
在分离和鉴定复杂的蛋白质成分时(如细胞裂解液)，常常用双向电泳，第一向是IEF，将不同等电点的蛋白质分离，与之垂直的第二向是SDS-PAGE，按分子量将蛋白质分离。
双向电泳可以将细胞中的蛋白质分离成数千个组分，对分离到的蛋白质组分做质谱分析，可快速鉴定蛋白质的身份。
注意，分离到的组分不。
定代表单个蛋白质。