甘油菌制备方法
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
第3讲 基因工程菌的鉴定与保存
从上述可以看出，基因工程菌种的 保存方法，主要是：
A：冷冻真空干燥保藏法
B：甘油悬液低温保藏法
C：斜面低温保藏、酵母菌、 芽胞杆菌等可不可以用上述保藏方法? 还有没有其它的保藏方法?
Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery
一、基因工程菌的鉴定
1、个体形态鉴定——革兰氏染色观察 如：重组大肠杆菌
个体形态：镜检细胞形状、 大小、排列，革兰氏染色反 应，运动性，鞭毛位置、数 目，芽孢有无、形状和部位， 荚膜，细胞内含物；
工程菌光学显微镜检查 （放大1000倍）
基因工程菌的三级种子库的建立： 1、一级种子库 2、二级种子库 3、三级种子库
1、一级种子库——原始种子库（冻干工程菌株）
冻干工程菌株是在选取最优（表达高、传代稳定、 无污染）工程菌后，为了长期保存此工程菌而制备的保 存菌株。冻干菌株制备好后放在-70℃冰箱中保存，有效 使用期为15年。
注意：冻干菌主要用于菌株的长期保存，不能直接使 用，必须先在平板上进行筛选或复壮后，才能使用。 经平板复壮、鉴定后，制备甘油菌，作为生产菌株。
2、二级种子库——生产菌株（甘油菌）
甘油菌为较长期保存菌株用。甘油菌制备好后放在冰箱20～-70℃温度区保存。有效使用期为1年。
注意：在各类摇瓶或表达试验中，甘油菌必须先经过 菌株复壮才能够使用。
3、三级种子库——实验用菌株（平板菌）
平板菌为短期保存菌株用。平板制备好后放在冰箱 4℃温度区保存。有效使用期为15天。
2、菌落形态特征
在含抗生素的固 体培养基平板上生 长，观察菌落性状 （形状、光泽、透 明度、颜色、质地 等）。
检验用菌种管理制度
检验用菌种管理制度编制人/日期：审核人/日期：批准人/日期：修订页目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 程序 (4)5. 相关文件 (11)6. 记录表样 (11)1.目的规范公司微生物实验使用的检验用菌种的管理。
2.适用范围适用于检验用菌种的管理，包括菌种的采购，保存，传代，使用及销毁。
3.职责检验员负责本制度的执行。
质管部负责人对检验员的实际执行情况进行监督。
4.程序4.1菌种的定义4.1.1标准菌种指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌；4.1.2 传代用菌种指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种；4.1.3工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面、半固体培养基培养后，作为日常工作使用的菌种。
工作用菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌种为第0代）；4.1.4本文中检定菌种包括传代用菌种和工作用菌种。
4.2菌种的采购和验收4.2.1微生物检测人员根据菌种的使用情况，提出年度购买计划，交质管部经理审批；4.2.2向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数；4.2.3菌种到达实验室后，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌种接收记录》，并将其暂贮存于2-8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
4.3菌种的保存4.3.1 斜面低温保存法操作方法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2-8℃冰箱中；4.3.2半固体石蜡低温保存法操作方法：将菌种穿刺接种到硫乙醇酸盐流体培养基中，待菌生长充分以后，经培养箱培养后取出，用无菌液体石蜡滴加到半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度,转移至2-8℃冰箱中；4.3.3 甘油冷冻管保存法操作方法：4.3.3.1用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的0.9%无菌生理盐水；4.3.3.2调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌含20%甘油的0.9%无菌生理盐水，即为10%甘油菌悬液；4.3.3.3轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，转移至-20℃冷冻条件下；4.3.4各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1表1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限4.4标准菌种的复苏和确认4.4.1标准菌种的复苏4.4.1.1在生物安全柜内用75%的酒精擦拭冻干菌种管（安瓿）的外表面并让其自然风干。
甘油的检测方法汇总
甘油的检测方法汇总在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程菌的发酵密度，提高产品生产率的关键。
在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一。
此外，甘油能与水结合以防止红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等。
由于甘油用途很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。
目前国内外甘油含量的测定方法较多，主要有高碘酸氧化法、Cu2 +络合比色法、酶比色法法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法以及原子吸收法等。
下面将对其进行简要概述：1、 高碘酸法1.原理：高碘酸氧化法是目前常见用于甘油含量检测的方法，利用高碘酸与甘油发生氧化还原反应，剩余高碘酸及反应生成的碘酸与碘化钾反应生成碘，再用硫代硫酸钠进行滴定，根据消耗的硫代硫酸钠的量来计算甘油的含量。
2.操作步骤准确发酵液10ml于100mL小烧杯中，加少量水溶解，然后转移至100mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，静置。
用移液管准确移取10mL上述溶液于碘量瓶中，加入20mL高碘酸钠溶液，混合均匀后，于黑暗中避光静置40min，然后加入碘化钾溶液和20%盐酸溶液各15mL，调节pH值在0.8～1.0之间，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定，近终点时，加入2mL淀粉指示剂溶液，继续滴定至溶液蓝色消失。
同时做试样空白。
3.计算：式中：w——样品中甘油的含量，％；V1——空白试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；V2——试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；C——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol／L；M——甘油相对分子质量；2、 酶比色法1.原理：它是利用酶的特异性催化反应建立的测定甘油的一种酶学方法，是指甘油在甘油激酶作用下转化为3-磷酸甘油，后者由磷酸甘油氧化酶催化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，然后过氧化氢和4-氨基安普比林、4-氯酚在过氧化物酶催化下反应生成紫兰色、能在500 nm 左右有特征吸收峰的醌亚胺，通过颜色深浅即吸光度的变化测定所生成的H2O2，甘油的含量与生成的H2O2成正比，这样用比色法就可以测定甘油的含量。
菌种传代标准操作规程
文件制修订记录1.1原则1.1.1检定用标准菌种，按照规定选购辽宁省药品检验所提供的菌种。
1.1.2应按照现行版中国药典附录传代和制备。
1.2标准菌种的制备1.2.1菌种的复苏1.2.1.1准备适宜各种菌种生长的液体培养基和培养设备及操作器具。
1.2.1.2把购入的冻干粉菌种管，灭菌后的器具、1ml吸管、双碟、营养肉汤，改良马丁培养基等移入阳性对照室中的生物安全柜中。
1.2.1.3先用砂轮将冻干粉菌种安瓶颈部上三分之一处挫出刻痕，再将冻干粉菌种管外壁用75%酒精棉擦洗消毒、稍干，放在灭菌双碟内，点燃酒精灯，用干燥的无菌纱布包裹安瓶，在火焰旁将其掰开。
放入灭菌双碟内，取一支1ml吸管，在火焰旁吸取营养肉汤（或改良马丁培养基）0.5-0.8ml，加至菌种管底部并吹打，将冻干粉菌搅动，促使溶解，制成菌悬液，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤（或改良马丁培养基）试管内。
并将吸管及菌种瓶，投入消毒液内。
将已接种的营养肉汤（或改良马丁培养基）试管置于30-35℃或23-28℃培养22-24h。
（为第一代）1.2.2菌种的纯度和特性确认1.2.2.1取出培养物，肉眼观察试管变浑浊。
确认有菌种生长繁殖。
1.2.2.2将上述增菌液，再进行第二次移种。
接种至3支营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面上，置30-35℃（或23-28℃）培养22-24h。
（为第二代）1.2.2.3取出斜面培养物，每个品种各用一支进行纯度和特性确认，仔细观察菌落形态，有无杂菌，涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，可制成甘油冷冻管（第二代）或移种（第三代）即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2.2.4各种典型菌落特性见附件-I1.2.3标准储备菌种甘油冷冻管的制备（第二代）1.2.3.1准备20%甘油及冷冻管和各操作用具。
1.2.3.2取经纯度确认后的第二代菌斜面，用无菌接种环轻轻刮取菌苔。
放入装有无菌纯化水的试管中，通过接种环与试管璧之间的轻轻摩擦，使细菌充分扩散到无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中，加入等体积浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液，轻轻振摇试管，使内容物充分混合，分装于无菌冷冻管中，拧紧菌种冷冻管的盖子。
菌种保存方法-
菌种保存⽅法-菌种保存⽅法：⼀.菌种保藏⽅法⼤致可分为以下⼏种：1．传代培养保藏法⼜有斜⾯培养、穿刺培养、疱⾁培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌⽤），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体⽯蜡覆盖保藏法是传代培养的变相⽅法，能够适当延长保藏时间，它是在斜⾯培养物和穿刺培养物上⾯覆盖灭菌的液体⽯蜡，⼀⽅⾯可防⽌因培养基⽔分蒸发⽽引起菌种死亡，另⼀⽅⾯可阻⽌氧⽓进⼊，以减弱代谢作⽤。
3．载体保藏法是将微⽣物吸附在适当的载体，如⼟壤、沙⼦、硅胶、滤纸上，⽽后进⾏⼲燥的保藏法，例如沙⼟保藏法和滤纸保藏法应⽤相当⼴泛。
4．寄主保藏法⽤于⽬前尚不能在⼈⼯培养基上⽣长的微⽣物，如病毒、⽴克次⽒体、螺旋体等，它们必须在⽣活的动物、昆⾍、鸡胚内感染并传代，此法相当于⼀般微⽣物的传代培养保藏法。
病毒等微⽣物亦可⽤其他⽅法如液氮保藏法与冷冻⼲燥保藏法进⾏保藏。
5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、⼲冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
常⽤的有⽢油菌保存：取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%⽢油的加⼊量，保存零下80度。
例：取37°培养过夜的菌液2-4ml⽢油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。
6．冷冻⼲燥保藏法先使微⽣物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利⽤升华现象除去⽔分（真空⼲燥）。
有些⽅法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻⼲燥保藏法等均需使⽤保护剂来制备细胞悬液，以防⽌因冷冻或⽔分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离⼦键对⽔和细胞所产⽣的亲和⼒来稳定细胞成分的构型。
保护剂有⽜乳、⾎清、糖类、⽢油、⼆甲亚砜等。
⼆.常⽤的器材所要保存的微⽣物；⾁膏蛋⽩胨斜⾯培养基，灭菌脱脂⽜乳，灭菌⽔，化学纯的液体⽯蜡，⽢油，五氧化⼆磷，河沙，瘦黄⼟或红⼟，冰块、⾷盐，⼲冰，95％酒精，10％盐酸，⽆⽔氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养⽫，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40⽬与100⽬筛⼦，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），⼲燥器，真空泵，真空压⼒表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
缺陷假单胞菌使用说明
缺陷假单胞菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00180
缺陷假单胞菌
基 本 信0ul 甘油菌
培养方式 28℃，有氧
保存方式 30%甘油，-‐80℃
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。
轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌 株 复 壮 ：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸
取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增
加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落
进行后续操作。
华越洋生生物提供 QQ: 1733351176
正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程
菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种.➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种.➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代.4、职责4。
1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁.5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后,向中检所菌种保藏中心或省（市)药检所购买冻干菌种(标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
5。
2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量,以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括:名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种.5。
3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌:每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
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creating bacterial glycerol stocks for long-term storage
of plasmid
background information
bacterial glycerol stocks are important for long-term storage of plasmids. although you can store
your plasmid DNA at -20°C, many labs also create bacterial glycerol stocks of their plasmids. This
way, when you want to make more plasmid DNA, the plasmid will already be in your desired
bacterial strain and you will not need to obtain more competent cells and retransform.
Bacteria on an LB agar plate can be stored at 4°C for a few weeks. However, if you want to store
bacteria for a longer time, you will need to establish glycerol stocks. The addition of glycerol
stabilizes the frozen bacteria, preventing damage to the cell membranes and keeping the cell alive.
A glycerol stock of bacteria can be stored stably at -80°C for many years.
Protocol
1. Follow the steps for inoculating an overnight liquid culture.
2. After you have bacterial growth, add 500 μL of the overnight culture to 500 μL of 50%
glycerol in a 2 mL screw top tube or cryovial and gently mix.
3. Freeze the glycerol stock tube at -80°C. The stock is now stable for years, as long as it is kept
at -80°C.
Note: Make the 50% glycerol solution by diluting 100% glycerol in dH2O.
Note: Snap top tubes are not recommended as they can open unexpectedly at -80°C.
4. To recover bacteria from your glycerol stock, open the tube and use a sterile loop, toothpick or
pipette tip to scrape some of the frozen bacteria off of the top. Do not let the glycrol stock
unthaw! Streak the bacteria onto an LB agar plate. Grow your bacteria overnight, and the next
day you will be able to start an overnight culture for plasmid DNA prep the following day.
Tips and FAQ
The optimal concentration of long-term glycerol storage is unknown. Most labs store bacteria
in 15-25% glycerol.
You can prepare the glycerol stock the same time you prepare your plasmid DNA. In the
morning, when you retrieve your liquid bacterial culture, take 500μL of culture to make your
glycerol stock before you begin your plasmid mini-prep.
Try not to freeze/thaw your glycerol stock too many times. Placing the glycerol stock on dry
ice while streaking onto LB agar will prevent it from thawing completely and will improve
the shelf life.
It is very important that you shake the glycerol before freezing (5-6 times). Make sure that
you see one uniform solution, and there are no layers present.
Be sure to label both the lid and the tube of a glycerol stock before you place the sample at
-80°C. Frozen tubes are hard to write on and samples stored for long periods at -80°C can
lose labels stuck to tube!