甘油菌活化和质粒提取
菌种保存大家谈。甘油的浓度。
菌种保存大家谈。
甘油的浓度。
2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。
因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
不适合酷友频繁的求助菌种。
我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。
就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。
质粒抽提原理及详细操作步骤精编版
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
质粒提取与分析 Protocol
质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。
下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。
质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。
o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。
o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。
o70%乙醇。
o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。
2.耗材：o移液器。
o离心管和离心管盖。
o 1.5ml微量移液器。
o无菌水。
o0.22μm滤膜。
o培养板和涂布器。
o细菌培养液（如LB液体培养基）。
o氯仿。
o异戊醇。
三、实验仪器1.实验室搅拌器。
2.高速冷冻离心机。
3.水浴锅。
4.无菌工作台或超净工作台。
5.紫外线分光光度计。
6.电泳仪和电泳槽。
7.显微镜。
8.恒温摇床或振荡器。
9.烘箱或微波炉。
10.量筒和烧杯。
11.计时器。
12.手套和实验服。
四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。
甘油菌菌种活化步骤,甘油菌怎么保存
甘油菌菌种活化步骤，甘油菌怎么保存1、LB培养基制备：准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加入800ml去离子水，拌匀，直至完全溶解，然后用0.2ml氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4，并加入1L去离子水，高压蒸汽灭菌。
2、倒平板：培养基放置在60°C水浴锅中保温，取出后，轻轻转动培养基，让琼脂分布均匀。
一、甘油菌菌种活化步骤1、LB培养基制备（1）准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后加入800ml去离子水，搅拌均匀，直至完全溶解，接着使用0.2ml的氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4左右，并加入1L的去离子水，高压蒸汽灭菌20分钟左右。
（2）在高压灭菌之前，应当加入15g/L（铺制平板用）或7g/L （配制顶层琼脂糖用）的琼脂糖。
2、倒平板（1）超净台、接种环、培养皿，酒精灯等用紫外线灭菌30分钟左右。
（2）高压灭菌后的培养基放置在60°C的水浴锅中保温，等到溶液尚未冷却的时候，将培养基取出，轻轻转动，让琼脂均匀分布在培养基溶液中。
（3）等到冷却至50°C的时候，在超净台中加入抗生素，并旋转将培养基混合均匀，然后从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
（4）将甘油菌冻存管放在冰上，直接用接种环在冻存管内的冰渣上蘸一下，然后涂上平板。
3、大量培养（1）将冷藏的液态培养基重新高温高压灭菌，等到冷却至50°C 的时候，加入抗生素，接着将菌落挑至已经加入抗生素的液态培养基中（2-5ml），37°C，200rpm培养8小时左右。
（2）按照1：500-1000的比例，将添加了抗生素的液态LB培养基稀释上一步骤所得菌液（20-25μL菌液+25ml液态LB培养基），37°C，200rpm培养12-16小时。
二、甘油菌怎么保存1、如果是20%甘油保存菌种（甘油：菌液=20：80），一般放置在零下70°C的环境下保藏。
质粒提取的原理
质粒提取的原理
质粒提取是分子生物学实验中常见的一项基本操作，它是指从
细菌中提取出质粒DNA的过程。
质粒是细菌细胞内的一种环状DNA
分子，它可以携带一些特定的基因，如抗性基因、荧光标记基因等，因此在基因工程和分子生物学研究中具有重要的应用价值。
质粒提
取的原理主要包括裂解、沉淀、洗涤和溶解等步骤。
首先，裂解是质粒提取的第一步，它的目的是破坏细菌细胞壁
和细胞膜，释放细胞内的质粒。
常见的裂解方法包括物理方法和化
学方法。
物理方法主要是利用高温、高压或超声波等手段破坏细胞
结构，使质粒DNA得以释放。
化学方法则是利用表面活性剂或蛋白
酶等化学试剂破坏细胞膜，使质粒DNA暴露在溶液中。
接着是沉淀步骤，通过离心或其他方法将裂解后的细胞碎片和
蛋白质沉淀下来，而质粒DNA则保持在上清液中。
这一步骤的目的
是去除细胞残渣和蛋白质，纯化质粒DNA。
然后是洗涤步骤，将沉淀下来的细胞碎片和蛋白质用洗涤缓冲
液洗涤，去除残留的污染物，进一步提高质粒DNA的纯度。
最后是溶解步骤，将经过洗涤的质粒DNA用适当的缓冲液溶解，得到质粒DNA的溶液。
溶解后的质粒DNA可以用于后续的分子生物
学实验，如PCR扩增、酶切、连接等。
总的来说，质粒提取的原理是通过裂解、沉淀、洗涤和溶解等
步骤，将细菌中的质粒DNA提取出来并纯化，为后续的分子生物学
实验提供高质量的DNA样品。
掌握质粒提取的原理对于分子生物学
实验具有重要的意义，能够有效地提高实验的成功率和结果的准确性。
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质粒小提步骤[推荐]
![质粒小提步骤[推荐]](https://img.taocdn.com/s3/m/c8d5f3c6250c844769eae009581b6bd97f19bc97.png)
BIOMIGA质粒小提试剂盒II简明步骤（PD1213）（详细内容请参考英文说明书）I. 实验前准备 II. 注意事项RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash Buffer 和Elution Buffer. DNA Wash Buffer*: 使用前请将8 mL (PD1213-00)或48 mL (PD1213-01)或216 mL (PD1213-02) or 90 mL (PD1213-转化菌:若为-70oC 甘油冻存的菌，请先涂布平板培养03)96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。
后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉切勿直接取冻存的菌种进行培养。
淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。
在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。
III. 操作步骤若用于提取1-5 mL的菌落，请将Buffer A1, B1, N1的量降低至250 μL, 250 μL 及350 μL，DNA wash Buffer及Elution Buffer的量不变。
1. 接种新鲜的单个菌落到5-12 mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时（勿超过16小时）。
2. 室温下10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
注：残留的液体培养基容易导致菌体裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不易吸取上清。
注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在之间的菌液。
若采用的是富集培养基，如TB或2×YT，注意保证OD600不超过。
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一、甘油菌活化
1.LB培养基制备：
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节PH至7.4，加入去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌20min。
●灭菌后注意密封，4℃能存放1个月。
●含琼脂的LB培养基：
上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌20min。
2.倒平板
2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌30min。
2.2 培养基高压后放在60℃水浴锅中保温。
溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。
小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。
2.3 冷却至50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平板即可。
37℃培养12-16h。
第二天挑单克隆大量培养。
3.大量培养
3.1 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50℃左右加入抗生素。
3.2 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL），37℃，200rpm培养8h。
3.3 按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得菌液。
（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。
37℃，200rpm培养12-16小时。
●使密度达到3-4 10^9/mL。
●OD600在0.5左右。
（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值，OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。
）
二、质粒提取
1. 准备工作
1.1 RNaseA用前瞬离。
一小瓶RNaseA加到1瓶buffer P1中，使终浓度为100ug/mL。
●Optional:按1:1000的比例，在bufferP1中加入LyseBlue。
1.2 检查buffer P2是否有沉淀（SDS,低温环境），如果有沉淀，将P2放置37℃条件下，以使沉淀溶解。
1.3 4℃预冷bufferP3。
2. 质粒提取
2.1上述菌液，6000 g，4℃离心15min，收集沉淀。
●若不马上进行实验，沉淀可-20℃保存
2.2 用QIAGEN质粒提取试剂盒中的4mL buffer P1重悬。
●为使裂解充分，容器要足够大，使充分混匀
●确保buffer P1中已加入RNaseA
●如果bufferP1中加了LyseBlue，重悬菌液之前，应将混合液（bufferP1+LyseBlue）用力混匀
●涡旋或上下颠倒混匀，使重悬菌液无团块
2.3加入4mL buffer P2，颠倒混匀4-6次，室温（15-25℃）静置反应5min。
●千万不可用振荡器混匀，会使DNA链断裂
●静置时间不要超过5min
●Buffer P2用后立即密封，以防空气中的CO2使其酸化
●此时裂解菌液应是粘稠的
●如果buffer P1中加入了LyseBlue，那么加入buffer P2并混匀后，应出现均匀的蓝色，如果出现局部无色或棕色团块，应继续颠倒混匀
2.4 加入4mL预冷bufferP3，立即用力颠倒混匀4-6次，冰上静置15min。
●注意低温操作（预冷，冰上静置），目的是促沉淀
●加入bufferP3后，出现白色蓬松状沉淀，沉淀为基因组DNA，蛋白质，细胞碎片，KDS。
此时，裂解液粘稠度应降低
●如果buffer P1中加入了LyseBlue，沉淀过滤后，溶液应该是无色的，表明SDS已经充分沉淀
2.5离心前混匀，≥20000⨯g，4℃离心30min。
快速吸取上清（含质粒）。
2.6上清≥20000⨯g，4℃离心15min。
吸取上清。
●Optional:取240uL上清，做凝胶电泳分析，以判断培养和分离是否合理
2.7平衡QIAGENtip-100，向QIAGENtip-100中加入4mL bufferQBT，重力作用自然流下。
2.8将2.6中的上清加入2.7平衡过的QIAGENtip-100中。
●提前平衡QIAGENtip-100，使得上清尽快加入，如果间隔时间太久，（蛋白沉淀变混浊）应再次离心以免堵塞QIAGENtip-100
●Optional:取240uL流出的液体，做凝胶电泳分析，质粒DNA与QIAGEN 树脂的结合效率
2.9用bufferQC洗QIAGENtip-100，一次10mL，洗2次。
●第一遍去除质粒提取试剂中的大部分杂质，如果菌液体积大或菌体产生大量碳水化合物时第二遍清洗则必要的
●Optional：
2.10 用5mLbufferQF洗脱DNA，用15mL管收集洗脱液。
●不可用聚碳酸酯离心管（不耐乙醇）
●如果重组质粒大于45-50kb，65℃预热bufferQF可洗脱效率
●Optional:
●洗脱下来的DNA可4℃暂存，但不建议过夜
2.11加
3.5mL（0.7倍洗脱液体积）室温异丙醇沉淀质粒DNA，混匀，≥15000⨯g，4℃离心30min，或者5000⨯g，4℃离心60min。
小心弃去液体。
●室温异丙醇：减少盐沉淀
●4℃离心：防止样品过热
2.12用2mL室温70%乙醇洗涤，≥15000⨯g，4℃离心10min，或者5000⨯g，4℃离心60min，小心弃去液体，室温晾干，用合适的缓冲液溶解（如TE buffer pH8.0，或10mM TrisCl，pH8.5）。