qPCR我们应该知道的点
我读书少，你表骗我——最清楚的QPCR原理讲解
我读书少，你表骗我——最清楚的QPCR原理讲解本文介绍QPCR的检测以及相对定量原理。
我读书少，你表骗我——最清晰的QPCR讲解（一）在前面我们介绍过QPCR结果如何分析作图（可以查看历史消息或者登录科研狗网站），接下来我们将分几次逐步介绍QPCR的原理和注意事项。
（一） QPCR定量原理1 理解PCRPCR简单来说就是一变二，二变四的等比增长的过程，如下图：图1：理想情况下PCR产物与循环数关系但是，这里面存在一个问题，并不是每次循环都会翻倍，比如说每次扩增只有90%的底物参与了扩增（扩增效率为0.9），这是理论情况下的PCR反应：图2 理论情况下PCR产物量与循环数关系。
但是由于上面都是在酶，buffer等都是足量，且不存在其他抑制反应的情况下的曲线，所以实际PCR曲线如下：图3 实际情况下PCR产物数与循环数的关系刚开始的时候酶，缓冲液，能量，dNTP等都是充足的，PCR按照理论情况下的扩增（A: 指数期），限速因子为底物的量；随着时间的增加，产物越来越多，每次循环所需要的酶也就越来越多，当达到B（线性期）阶段的时候，所有的酶都参与了扩增，因此每个循环之后产物增加量是恒定的，和酶的数量相关，此时限制产物增加的因素是酶；当达到C（衰退期）阶段时候，酶逐渐失活，dNTP消耗殆尽，产物增加量逐渐减少；直至到D阶段，没有任何产物生成，数目保持恒定。
2. QPCR简单原理我们可以将每条PCR产物带上一个荧光标记（具体怎么回事下节讲解），这样的话有多少个PCR产物就有多少单位的荧光，因此：荧光正比于 DNA产物数目某种关系于 DNA初始量因此我们通过机器收集荧光的量就能知道DNA初始量了，那么机器如何收集荧光呢？有两种方式可以收集荧光第一种是我们固定一个循环数C1（比如25个循环），然后循环结束之后我们分别收集每管的荧光，这种情况下，R2处于对数期，R1处于衰退期图4 固定循环数测定荧光强度值第二种是我们固定一个荧光强度值，看达到这个荧光强度值需要多少个循环图5 固定荧光强度测试循环数只要我们把R0设置合适，R0这条水平线就能切割到所有的处于对数期的曲线，我们qPCR采用的就是这种模式，下面我们来看下为什么这种模式能够反映出DNA初始量（以下推导中lg代表以2为底的对数）。
qpcr的原理及应用
qpcr的原理及应用1. qPCR的基本原理qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，用于定量检测DNA或RNA的存在和数量。
它是PCR技术的一种改进型，在PCR扩增过程中引入了荧光探针或染料，可以实现对反应产物的实时监测和定量分析。
qPCR的基本过程包括： - 样品制备：提取待检测的DNA或RNA，并对其进行适当的纯化和稀释处理。
- 引物设计：设计与目标基因或序列互补的引物，用于扩增目标序列。
- 反应体系组装：将适当浓度的模板DNA（或RNA）、引物、酶和缓冲液等组合在一起，构成PCR反应体系。
- PCR扩增：通过一系列的温度循环，使DNA在DNA聚合酶的作用下进行反复扩增。
- 实时监测：在PCR反应过程中，利用荧光探针或染料对扩增产物进行实时监测，并记录荧光信号的变化。
- 数据分析：根据实时监测得到的荧光信号，绘制荧光曲线，并根据标准曲线或基准样品确定待检测样品中目标序列的含量。
2. qPCR的应用领域-qPCR在遗传学研究中的应用： - 定量基因表达分析：通过测量目标基因的mRNA水平，研究基因在生物体内的表达变化，并深入了解基因调控机制。
- 疾病诊断和监测：通过检测患者样本中特定基因的表达水平，诊断和监测相关疾病的发展状态。
- 基因型鉴定：通过检测DNA样本中特定位点的遗传变异，确定个体的基因型。
- 微生物检测和鉴定：通过检测环境样本或患者样本中微生物的核酸，实现对微生物的快速检测和鉴定。
-qPCR在食品安全中的应用： - 食品质量控制：通过检测食品中特定基因的存在和数量，判断食品的品质和安全状况。
- 食品真实性检测：通过检测食品中的特定基因或DNA序列，鉴定食品的真实性和来源。
- 食品中污染物的检测：通过检测食品中的污染物的DNA或RNA，进行快速、灵敏的检测，以保障食品安全。
-qPCR在生态环境研究中的应用： - 物种多样性研究：通过检测环境样本中不同物种的DNA或RNA，分析物种多样性和分布情况，研究生态系统的结构和功能。
qpcr引物设计原则和注意事项
qpcr引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计是指为了检测特定基因序列而设计的一种引物，是实现qPCR技术的关键技术之一。
引物设计的准确性和准确性直接影响qPCR的精确性、可靠性和重复性。
qPCR引物设计的原则是：1）选择被检测序列的5’端两个核苷酸作为引物的开始；2）采用20-23bp的长度，保证引物的灵敏度和特异性；3）引物的Tm值应位于55-60°C，以确保引物有足够的结合力；4）尽量避免引物中存在重复序列；5）尽量避免引物中存在非特异性结合位点。
在设计qPCR引物时，应注意以下几点：1）选择被检测基因序列的特定位置作为引物的起始位点；2）计算引物的Tm值，以确保引物的结合力；3）避免引物中存在重复序列及其它非特异性结合位点；4）加入引物的标记磷酸，以增加引物的特异性；5）检查引物序列中是否存在致突变的核苷酸；6）检查引物序列中是否存在非特异性结合位点。
总之，qPCR引物设计是一项重要且复杂的技术，设计者必须特别注意以上原则和注意事项，以确保设计出的引物具有足够的特异性和灵敏度，以实现qPCR的准确性和可靠性。
干货qPCR实验中关于CT值问题的详细攻略，请查收！
⼲货qPCR实验中关于CT值问题的详细攻略，请查收！qPCR 实验在分析 CT时常常遇到这⼏类问题，⽐如：复孔间重复性差，是否都和操作有关？⽆模板阴性对照出现CT值时，⽬的基因的CT值是否还能⽤？CT值很⼤该怎么办？今天就给⼤家分享下，在 qPCR 实验中遇到关于CT值的常见问题时该如何解决。
复孔间重复性差怎么办？复孔间重复性差⼀般会有以下两种情况：（1）CT值很⼤，如CT≥ 30，重复性差属于正常现象。
该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT值差异较⼤。
解决⽅法：如果融解曲线没有杂峰，⽆模板阴性对照同⽬的基因的 CT值为 3 or 5 以上，那CT值为准确的，可多设置⼏个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。
（2）CT＜30，重复性较差。
这种情况⼀般同操作有关。
打开腾讯新闻，查看更多图⽚ >解决办法：从以下⼏个⽅⾯进⾏问题的排查：加样准确度；移液器吸取液体的准确度；定期校准 qPCR 仪。
加样准确度避免⼩体积加样，减少加样误差。
可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，⼤体积加样。
如：原液 cDNA 添加 1 µL，可以更改为原液 cDNA 稀释5 倍，添加 5 µL，使⽤ddH2O补齐体系⾄ 20 µL 即可。
SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。
从 -20 ℃冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在⼀起的 Mix ⽤移液器吹打混匀。
移液器吸取液体的准确度移液器量程定期校准，校准周期为 1 年。
购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏⽓的现象，导致吸取量程不准确。
在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液⾯⾼度是否⼀致。
定期校准 qPCR 仪⼀般 qPCR 仪校准周期为⼀年。
QPCR常见问题
QPCR中常见的问题Q：ROX是什么，有什么作用？A：ROX是一种荧光染料，作为参比信号校正。
试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。
ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。
Q：荧光通道的选择？A：定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光。
TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。
如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。
如果实验要求不高，不做ROX 校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。
研究应用本身的要求。
如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。
如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。
Q：内标法和外标法哪种数据更精密？A：是同样可靠的。
内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。
外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。
两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。
荧光定量PCR问题疑难解答Q 1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R2=0.998。
但是扩增效率只有80%另外扩增曲线也不光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大；或者是扩增产物太少了。
qpcrcdna浓度范围 -回复
qpcrcdna浓度范围-回复关于qpcr（定量聚合酶链反应）的浓度范围，这项实验技术在生物医学研究中被广泛应用。
qpcr是一种高灵敏、高选择性的实验方法，用于定量测量目的基因在样本中的丰度。
在进行qpcr实验之前，首先要确定合适的浓度范围，以确保结果的准确性和可靠性。
qpcr实验需要考虑的关键因素之一是DNA或RNA模板的初始浓度。
初始浓度的选择取决于目的基因在样本中的相对丰度以及实验目的。
一般而言，推荐使用初始浓度在10^1到10^7拷贝/μL之间的模板。
这个范围可以满足大多数实验的要求，并提供了足够的信号强度和动态范围。
首先，为了确定合适的初始浓度范围，可以进行预实验。
在预实验中，可以测试一系列不同浓度的样品，以获得相关基因的荧光信号和相对应的Ct 值（荧光信号阈值周期）。
Ct值表示达到荧光信号阈值所需的PCR循环数，其值越小，模板初始浓度越高。
根据这些数据，可以确定最佳初始浓度范围，以确保在实际实验中获得可靠的结果。
一般而言，初始浓度范围应该涵盖相对丰度更高或更低的样本。
如果目的基因在样本中的丰度较低，初始浓度可以选择在10^1到10^4拷贝/μL 之间。
如果目的基因在样本中的丰度较高，初始浓度可以选择在10^4到10^7拷贝/μL之间。
这样可以确保实验中的信号在合适的范围内，避免信号饱和或过低而导致的测量误差。
另一个需要考虑的因素是引物和探针的最佳浓度范围。
引物和探针是用于放大和检测目的基因的关键分子工具。
通常情况下，引物和探针的最佳浓度应该在200到900nM之间。
在确定最佳浓度范围时，可以进行一系列实验，分别使用不同浓度的引物和探针，观察实验结果的效果和信号强度，并根据这些数据确定最佳的引物和探针浓度。
此外，还应该考虑到试剂的扩增效率。
扩增效率是指PCR反应中每一轮扩增的倍增系数，其越接近100，表示扩增效率越高。
一般而言，合适的扩增效率应该在90到110之间。
如果扩增效率过低，可能会导致结果的不准确或不可靠。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
qpcr预混液检验标准
qpcr预混液检验标准一、引言QPCR（定量聚合酶链反应）预混液是一种常用于基因表达分析和定量检测的试剂。
为确保QPCR预混液的质量和可靠性，制定相应的检验标准是至关重要的。
本文将从预混液的核酸纯度、溶液稳定性、扩增效率等方面，论述QPCR预混液的检验标准。
二、核酸纯度检验标准1. 活性核酸检测：预混液中的活性核酸应符合一定的含量要求，一般在50-200 ng/uL之间。
2. DNA与RNA的杂交性：预混液中的DNA与RNA杂交能力应足够强，通过电泳实验和比色法检测。
3. RNA酶的降解作用：预混液中的RNA酶降解作用应低至最小限度，通过RNase酶活性检测方法进行评估。
三、溶液稳定性检验标准1. 保存温度：预混液应在指定温度下保存，一般要求在-20℃保存。
2. 震荡和冻融稳定性：预混液应具有一定的震荡和冻融稳定性，不会因为温度波动而导致试剂质量变化。
此项检测可通过周期性震荡和多次冻融后的试剂活性比对来完成。
3. 长期保存稳定性：预混液在长时间保存后，仍能保持稳定活性。
可通过该预混液的扩增效率检测来评估其稳定性。
四、扩增效率检验标准1. 线性范围：预混液的扩增效率应具有较宽的线性范围，可通过扩增反应进行序列稀释并进行扩增曲线分析来评估。
2. 扩增动态范围：预混液的扩增效率应适用于不同浓度范围的靶标分子，通过扩增反应在不同浓度下的检测来确定扩增动态范围。
3. 重复性和稳定性：预混液的扩增结果应具有较好的重复性和稳定性，通过同一样品的多次扩增实验来评估。
五、其他检测标准1. 检测质量控制：预混液应配有相应的阳性和阴性质量控制品，以确保准确性和可靠性的检测结果。
2. 交叉反应检测：预混液应通过与其他相关物种的交叉反应实验进行检测，以排除非特异性扩增。
结论通过对QPCR预混液的核酸纯度、溶液稳定性、扩增效率等方面进行严格的检验标准要求，能够保证预混液的质量和可靠性。
本文提出的检验标准，可作为制定和评估QPCR预混液的参考标准，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。
【实验】qPCR那点事儿
【实验】qPCR那点事儿展开全文一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。
与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
qpcr数据处理公式
qpcr数据处理公式qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) 是一种常用的分子生物学工具，用于定量测量目标DNA或RNA的数量。
在qPCR实验中，通过PCR反应扩增目标分子的数量，并同时测量其扩增曲线。
数据处理是进行准确定量分析的关键步骤，下面是一些相关参考内容。
1. 目标基因和内参基因选择：选择合适的目标基因和内参基因是确保准确定量的前提。
目标基因的选择应考虑其与研究对象相关性和表达量的差异。
内参基因通常是稳定表达的基因，用于标准化差异样品的RNA或DNA含量。
2. 标准曲线法：标准曲线法是一种常用的定量方法，可以根据已知浓度的标准品构建扩增曲线。
通过将标准品的Ct值与其浓度绘制成线性标准曲线，可以根据未知样品的Ct值反推其浓度。
3. ΔCt法：ΔCt法是一种常用的相对定量方法，用于比较不同样品之间目标基因的表达水平。
ΔCt的计算公式为：ΔCt = Ct （目标基因）- Ct（内参基因）。
ΔCt值表示目标基因与内参基因的相对表达量差异，较小的ΔCt值表示目标基因的表达量较高。
4. 2^-ΔΔCt法：2^-ΔΔCt法是一种常用的相对定量方法，用于比较实验组与对照组之间目标基因的表达水平。
ΔΔCt的计算公式为：ΔΔCt = ΔCt（实验组）- ΔCt（对照组）。
2^-ΔΔCt表示实验组与对照组之间目标基因的相对表达量的2的负幂次。
5. Efficiencies修正：PCR扩增的效率对于准确定量是至关重要的。
通过构建标准曲线，可以计算扩增效率，公式为：Efficiency（E）= 10^(-1/slope) - 1。
如果扩增效率在90%~110%之间，则可以直接使用Ct值进行定量计算；如果扩增效率超出这个范围，则需要对Ct值进行修正。
6. 统计分析：为了确保实验结果的可靠性，可以进行统计分析，如t检验或方差分析，来比较不同组之间是否存在显著差异。
此外，还可以进行重复实验以验证结果的稳定性。
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3点：相对定量
• 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100%（e=1）且偏差在5%以内 • 1、用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值：
△Ct（test） = Ct（target，test）- Ct （ref，test） △Ct（calibrator） = Ct（target， calibrator ）- Ct （ref， calibrator ） • 2、用校准样本的△Ct值归一试验样本的△Ct： △△Ct = △Ct（test）- △Ct（calibrator） • 3、计算表达水平比率： - △△Ct = 表达量的比值
N0 * （1+E）ct = N Log2N0 * （1+E）ct = Log2N Log2N0 = Log2N – ctLog2（1+E）
绝对定量与相对定量
• 绝对定量分析用于确定未知样本中 某个核酸序列的绝对定量值，即通 常所说的拷贝数
• 相对定量分析用于测定一个测试样 本中目标核酸序列与校正样本中同 一序列表达的相对变化
4点：PAX1甲基化水平（程度）
• 宫颈脱落细胞中甲基化的细胞数量占所有脱落细胞数量的比例 甲基化水平 = 2 - △Ct △Ct = Ct（PAX1m）- Ct （内参基因） △Ct = 9，甲基化水平为2/1024
甲基化
5点：检测原理
qPCR我们应该知道的点
1点：PCR的理论基础
• 聚合酶链式反应 • DNA体外扩增技术
• DNA半保留复制的机理 • 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质
• 理论：2n递增，30个循环，目标DNA可增加230，即109 • 实际：目标DNA可增加26—107
PCR反应
2点：Ct或Cp反应目标序列的起始浓度