碱性磷酸酶基因表达载体的构 建及在大肠杆菌中的表达开题报告
大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达的开题报告
大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达的
开题报告
一、研究背景
内皮抑素（Endothelin，ET）是一种由内皮细胞合成和分泌的活性多肽，存在3种亚型：ET-1，ET-2和ET-3。
它们通过与ET受体结合来调节血管张力、心脏收缩力和细胞增殖。
内皮抑素在许多生理和病理状态中发挥重要作用，包括心血管疾病、肾脏疾病和肿瘤。
因此，内皮抑素的研究具有重要的生物学和药理学意义。
大肠杆菌是一种广泛应用于重组蛋白表达的细菌。
将外源基因克隆到大肠杆菌中，并通过蛋白表达系统表达蛋白，是分子生物学领域的常见技术之一。
因此，将内皮抑素基因克隆到大肠杆菌中，可以为内皮抑素的生物学和药理学研究提供便利。
二、研究目的
本研究旨在克隆大鼠内皮抑素基因，并将其表达于大肠杆菌中，以用于后续内皮抑素的生物学和药理学研究。
三、研究方法
1. 利用PCR技术从大鼠组织中扩增ET基因。
2. 将ET基因克隆到表达载体中。
3. 将重组质粒转化到大肠杆菌中。
4. 通过SDS-PAGE和Western blotting分析大肠杆菌中表达的ET蛋白。
5. 对表达的ET蛋白进行纯化和鉴定。
四、研究意义
成功克隆大鼠内皮抑素基因并将其表达于大肠杆菌中，将为下一步内皮抑素的功能、代谢、信号通路和相互作用等研究提供基础。
同时，该研究也为内皮抑素的生物技术应用提供了一种新的策略。
生化大实验--AKP(碱磷酶)的表达与纯化
相对误差：绝对误差在真实值中所占的百分率。
精确度和偏差：精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近 的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。 偏差：绝对偏差、相对偏差。
误差来源
1、系统误差（可测误差）： 测定过程中，某些经常发生的原因所造成的，它对测定结果的影响比较稳定， 在同一条件下重复测定中常重复出现，使测定结果不是偏高，就是偏低，而 且大小有一定规律，它的大小与正负往往可以测定出来，至少从理论上来说
留样！体积测定！
培养、表达与菌体收集
1.预培养：
挑一单菌落至 30mL LB液体培养基(含50μg/mL Carb)， 37℃、190rpm振荡培养过夜； 2.扩大培养： 取2mL～3mL预培养菌液至300mL TM培养基中(含50μg/ml Carb)，37℃、250rpm振荡培养3~4小时 3. 诱导表达： 加入IPTG（终浓度：50μmol/L ），25℃、250rpm振荡培 养12～16小时 注意：平衡！ 4. 收菌： 充分弃上清！ 4℃，6000rpm×10min， －20℃保存菌体沉淀
溶液配制
6.考马斯亮蓝溶液 500mL 考马斯亮蓝G-250 50mg溶于 25mL95%乙醇中， 加入 50mL85%磷酸, 加水至500mL，滤纸过滤（棕色瓶）
7. 1mg/mL BSA 10 mL（全班） 10 mg BSA用Buffer A溶解，10 mL 容量瓶定容
溶液配制
8. 测活液pH 8.5 100mL
50 mmol/L Tris-HCl
0.2mg/mL BSA
10mmol/L pNPP
2mmol/L MgAc2 9. 终止液 500mL
10. Buffer C 600 mL
溶液配制
人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达的开题报告
人HMGB1-boxA基因克隆及其原核表达载体的表达的开题报告一、项目背景高移动性族细胞内胚质结合蛋白1（HMGB1）是一种高度保守并广泛存在于真核生物中的核蛋白，常常被用作细胞核DNA的结构稳定化，参与基因转录和修复等生命过程。
然而，它在细胞外的作用引起了许多研究者的注意，研究表明在创伤性损伤、炎症和肿瘤等情况下，HMGB1被释放到细胞外，发挥了调节炎症反应、增强免疫功能、促进细胞增殖等生物学效应。
因此，HMGB1成为了一种重要的免疫调节分子。
目前，已经有研究报道在小鼠系统中采用腺病毒载体将HMGB1基因转染到肌肉中，能够刺激肌肉细胞增殖和修复，这项工作使得将HMGB1基因运用到基因治疗中成为可能。
因此，对HMGB1的研究越来越受到重视。
本项目旨在克隆人类HMGB1-boxA基因，构建原核表达载体，并表达出推测蛋白酶切片段的重组蛋白，为后续研究奠定基础。
二、研究内容1.克隆人类HMGB1-boxA基因从人类基因组组织DNA中扩增出人类HMGB1-boxA基因，进一步纯化并进行酶切。
2.构建原核表达载体选用适当的载体，将人类HMGB1-boxA基因插入表达的诱导区域，构建重组质粒并验证质粒正确性。
3.原核表达及纯化利用大肠杆菌表达人类HMGB1-boxA蛋白，利用亲和层析纯化筛选出重组蛋白。
4. SDS-PAGE和Western blot检测利用凝胶电泳技术和Western blot技术检测经SDS-PAGE和电泳分离后纯化出的人类HMGB1-boxA蛋白的表达情况和纯度。
三、研究意义通过克隆人类HMGB1-boxA基因并构建原核表达载体，能够将人类HMGB1-boxA蛋白在大肠杆菌中表达并高效纯化。
此项研究为之后HMGB1-boxA蛋白的进一步功能研究奠定基础。
生化大 实验报告
内蒙古大学生命科学学院生物系生物化学实验室生物化学大实验结题报告论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析学生姓名：年级：专业：指导教师：2011年xx月xx日重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析X X（xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址)）摘要: 将外源基因BAP克隆在含有lac启动子的表达载体coli中，让其在E. coli 中表达。
培养宿主菌，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。
将宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后SDS-PAGE检测转录表达蛋白，用Western-blotting方式分析蛋白特性。
关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE；Western-blotting 碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。
它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一。
它的作用是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。
碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称BAP)；BAP属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。
细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
杜仲EuCHIT1基因表达载体构建及在大肠杆菌中的表达
杜仲EuCHIT1基因表达载体构建及在大肠杆菌中的表达董旋;丁延庆;冉昕;赵德刚【摘要】The prokaryotic expression vectors pET-EuCHIT1 and pMCSG-EuCHIT1 of Eucommia ulmoides chitinase gene ( EuCHIT1) were constructed with strong T7 promoter. The expression products of pET-EuCHIT1 and pMCSG-Eu-CHIT1 contained six histidine (6His) tags and six maltose-binding proteins (his6-tag-maltose-binding protein, MBP), respectively. The recombinant vectors were transformed into E.coli cell strain BL21(DE3) for expression. The transformed cell were cultured under the conditions of 37℃ and 150 r until OD value of the bacteria was 0.4~0.8, then induced for 12 h by 1 mmol/L IPTG under the conditions of 16℃ and 150 r. The expression proteins were analysed by SDS-PAGE. The expression of pET-EuCHIT1/BL21(DE3) contained 36.03 kD fusion protein, and pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3) DE3) successfully expressed the soluble 77. 21 kD fusion protein. It is concluded that the chtinase gene ( EuCHIT1) could be expressed in pMCSG-EuCHIT1/BL21( DE3) to obtain soluble fusion protein, thus laying a foundation for prepa-ration of EuCHIT1 polyclonal antibody and for study of its function.%构建了T7启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的原核表达载体pET-EuCHIT1和pMCSG-EuCHIT1,其表达产物分别含6个组氨酸(6His)标签和6个组氨酸连接的麦芽糖结合蛋白(his6-tag–maltose-binding pro-tein, MBP)标签,分别将重组载体遗传转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),在37℃、150 rpm条件下培养至菌液OD值为0.4~0.8后,转到16℃、150 rpm 条件下以1 mM IPTG诱导培养12 h,表达产物经SDS-PAGE分析,pET-Eu-CHIT1/BL21( DE3)表达以包涵体形式存在36.03 kD融合蛋白,pMCSG-EuCHIT1/ BL21( DE3)成功表达可溶形式存在的77.21 kD融合蛋白。
CLP基因的克隆、表达及生化特性的研究的开题报告
CLP基因的克隆、表达及生化特性的研究的开题报告
题目：CLP基因的克隆、表达及生化特性的研究
研究背景及意义：
CLP基因是一种编码骨髓造血细胞前体细胞的抑制性因子的基因，其在造血过程中的作用尚不清楚。
然而，最近的研究表明，CLP基因可能在一些疾病中发挥重要作用，比如白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病等。
因此，进一步研究CLP基因的克隆、
表达及生化特性对于研究这些疾病的病理机制具有重要意义。
研究内容：
1. 从人体骨髓中提取RNA，通过RT-PCR技术克隆CLP基因的全长序列。
2. 构建CLP基因的表达载体，将其转化至大肠杆菌中，通过蛋白质表达技术纯
化得到CLP蛋白。
3. 对CLP蛋白进行生化特性分析，包括分子量、等电点、氨基酸组成等。
4. 通过Western blotting技术检测CLP在不同组织中的表达情况。
预期结果：
通过上述实验方法，我们可以获得CLP基因的全长序列和纯化的CLP蛋白，并
确定其在不同组织中的表达水平。
同时，生化特性分析可以进一步揭示CLP蛋白的结
构和功能特点，为进一步研究CLP在造血系统和一些疾病中的作用提供基础数据支持。
研究意义：
CLP基因在人体疾病中可能发挥重要作用，但是其作用机制目前还不明确。
本研究通过克隆、表达和生化特性分析，可以更加深入地了解CLP基因的结构和功能特点，为其在疾病研究中的应用提供理论依据和实验支持。
同时，该研究还为进一步探索造
血系统中其他相关基因的结构和功能提供可参考的方法和手段。
碱性磷酸酶（AKP）特性研究探究.doc
碱性磷酸酶(AKP)特性研究探究碱性磷酸酶(AKP)是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。
本实验由含pET21a-AKP表迗质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。
本实验通过对纯化之后的AKP进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对AKP活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定AKP的最适温度和pH以及AKP 的变性和复性等实验来研究AKP的特性。
关键词：碱性磷酸酶(AKP);反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶(EC. 3. 1. 3.1)，是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56Kda。
它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。
大肠杆菌碱性磷酸酶被phoA基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。
碱性磷酸酶即AKP来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。
AKP广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。
AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状DNA两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化；蛋白质的去磷酸化。
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将AKP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。
AKP作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。
本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。
酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25°C等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
凡纳滨对虾溶菌酶基因在大肠杆菌和酵母中的重组表达和活性检测的开题报告
凡纳滨对虾溶菌酶基因在大肠杆菌和酵母中的重组表达和
活性检测的开题报告
一、研究背景及意义
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是全球重要的养殖虾类之一，其产值和出口额均居全球首位。
虾类生长发育、防病抗逆、消化吸收等过程中，溶菌酶作为一种重要的酶类在其中发挥着重要作用。
溶菌酶是能够破坏细胞壁的酶，广泛存在于生物体内并具有广泛的应用前景。
本研究意在通过对凡纳滨对虾溶菌酶基因克隆、表达及活性检测，探究其在生物工程、食品工业等领域的应用价值，为虾类工业生产提供理论基础和技术支持。
二、研究内容和方法
1. 对凡纳滨对虾中溶菌酶基因进行克隆和序列分析，确定其开放阅读框并进行同源性比较。
2. 将目标基因克隆到表达载体中，经过序列鉴定和限制性酶切后，将其转化到大肠杆菌和酵母中进行重组表达。
3. 利用SDS-PAGE对表达的溶菌酶进行检测并进行Western blot验证；同时，对最优表达条件进行筛选和优化，并对表达产物进行酶学性质检测和活性分析。
三、预期结果及意义
本研究旨在通过对凡纳滨对虾中溶菌酶基因的表达和活性检测，探究该基因在生物制药、环境工程、食品科技等领域的应用价值。
预期结果包括：（1）成功克隆和表达溶菌酶基因，并获得高纯度溶菌酶；（2）获得相应的驱动序列和表达条件，为进一步系统研究其在生物重组、药物生产、环境修复等领域的应用奠定基础；（3）阐明凡纳滨对虾溶菌酶的生物学特性和酶学性质，为虾类生产与养殖工艺优化提供研究基础和技术支持。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3
3. 实验进度（10 天之内）：
第零天
摇菌（大肠杆菌 2 管，及 DH5α，BL21）配制 LB 培养基，PCR 扩
增
上午 连接，制备感受态
第一天 下午 转化，接种 PET-his
第二天 上午
下午
挑菌 提质粒，跑电泳
第三天 上午 酶切、跑电泳、回收、连接
第四天 上午 转化
第五天 上午
下午
挑菌、配制蛋白胶 提质粒、跑电泳、pcr 扩增
编号
内蒙古大学生命科学学院生物系 基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构 建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名： 孟祥东 年 级： 2012 级 专 业： 生物技术基地班 指导教师： 王郑 张立全
2015 年 7 月 2 日
学生姓名 孟祥东
民族
汉族
性别 男 出生年月
[4]唐云明.泥鳅碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质[J].水产学报，1997，21（3）：
336-339.
1
二、实验方案 1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题： 实验内容：利用基因工程实验技术操作碱性磷酸激酶基因，将已连接在 Pmd19-t 载体上的 碱性磷酸激酶酶源基因用 PCR 扩增出 837bp 的纳豆激酶的基因片段，与 T 载体连接后导 入感受态的 DH5Aα菌种筛选鉴定。用双酶切切下纳豆激酶的成熟基因片段，插入带有 6 个组氨酸标签的原核载体 pET-his,导入 BL（21）DE3 感受态菌种诱导表达纳豆激酶蛋白质， 用 SDS-PAGE 鉴定。
碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用，是许多生化反应试剂盒的检测酶。目 前国内市场引用的碱性磷酸酶都是从国外进口，并且是有牛、猪肝提取，价格昂贵且产量 不高。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低，热稳定性好，而且能用基因方法实现蛋白质 定向标记等。
参考文献： [1]赵赣，钱芳，孙永学，等.鸡肝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质的研究[J].
优化质粒 DNA 碱裂的方法、DNA 琼脂糖凝胶电泳技术、PCR 操作技术、大肠杆菌 感受态的制备、目的菌种的筛选方式、IPTG 诱导量及又到时间、超声破碎的方案。纳豆 激酶的规模化生产尚不成熟，此实验旨在对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的活性 方面进行了深入系统的研究，能够初步利用基因工程菌产生碱性磷酸酶样品。从而降低生 产成本，提高疾病检测、食品检验、医药生产效果。
第六天 上午
下午
IPTG 诱导 3 小时 跑电泳、染色、脱色、检查结果
4. 预期实验成果：据以往经验此实验预计能够成功构建表达载体，并能成功表达目的产物
4
5. 曾参与本实验有关的学习和研究工作积累以及已取得的工作成绩： （学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验设计或研究 课题、获得学术奖励情况等） 课程：1.《基因工程》，邢万金
论文题目 碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
1992.7.15
开题时间 2015 年 6 月 18 日
结题时间
2015 年 6 月 25 日
项目来源
本科生基因工程大实现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处： 碱性磷酸酶（Alkaline phosphamse）是一个非特异性磷酸单酯酶，能催化几乎所有的
2.《遗传学基础》，邢万金 3.《植物基因工程》，林晓飞 相关文献：1.Cloning，expression in Escherichia coli，and enzymatic properties of laccase from Aeromonas hydrophila WL-11
2. Effect of Long-Term Intake of Y3+ in Drinking Water on Gene Expression in Brains of Rats
细菌碱性磷酸酶是分子生物学的重要工具酶。在碱性条件下，可以催化磷酸胆脂水解， 生成无机磷酸。在 ELISA 过程中，BAP 常用作标记二抗的酶显色。
近年来，国内外一些学者直接将 BAP 与抗体蛋白融合表达，避免了酶标二抗的使用和 交叉反应，不仅在疾病诊断中有显著优势，还可以检测与之融合的各种单链抗体的活性。
2
2．实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：按照预定的实验线路完成实验
试验方法：依据实验室基因工程实验严格操作
技术路线：如下图：
DH5α、BL21(DE3)菌 种
pET-44a-BAP (质粒)
摇菌
制备 DH5α、BL21(DE3)
感受态细胞
pET-his 菌种 摇菌
提取质粒 pET-his
三、指导教师意见： 签字： 年月日
注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。
5
PCR 扩增 BAP
连接
PMD-19-T 载体
BamHI/HindIII
重组质粒
提质粒 筛选鉴定
转化 DH5α
BamHI/HindI II
回收 BAP 小片段
连接
回收 pET-his 大片段
pET-his-BAP 转化 BL21（DE3）感受态细胞
提质粒 筛选鉴定
IPTG 诱导表达
SDS-PAGE
可行性分析：此方法经实验室研究人员反复采用，可行性很高。
磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇、酚或糖。碱性磷酸酶既是生物体内一 种重要的调控酶；也是基因工程、临床诊断的一种重要工具酶，已广泛应用于疾病检测、 食品检验、医药生产等领域。本实验通过亚克隆、连接、酶切等不同的技术手段，构建碱 性磷酸酶基因表达载体，在大肠杆菌中得以表达。
这种酶能催化核酸分子脱掉 5’磷酸基团，从而使 DNA 或 RNA 片段的 5’-P 末端转换成 5’-OH 末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 APK1、AKP2、AKP3、 AKP4、AKP 5 和 AKP6 六种同功酶。
上海交通大学学报，2003，21（3）：194-198. [2]刘晓雯，刘克武，闵丽娥，等.黑眉锦蛇小肠碱性磷酸酶的分离纯化及其部分
性质研究[J].四川大学学报，2001，38（5）：732-736. [3]谢莉萍，林静瑜，肖锐，等.合浦球母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究[J].
海洋科学，2000，24（10）：37-40.