内蒙古大学基因工程大实验思考题

内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。

二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。

这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。

通常观察到的是超螺旋和环状质粒。

2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。

三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。

3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。

变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。

若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含 AT 的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA 模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR 的失败。

非特异性条带数增多。

2.引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？根据cDNA设计引物，为了更好地与载体连接。

3.为什么要在最后延伸10min？一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。

4.实验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？有①.重新设计引物②加大模板用量或减少引物用量③扩大反应体系④提高退火温度或Mg离子浓度五、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？紫外照射对DNA有损伤，，为了保证DNA的完整性，尽量不用EB染色或紫外照射。

六、目的基因片段与载体连接1．连接酶的最适活性温度是多少？37℃2．为什么要采用14℃下连接？由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在14°C下进行3．如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？一般参考T4连接酶的说明书，大多数人做的是插入片段：载体=3：1至5：1，是分子数的比值。

可以先测出两者的质量浓度（分光光度计或者跑电泳），然后根据分子量大小可以算出。

七、感受态大肠杆菌的制备1.制作感受态菌的过程中，应注意哪些关键步骤？①操作是防止污染，这个最容易影响感受态制作的因素。

②悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮。

2.CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？作用：悬浮菌体在0～4℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的保存了DNA，冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。

八、感受态细菌的转化1.影响转化效率的因素有哪些？①细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。

DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是5×107/ml）；②所有操作均应在无菌条件和冰上进行；③经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；④化合物及无机离子的影响：Ca2+的基础上联合其他二价金属离子在（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；⑤所使用的器皿必须干净。

迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；⑥质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ;⑦一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；2.白色菌落出现的原理是什么？由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。

然而，当外源DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

九、转化克隆的筛选与鉴定1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？酶切法与PCR法PCR可以直接以菌落做模板，比较方便，但有时候有假阳性；酶切鉴定需要提取质粒才能酶切，比较费时，且插入片段里不能有所选酶的酶切位点，在片段序列未知时不宜判定，但在序列已知时相对可靠筛选方案哪个更可靠？2.酶切法与PCR法筛选方案哪个更靠谱一些？酶切法，但是比较费时间3.最终确认克隆的方法有哪些？①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。

②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。

如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。

因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。

③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。

方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。

阳性点的位置就是所需要的克隆。

④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

十、外源基因的诱导表达1.IPTG的作用原理是什么？E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达2.为什么要增加抗菌素的用量？携带载体的菌体在正常情况下，由于自身保护作用，会丢失载体，含有载体的菌体由于代谢负担过重，比生长速率小于空载菌体！含有载体的菌体在表达外源基因的同时，也能表达AMP分解酶类。

此类酶可以分解青霉素，降低危害。

不含质粒的菌体则无此功能。

当菌体接种量很小的时候，不带质粒的菌体生长迅速，很快成为优势菌株，当加入足够量AMP时，就具有选择压力，抑制不带质粒的菌体生长，使得含质粒菌体在种群中占有优势。

十一、SDS-PAGE检测表达蛋白1，影响表达的因素都有哪些？（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞代谢负荷（5）工程菌的培养条件2，如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？电泳检测时，加个空白的大肠杆菌蛋白做对照，根据已知的目的蛋白的大小，再加个蛋白，进行对比，一般来说诱导出来的蛋白浓度明显会高于其他蛋白的. 3，pET-his载体为什么必须在BL21(DE3)菌，而不能在DH5α中表达？大肠杆菌DH5α一般做克隆或保存质粒用，BL21用来做原核表达用。

BL21(DE3) 菌株用于高效表达含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，表达效率高。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

DH5α可以表达抗性基因，应该也能表达外源基因，但是我们一般不用该菌作为表达菌，可能与表达量、表达产物活性有关。

4，表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？如何设计实验判定？不确定，培养物离心后，加细胞裂解液冷冻，再加PMSF和lysozyme，超声等方法将细菌破碎，离心，分别收集上清和沉淀，常规SDS-PAGE 进行电泳，即可以鉴定蛋白是可溶性的还是包涵体。

5，本实验能否判断表达产物一定是GFP蛋白？还需要什么方法？蓝白班筛选，表达GFP蛋白的为白色菌落。

6，如何估计表达产物的分子量?通过粘度估计，一般是用乌氏粘度计测定特性粘数后折算分子量。