现代生化技术实验讲义(生物08)
现代生物技术ppt课件
可再生、低碳排放、资 源丰富等。
THANKS.
农业废弃物的生物处理技术 利用微生物的分解作用将农业废弃物转化为有机肥料或生 物能源。
农业废弃物生物处理的优点 减少环境污染、提高资源利用率、促进农业可持续发展等。
生物技术在工业领域
08
的应用
生物催化与生物转化
生物催化剂
利用酶或微生物细胞作为催化剂，加速化学反应的 速度，提高产物的纯度和收率。
生物转化
通过培养转化后的受体细胞，诱导目的基因 的表达，并对表达产物进行检测和分析。
基因工程的应用实例
转基因作物
通过基因工程技术将外源基因导 入作物中，使其具有抗虫、抗病、
抗除草剂等优良性状。
基因治疗
利用基因工程技术将正常基因导 入患者体内，以替代或修复缺陷 基因，达到治疗遗传性疾病的目 的。
生物制药
利用基因工程技术生产重组蛋白 药物、抗体药物等生物药物，用 于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
固定化方法
物理吸附、化学交联、包埋法等。
酶的性质与催化机制
01
02
03
酶的性质
高效性、专一性、可调节 性、不稳定性等。
催化机制
酶通过降低反应的活化能， 加速反应的进行。
酶的结构与功能
酶的活性中心、辅因子、 别构效应等。
酶工程的应用实例
工业应用 洗涤剂、食品加工、皮革加工等。
医药应用 药物合成、疾病诊断、基因工程等。
氨基酸的生产
以谷氨酸为例，阐述发酵法生产氨基酸的原 理、工艺及应用。
酶制剂的生产
以淀粉酶为例，介绍利用发酵工程生产酶制 剂的方法、应用领域及市场现状。
酶工程
05
酶的分离纯化与固定化
推荐高考生物二轮复习专题八现代生物科技专题讲义.doc
专题八现代生物科技专题第Ⅰ课时基因工程与克隆技术考点一基因工程1．基因工程的基本工具( 填空 )2．基因工程的基本操作程序( 填空 )(1)目的基因的获取途径：方法具体操作直接分离从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取人工合成已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，化学合成不需要模板逆转录法以 mRNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成①原理：DNA复制；②条件：模板DNA、引物、脱氧核苷酸、热稳定的DNA聚合酶变性： 90～95 ℃， DNA解旋↓PCR技术复性： 55～60 ℃，引物与单链DNA扩增③过程结合↓延伸： 70～ 75 ℃，在热稳定的DNA聚合酶作用下合成子链(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建：①表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
②启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。
(3)将目的基因导入受体细胞：植物细胞动物细胞微生物细胞常用农杆菌转化法、基因枪法、花粉显微注射技术感受态细胞法 ( 用 Ca2＋处理 ) 方法管通道法受体受精卵、体细胞受精卵原核细胞细胞(4)目的基因的检测与鉴定：①导入检测：DNA分子杂交技术 ( 使用 DNA探针 ) 。
转录检测：分子杂交技术检测mRNA②表达检测翻译检测：用相应的抗体进行抗原—抗体杂交③个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。
3．蛋白质工程( 填空 )(1) 启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用(2015 ·重庆卷， T6D)( ×)(2) 携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测(2014 ·天津卷， T4A)( ×)(3) 从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。
目前在P1 的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1 氨基酸序列设计多条模拟肽 ( √)(4)重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接 ( ×)(5)每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 ( √)1．为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将从陆地棉基因库中获取的酶D基因与位于拟南芥叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得转基因油菜品种。
生化技术PPT教学课件
缺点：易变性
操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加 少量无机盐，pH接近pI，用量试验确定， 可先浓缩。
3.4 选择性变性沉淀 杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白
三 核酸的沉淀分离
温度：0～4℃ ，防止变性和降解 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水
解 1 有机溶液沉淀法 乙醇 2 等电点沉淀法 3 钙盐沉淀法（氯化钙＋乙醇） 4 选择性溶剂沉淀法
多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解
操作要点
（1 ）斐林试剂的标定
（a）标定预备试验
A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀， 加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡 萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1 ％或0.2％）V1mL。 （b）标定
（b）定糖
A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶 中中） 预摇 先匀 加， 入补 （加V2（-1)Vm0L-V标2）准m葡L萄水糖，液并，从摇滴匀定后管 加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用 标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内 完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V
（1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘
（2）标准曲线的制作
（a)标准葡萄糖液的配制
0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）
（b)三角瓶编号
1 2 3456
葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5
蒸馏水（mL )
5 4 3210
铜试剂（mL )
5 5 5555
沸水浴10min，冷却至室温
1996 “多莉”羊诞生
第一篇 生化分离技术
第一章 生物大分子的提取与沉淀分离 技术
生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖 和脂类
生物化学实验讲义
的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2. 材料与试剂
① 尿素。
-8-
② 10%氢氧化钠溶液。 ③ 1%硫酸铜溶液。 ④ 2%卵清蛋白溶液。 3. 操作方法 ① 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。当熔化的 尿素开始硬化时，停止加热，这时尿素放出氨，形成双缩脲。将得到的物质放置 冷却后，加 10%氢氧化钠溶液约 1mL，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，边振 荡边观察出现的粉红颜色。实验中避免添加过量硫酸铜，否则生成的蓝色氢氧化 铜溶液会掩盖粉红色的出现。 ② 向另一试管加卵清蛋白溶液约 1mL 和 10%氢氧化钠溶液约 2mL，摇匀后 加入 1%硫酸铜溶液 2 滴，边加边振荡并观察紫玫瑰色的出现。
1．使用方法
（1）将温度计插入插孔内（一般在箱顶放气调节器中部）。 （2）通电，打开电源开关，红色指示灯亮，开始加热。开启鼓风开关，促 使热空气对流。 （3）注意观察温度计。当温度计温度将要达到需要温度时，调节自动控温 旋钮，使绿色指示灯正好亮。10min 后再观察温度计和指示灯，如果温度计上所 指温度超过所需温度，而红色指示灯仍亮，则将自动控温旋钮略向反时针方向旋 转，直调到要需要的温度上，并且指示灯轮番显示红色和绿色为止。自动恒温器 旋钮在箱体正面左上方或右下方。它的刻度板不能作让温度标准指示，只能作为 调节的标记。
具体反应如下：
双缩脲反应不仅在含有两个以上肽键的物质出现，在含有一个肽键和一个 -CS-NH2，-CH2-NH2-，-CRH-NH2-，-CH2-NH2-CHNH2-CH2OH 或-CHOHCH2NH2 等基团及含
有乙二酰二氨（
）等物质也有此反应。另外，NH3 能干扰此反应，
因为 NH3 与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子 Cu(NH3)42+，因此，一切蛋白质或二肽以上
生物化学实验讲义(DOC)
生化实验讲义综合型实验生物科学与工程学院溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
实验安排第一天实验理论第二天配试剂、离子交换剂的再生、平衡第三天蛋清样品上样、洗脱、硫酸铵沉淀第四天分子筛层析第五天酶活和蛋白浓度的测定第六天酶促动力学第七天 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
生化实验讲义(10个)教学内容
生物化学实验讲义赵国芬2010年9月实验之前说明1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的10个实验.2.共开出10个不同的实验实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法实验四双缩脲测定蛋白质的含量实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用实验八植物组织中维生素C的定量测定实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验十植物组织中DNA的提取和鉴定3.穿着要利索,做好实验记录4.注意实验室卫生和安全.一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.二. 生物化学所用的实验技术1.样品: :血液、血浆、血清、组织植物样品：果实、花蕾、茎等无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆2．移液管的使用：移液管吸管移液管奥氏吸管读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。
3．离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4．分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5．水浴锅的使用三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、实验原理酶的化学本质是蛋白质。
凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。
此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。
酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。
生化实验技术讲座共52页
谢谢！
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
生化实验技术讲座
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
《生物化学技术实验》PPT课件
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33
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34
■ 亲和层析作用机理：
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
配体
X
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(3)
Elution
A
B
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亲和吸附剂的制备
• 分离纯化一定数量的游离配体 • 载体活化 • 配体与载体偶联
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■ 亲和层析图谱：
酯键＞酰胺键＞肽键
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胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶) 和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构 上均十分接近，利用一般常用的提取分 离方法，很难将它们之间彼此彻底分开 。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采 用亲和层折技术进一步纯化后，可达到 十分满意的效果。
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50
胰蛋白酶的天然抑制剂 -------鸡卵类粘蛋白(CHOM)
生物化学技术实验部分
(2010版)
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1
生物化学研究的核心任务： 阐明生命现象的分子机理。
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2
生物大分子物质制备的基本过程：
• 确定测定方法 • 材料的选择与处理 • 抽提 • 浓缩 • 纯化 • 有效成分纯度和性质的分析
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3
蛋白质的制备：
前处理
浓缩、粗分离
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59
胰蛋白酶的BAEE单位定义为： 在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值 A253nm增加0.001的酶量。 • 底物（BAEE）浓度为1mmol/L • 反应液为0.05mol/L Tris-HCl,pH7.6 • 光程1cm • 反应温度25℃ • 波长253nm • OD值递增0.001/min
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实验一牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定一、实验目的1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。
常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。
本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。
其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
三、材料与试剂市售牛奶10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1M NaOH溶液、0.2M pH4.6的HAc－NaAc缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。
两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。
此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取25ml牛乳置50 ml 烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2 M pH 4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。
2、除杂将上述沉淀捣碎，加入10 ml 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。
将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10ml乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10 ml乙醚洗涤沉淀两次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，称量（质量为m0）。
称取挥干乙醚后的酪蛋白沉淀适量（质量为m1），置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m2）。
其余沉淀留作下步试验用。
3、酪蛋白产品纯度测定（1）标准曲线的绘制分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 于干燥试管中，不足1.0ml 者用0.1M NaOH 溶液补足1.0ml ，然后分别加入4.0ml 双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min ，测定540nm 波长处吸光度。
以酪蛋白质量（mg ）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（2）酪蛋白含量测定称取“2步骤”中留取的沉淀适量（m 3），用0.1M NaOH 溶液溶解，配成10mg/ml 样品溶液（体积为V ml ）。
取该溶液1.0ml ，加入4.0ml 双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min ，测定540nm 波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。
平行测定3次，求其平均值（m 4）。
五、结果与讨论1、牛乳中酪蛋白含量的计算含量（g/ml ）=）牛乳体积（ml 25120m m m ⨯2、酪蛋白产品纯度的计算酪蛋白纯度=%1001234⨯⨯⨯m m m V m六、思考题1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？实验二大蒜细胞SOD酶的提取与分离一、实验目的1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。
二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。
由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、试剂和材料新鲜蒜瓣，市售磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V）丙酮：用前冷却至4～10 ℃0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）10mmol/L HCl45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）四、实验步骤1、组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。
2、SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2～3倍体积（10-15 ml）的0.05 mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000 r/min下，离心15 min，收集上清液得提取液。
留出1ml备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。
3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15 min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。
留出1ml备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。
4、SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5ml，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。
准确量取体积。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。
5、SOD活力测定参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。
邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。
中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。
表1 邻苯三酚自氧化测定加样表加样量（ml）试剂校零管测定管0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.4 4.410mmol/L HCl 0.1 ——45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）——0.1总体积9.0 9.0（2）SOD酶活的测定：在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。
表2 SOD酶活测定加样表加样量（ml）试剂校零管测定管0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.3 4.310mmol/L HCl 0.1 ——待测样0.1 0.145mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）——0.1总体积9.0 9.0（3）酶活力测定酶活性单位定义为：在lml 的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。
按下式计算样品中SOD 酶单位活力：单位体积活力（U/ml ）= 活性单位定义体积加入样品液体积样品液稀释倍数反应液总体积⨯⨯÷%50k k -k 010 总活力（U ）= 样品液总体积单位体积活力⨯式中：反应液总体积=9ml ；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1ml ；活性单位定义体积=1ml ；样品液总体积=实验中各样品实测体积。
6、样品中可溶性蛋白含量的测定从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2ml 、0.4ml 、0.5ml ，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm 和280nm 波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量：蛋白质浓度 (mg/ml) = (1.45A 280 – 0.74A 260) ×稀释倍数总蛋白（mg ）= 蛋白质浓度×样品液总体积五、结果与讨论将试验结果及相应的计算结果填入下表：相关计算公式：比活力U/mg =）总蛋白（）总活力（mg U ；纯化倍数=提取液比活力力粗酶液（或酶液）比活；回收率=提取液总活力力粗酶液（或酶液）总活六、思考题1、在SOD 酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？实验三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理；2、掌握垂直板电泳的操作方法；3、运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。
二、实验原理十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。
用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。
蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。
SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。