木蹄层孔菌产锰过氧化物酶的碳氮源优化及酶学性质
短小芽孢杆菌HR10产孢培养基及发酵条件优化
Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＨＲ１０ｉｓａｎｅｘｃｅｌｌｅｎｔｓｔｒａｉｎｗｉｔｈｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉａｄｖｅｒｓｉｔｙｅｆｆｅｃｔ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｏｆＨＲ１０ｓｔｒａｉｎｈａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｇｕｉｄｉｎｇｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒ ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎａｌａｒｇｅｒｓｃａｌｅ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｇｅｍｍａｅｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｂｙｄｉｌｕｔｅｄ ｓｐｒｅａｄｉｎｇｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｃａｌｃｕｌａｔｅｄｔｈｅｇｅｍｍａｒａｔｅ．Ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅａｎｄｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｆｏｒＨＲ１０ ｓｔｒａｉｎｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ，ａｎｄｔｈｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｅｖ ｅｒａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇＨＲ１０ｓｔｒａｉｎｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｓｈａｋｅｆｌａｓｋｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｏｆｓｔｒａｉｎＨＲ１０ｗｅｒｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ１％，ｍｏｌａｓｓｅｓ１％，ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｋｅｐｏｗｄｅｒ２％，ＫＣｌ０．３％，ＭｎＳＯ４０．４％．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：３７℃，ｐＨ７，２５０ｍＬｆｌａｓｋ ｆｉｌｌｅｄ５０％ ｖｏｌｕｍｅｗｉｔｈｌｉｑｕｉｄ，ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ５％，ｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄ２２０ｒ／ｍｉｎ，ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ５２ｈ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ ｇｅｍｍａｅｃａｎｒｅａｃｈ２．３７×１０１０ ｃｆｕ／ｍＬ，ａｎｄｔｈｅｇｅｍｍａｒａｔｅｃａｎｒｅａｃｈ９４．４６％．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｉｎｉｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ， ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｇｅｍｍａｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ６０．７７ｔｉｍｅｓ，ａｎｄｌａｉｄａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ；ＨＲ１０ｓｔｒａｉｎｇｅｍｍａｅ；ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ
茶树菇菌丝多糖发酵工艺优化
茶树菇菌丝多糖发酵工艺优化摘要：茶树菇富含抗癌多糖，一般以其子实体为材料进行提取获得，而子实体生长周期较长，利用液态发酵得到的菌丝提取茶树菇多糖可以有效缩短生产周期。
该试验以茶树菇菌丝为材料，以提高菌丝生物量和菌丝多糖含量为目标，通过单因素试验及响应面试验对培养基的碳源、氮源、促生长因子，培养时间及摇床转速进行优化。
结果表明，茶树菇菌丝发酵培养基组成为麦芽糖34 g/L、酵母提取粉21 g/L、MnSO42 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、MgSO4 1.5 g/L，pH6.0，培养条件为130 r/min摇床培养6 d。
在此条件下，发酵生产的茶树菇菌丝生物量为7.65 g/L，菌丝多糖含量达3.73%。
该结果可为茶树菇液态发酵生产茶树菇多糖提供参考。
关键词：茶树菇；菌丝多糖；响应面；液态发酵Optimization of fermentation technology of Agrocybeaegerita mycelial polysaccharideAbstract: The polysaccharose of Agrocybe aegerita was beneficial to cancer and was generally extracted from fruiting body.In order to shorten the production cycle, mycelium can be produced by liquid fermentation, because it uses a long time to produce the Agrocybe aegerita fruiting body. In order to optimize mycelial biomass and mycelial polysaccharose yield, the single factor experiment and the response surface testwhich took the mycelium of Agrocybe aegerita as the material was carried out from the factors of carbon source, nitrogen source, growth promoting, culture time and shaking speed. The result showed thatthe medium composition of Agrocybe aegerita mycelial fermentation was: maltose 34 g/L, yeast extract 21 g/L, MnSO42 g/L, KH2PO4 2.5 g/L, MgSO4 1.5 g/L, pH6.0, shaking for 6 days under the speed 130 r/min. Under this condition,the mycelial biomass of Agrocybe aegerita was 7.65 g/L, and the content of mycelial polysaccharose was 3.73%. The results can provide experimental data for liquid fermentation of Agrocybe aegerita mycelium polysaccharide.Key words:Agrocybe aegerita; mycelial polysaccharose; response surface; liquid fermentation茶树菇（Agrocybe aegerita）又称茶薪菇、杨树菇，属蘑菇菌目，粪伞科，田头菇属，是一种具有较高营养价值的野生蕈菌[1-3]。
食用菌——精选推荐
1.名词解释食用菌子实体含有或产生有性孢子的菌丝组织体菌丝体菌丝积聚成的菌丝群菌组织初生菌丝刚从担孢子萌发出的菌丝次生菌丝初生菌丝经双核化过程形成的异核的双核菌丝三生菌丝是已组织化的构成子实体的双核菌丝。
菌环内菌幕被撑破残留在菌柄上的单层或双层环状膜菌托外菌幕被撑破残留在菌柄基部发育成的杯状、苞状或环圈状的构造C/N 指碳源化合物与氮源化合物的质量之比白腐以降解木质素为主，残余海绵状；褐腐以降解纤维素为主，木质素也被降解，残余为粉碎状。
孢子印孢子按菌褶排列方式散落在纸上形成的图纹锁状联合指在双核菌丝上的横膈膜处产生的一个特征性的侧生突起。
2.简答1）解释“秋季是食用菌栽培的黄金季节”；气温较低、湿度较温度：小孢子萌发＞菌丝体生长＞子实体发育2）食用菌栽培原料一般不用松、杉及含芳香味的木屑，解释原因；被子植物：含有单宁，抑制酚氧化酶活性裸子植物：含有二苯代乙烯，阻止氧化磷酸化过程。
3）金针菇栽培过程中，出菇套袋有何作用？金针菇出菇阶段套袋主要是为了给子实体创造一个避光，适宜的二氧化碳浓度，保湿的生长环境，以利于金针菇子实体生长整齐，盖小，柄长的优质菇。
3.综述1）绘图说明锁状联合形成过程，并说明在科研、生产上有何用途？2）试辩证评价有毒蘑菇。
3）简述食用菌生长发育所需的环境条件诸因子须协调统一是食用菌栽培成功的基本要求。
1: 何谓食用菌的生活史？食用菌的生活史是指从孢子到孢子的整个生长发育过程。
2：用图表示伞菌的生活史。
担孢子萌发，生活史开始；初生菌丝(单核菌丝)开始发育；两条可亲和的单核菌丝通过融合进行质配，形成双核菌丝体。
在适宜的环境条件下，双核菌丝发育成结实性菌丝(三生菌丝)并组织化，产生子实体；在子实体发育成熟时，子实层中的部分细胞（菌褶表面或菌管内壁的双核菌丝的顶端细胞）在双核菌丝末端发育成棍棒状的担子细胞；来自两个亲本的一对交配型不同的单倍体核在担子中融合，进行核配，形成一个双倍体核。
食品酶学试卷[1]
![食品酶学试卷[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/2bee71ee551810a6f52486e1.png)
福建农林大学考试试卷（ A ）卷2006 ——2007学年第二学期课程名称：食品酶学考试时间120分钟食品科学与工程专业06 年级专升本班学号姓名一、名词解释（每小题3分，共12分）酶比活力：在特定条件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数，是酶制剂纯度的指标。
2、immobilized enzyme:固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。
3、chemical modification:酶的化学修饰：酶蛋白肽链上的某些基团，在另一种酶的催化下发生可逆的共价修饰，从而引起酶活性改变，这种调节称为酶的化学修饰。
4、polymerase chain reaction:聚合酶链式反应：以特定的基因片段为模板，利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核苷酸为底物，在DNA聚合酶的作用下，通过DNA模板的变性，达到基因扩增的目的。
二、判断题（正确的打“√”，错误的打“×”；每小题1分，共9分）1、钙离子的存在会显著抑制α－淀粉酶活性。
(×)2、木瓜蛋白酶对酯和酰胺类底物表现很高的活力。
(√)3、过氧化物酶是食品中一类最耐热的酶，采用电离辐射并结合加热处理才能完全破坏其活性。
(√)4、以酶浓度〔E〕与反应速度V表示的可逆抑制与不可逆抑制区别为V 正常可逆不可逆〔E〕(√)5、聚半乳糖醛酸酶能优先对甲酯含量低的水溶性果胶酸起水解作用。
(√)6、在检测过氧化物酶活性时，所用氢供体愈创木酚如呈褐色，说明酶未失活。
(√ )7、以吸附法固定化酶，酶与载体之间的结合力是氢键、配位键、范德华力。
(√ )8、酶纯化中所采用凝胶过滤法是根据酶分子电荷性质而定的。
(× )9、酶反应速度随底物浓度的提高而逐渐增大。
(× )三、简答题（每小题6分，共24分）答：细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖(Peptidoycan)。
沼泽红假单胞菌的培养优化及植物病害防治研究
1.1.2 试 剂 及 仪 器 试 剂：结 晶 乙 酸 度、pH 值等。以此作为初始数据，之后
钠、无水氯化钙、硫酸镁、葡萄糖、硫代 每天定时进行振荡摇匀操作和测量实
硫酸钠、次氯酸，酵母膏、尿素、复合 验数据。
肥 1（N-P2O5-K2O)、复合肥 2、磷酸二氢
上述实验完成后发现能使细菌
铵、硝酸铵。仪器：紫外分光光度计、照 生 长 较 好 的 N、P 源 有：磷 酸 二 氢 钾、
Study on Culture Optimization and Plant Disease Control of Rhodopseudomonas palustris
YAN Gang et al(Ludong University, Yantai, Shandong 264000)
Abstract Rhodopseudomonas palustris is a widely used photosynthetic bacterium， which is widely used in sewage treatment， agricultural planting， animal husbandry and aquaculture. In this experiment， the formula of culture medium was optimized under natural culture conditions， and the factors affecting bacterial growth in culture conditions were explored. Finally， the optimal concentration of sodium acetate from C source is 10 g/L， the optimal N and P source is compound fertilizer 2 (N: P: K = 15:15:15)， and the optimal concentration is 0.5g/l. The suitable culture conditions for bacterial growth are temperature above 25℃ ， light intensity above 4 000 lx and pH range of 7.5~8.0 In the experiment of plant disease control， the results showed that Rhodopseudomonas palustris had a significant inhibitory effect on jujube rust pathogen， root rot pathogen， brown rot pathogen and leaf mold pathogen. Key words Rhodopseudomonas palustris; Culture optimization; Plant disease prevention and control
微生物学 简答题
1、G+菌和G-菌细胞壁结构和组成上有何差别，以及与革兰氏染色反应的关系。
结构：G+菌细胞壁厚，仅1层；G-菌细胞壁薄，有多层。
组成：G+菌细胞壁含有肽聚糖且含量高、磷壁酸；G-菌细胞壁薄含有肽聚糖但含量低，不含磷壁酸，但含有脂多糖、膜蛋白等。
与革兰氏染色反应的关系：G+菌细胞壁含有肽聚糖且含量高，经酒精脱色时，失水网孔变小，能够阻止结晶紫和碘复合物被洗脱；而G-菌细胞壁的外膜易被酒精洗脱，内层肽聚糖层薄，不能够阻止结晶紫和碘复合物被洗脱。
2、什么是糖被，其成分是什么，有何功能。
成分：多糖和糖蛋白；功能：保护作用，贮藏养料，作为透性屏障和离子交换系统，表面附着作用，细菌间的信息识别作用，堆积代谢废物；3、试述一位著名的微生物学家对微生物学的主要贡献？你从中有何启发。
巴斯德：发酵的实质；否定了生物的自然发生说；巴斯德消毒法；疫苗生产法。
启发：勇于实践，实践－理论－实践。
勤奋。
不畏权威。
4、简述原核微生物和真核微生物的主要区别?原核微生物：是指一大类细胞核无核膜包裹，只有称为核区的裸露的DNA的原始的单细胞生物，包括古细菌和真细菌两大类。
真核微生物：是指细胞核具有核膜，能进行有丝分裂，细胞质中存有线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的微生物，包括真菌、微藻类、原生动物、地衣等。
原核微生物与真核微生物的主要区别：比较项目真核微生物原核微生物细胞大小较大（通常直径＞2微米）较小若有壁，其主要成分纤维素、几丁质多数为肽聚糖细胞膜中甾醇有无（支原体例外）细胞膜含呼吸和光组分无有细胞器有无鞭毛结构如有则粗而复杂（9+2型）如有则细而简单核膜有无DNA含量底（约5％）高（约10％）组蛋白有少核仁有无染色体数一般大于1 一般为1有丝分裂有无减数分裂有无鞭毛运动方式挥鞭毛旋转马达式遗传重组方式有性生殖、准性生殖转化、转导、接合繁殖方式有性、无性等多种一般为无性（二等分裂）5、试述革兰氏染色方法步骤及原理。
简要方法步骤：涂片→干燥→ 冷却→ 结晶初染→碘液媒染→酒精脱色→番红复染→干燥→镜检。
白腐真菌降解木质素的营养调控
白腐真菌降解木质素主要是通过其分泌的胞外过氧化物酶系统来完成的"’(()，*++%&。
涉及木质素多聚物降解的主要有%种酶，即木质素过氧化物酶",-.(-(/0123-4560：,78&、依赖锰的过氧化物酶"95(.5(060:40/0(40(;/0123-4560< 9(8&和漆酶",5==560&>,78和9(8都含亚铁血红素的糖蛋白，并且发现有多种同工酶。
它们的存在和酶活性对不同的菌种是不同的"?-1@5(4A5110BC*+!D&，因为具有不同特性的酶的不同表达是生物降解底物以获得营养的最有效途径。
*木质素降解酶体系的营养调控胞外酶在木质素的生物降解过程中起着关键作用，但是大多数真菌在自然条件下酶的合成量较低或几乎没有，并且许多酶的作用不能充分地发挥出来。
此外对大多数白腐真菌来说，与木质素降解有关的酶都是次生代谢中产生的，改变营养条件"如增加培养基中的葡萄糖&可抑制次生代谢而产生大量的初生代谢的酶类，如纤维素酶和半纤维素酶"李越中等，*++E&，从而降解掉更多的纤维素和半纤维素。
因此为提高酶的产量，增加酶的活性和选择性，国内外对木质素降解的各种酶及其同工酶的调控方面进行了大量的研究，包括从氮源和碳源的含量和形式、碳氮比例、锰的浓度、氧的浓度、木质素模型物的诱导及微量元素的作用等方面进行调控。
*F*木质素过氧化物酶",78&的营养调控李越中等"*++E&研究了不同的营养条件对8・=G1H626/21-IJ的,78合成的影响，结果表明对于碳源，K:葡萄糖有利于,78的合成，但淀粉不完全水解产生的环状糊精产酶比K:葡萄糖还高；多种单糖同时存在时的产酶量比单用葡萄糖高。
有机氮酵母浸汁培养基中,78酶活性最高，以酒石酸铵为氮源菌丝体的产酶效率最好。
某理工大学《微生物学教程》考试试卷(1040)
某理工大学《微生物学教程》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（230分，每题5分）1. 有些假单胞菌可以利用多达90种以上的碳源物质。
（）答案：正确解析：假单胞菌广泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空气中。
有荚膜、鞭毛和菌毛。
营养要求不高，种类多，可以利用多达90种以上的碳源物质。
2. 大多数真菌需要高碳氮比的营养物，而动物致病细菌需要低碳氮比的营养物。
（）答案：正确解析：不同生物的碳氮比不同，故所需营养物的碳氮比也不同，具有高碳氮比的生物需要碳氮比的营养物，反则反之。
真菌的碳氮比大于动物致病细菌，故真菌所需营养物的碳氮比高于动物致病菌。
3. 链激酶又称血纤维蛋白溶酶，可直接把血浆中的纤维蛋白凝块水解。
（）答案：错误解析：链激酶能激活血纤维中蛋白溶酶原，使之变成血纤维蛋白溶酶，再由后者把血浆中的纤维蛋白凝块水解，从而有利于病原体在组织中扩散。
4. 根据16S和18S rRNA测序和统计结果所提出的三域学说来看，真核生物域与古生菌域更为接近。
（）答案：正确解析：三域学说是Woese等人对大量微生物进行16S和18S rRNA核苷酸顺序的同源性测定并比较其同源性水平后提出的。
三个域指细菌域、古生菌域和真核生物域。
古生菌在分类地位上与真细菌和真核生物并列，并且在进化谱系上更接近真核生物。
5. 一个酵母菌细胞上，只可能有一个蒂痕，但芽痕则可以有多个。
（）答案：正确解析：酵母细胞最常见的繁殖方式是出芽繁殖，芽体与母细胞分离时，会在母细胞上留下一个芽痕，相应的在子细胞上留下蒂痕。
故一个酵母菌细胞上只有一个蒂痕，但多次出芽后会形成多个芽痕。
6. 青霉素是肽聚糖单体五肽尾末端的D丙氨酰D丙氨酸的结构类似物，故可与后者相互竞争转肽酶的活性中心。
（）[华中农业大学2017研；南开大学2012研]答案：正确解析：7. 无氧呼吸是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。
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研究木蹄层孔菌产锰过氧化酶的最适碳源和氮源，揭示锰过氧化物酶的培养方式、最适ｐＨ值和ｐＨ耐受性、最适温度和温度耐受性、金属离子对其影响等特征。
木蹄层孔菌在静置培养时产锰过氧化物酶显著高于振荡培养。
小麦麸皮２３ｇ／Ｌ和蛋白胨２ｇ／Ｌ是最佳组合的碳源和氮源。
锰过氧化物酶在ｐＨ值为４．５或温度为５０℃时酶活力最高。
酶在ｐＨ值４．０～４．５或温度３０℃以下处理２４ｈ后，仍可保持８０％以上的酶活力。
底物为愈创木酚时，锰过氧化物酶的Ｋｍ值为０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为０．１２ｍｍｏｌ／Ｌ·ｍｉｎ。
当添加的金属离子浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，与对照相比，Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｏ２＋和Ｎａ＋可极显著抑制ＭｎＰ活力。
当添加的金属离子浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ，与对照相比，除Ｍｇ２＋外，其他金属离子均能极显著抑制酶的活力。
Ｍｇ２＋１、１０ｍｍｏｌ／Ｌ对酶的活力没有影响。
木蹄层孔菌适合在静置培养时产锰过氧化物酶，最适碳源和氮源分别为小麦麦麸和蛋白胨，酶在室温和偏酸性环境中耐受性较好，并对Ｍｇ２＋有较好耐受性。
关键词：木蹄层孔菌；锰过氧化物酶；碳氮源；酶学性质 中图分类号：Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）１５－０２７３－０５收稿日期：２０１８－０３－３０基金项目：北方民族大学校级科研项目（编号：２０１８ＸＹＺＳＫ０５）；宁夏自然科学基金（编号：ＮＺ１７１１０）。
作者简介：尚 洁（１９７９—），女，宁夏中卫人，博士，副教授，主要从事白腐真菌木质纤维素降解研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｎｇｊｉｅ＠１２６．ｃｏｍ。
木质素是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大生物高分子材料，在能源和日用化工品应用方面具有巨大的潜在价值。
锰过氧化物酶（ＭｎＰ，Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１３）是一种含有血红素和Ｍｎ２＋结合部位的过氧化物酶，它在木质素降解过程中发挥着重要的作用。
ＭｎＰ通过氧化Ｍｎ２＋为Ｍｎ３＋直接氧化木质素，并将Ｍｎ３＋分泌到胞外。
除了解聚天然和合成木质素，ＭｎＰ还具有修复工业废料的巨大潜能，如降解难处理的工业污染物。
ＭｎＰ能够有效地进行合成染料的脱色，如甲基橙［１］和三苯甲烷类染料［２］，这种潜在的能力已经引起了广泛的关注。
除了染料脱色，白腐真菌分泌的ＭｎＰ还可以用于降解持久性有机污染物，如多环芳烃［３］、２，４，６－三硝基甲苯［４］和联苯中间代谢物［５］。
如何提高白腐真菌ＭｎＰ产量，提高酶的活性成为人们日益关心的问题。
因此，产酶条件的优化和酶学特性的研究，将有助于ＭｎＰ的产量增加，酶活力的提高，使ＭｎＰ能够在未来更好地应用于各个领域。
木蹄层孔菌（Ｆｏｍｅｓｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）是担子菌门的一种白腐真菌，常见于桦树和杨树，广泛存在于非洲、亚洲、欧洲和北美洲，在我国主要分布于东北地区、西北地区和西南地区。
前期研究发现，木蹄层孔菌能够有效降解白桦中的木质素，保留较高含量的纤维素和较低含量的１％ＮａＯＨ和苯醇抽出物［６］，在白桦生物转化中具有潜在的应用价值。
本研究进行了木蹄层孔菌产ＭｎＰ的碳氮源优化及酶学性质研究，旨在为今后ＭｎＰ的利用提供相关理论依据。
—３７２—江苏农业科学 ２０１９年第４７卷第１５期１ 材料与方法１．１ 材料试验于２０１３年９月至２０１４年３月在宁夏回族自治区北方民族大学进行。
木蹄层孔菌为北方民族大学生物化学实验室保存，４℃生长于木屑麦麸培养基（７８％白桦木屑、２０％麦麸、１％ＣａＳＯ４·Ｈ２Ｏ、１％蔗糖）。
马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）培养基（１Ｌ）：马铃薯２００ｇ、葡萄糖２０ｇ、琼脂２０ｇ、ｐＨ值自然。
基础培养基［７］（１Ｌ）：葡萄糖１０．０ｇ、酒石酸胺０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２．０ｇ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ、ＣａＣｌ２０．１ｇ、琥珀酸（二）甲酯１．３ｍＬ、微量元素７０．０ｍＬ、硫胺素（维生素Ｂ１）１．０ｍｇ。
其中微量元素１Ｌ：ＭｇＳＯ４３．０ｇ、ＭｎＳＯ４０．５ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．１ｇ、ＣａＣｌ２０．１ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．１ｇ、ＣｕＳＯ４０．１ｇ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２·１２Ｈ２Ｏ１０．０ｍｇ、ＮａＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ１０．０ｍｇ、次氮基三乙酸酯（ＮＴＡ）１．５ｇ。
１．２ 方法１．２．１ 粗酶液的制备 将木蹄层孔菌接种到ＰＤＡ固体培养基上，２８℃避光培养约７ｄ待菌丝长满培养皿。
取２个直径６ｍｍ的菌饼接入装有１５ｍＬ液体培养基的三角瓶（１００ｍＬ）中，２８℃避光静置培养。
另取６个直径为６ｍｍ的菌饼接入装有４５ｍＬ液体培养基的三角瓶（１００ｍＬ）中，２８℃１８０ｒ／ｍｉｎ避光振荡培养。
取液体培养基，４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液即为粗酶液。
１．２．２ ＭｎＰ活力测定 ＭｎＰ酶活定义为１ｍｉｎ内催化氧化１μｍｏｌ／Ｌ愈创木酚所需的酶量为１个酶活力单位（Ｕ）。
酶活测定体系包括５００μＬ的粗酶液，３００μＬ的４ｍｍｏｌ／Ｌ的愈创木酚溶液，１５００μＬ的酒石酸钠缓冲溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值５），６０μＬ的１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｎＳＯ４溶液，６０μＬ的５ｍｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２，５８０μＬ的Ｈ２Ｏ。
测定温度为３０℃时，４６５ｎｍ［ε＝１．２１×１０４Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）］波长处２ｍｉｎ内吸光度的变化。
１．２．３ 碳源和氮源的优化 试验采用单因素试验，考察不同碳源和氮源对木蹄层孔菌产ＭｎＰ的影响。
根据单因素试验结果，对最佳碳源和氮源进行２个因素４个水平正交试验，以获得碳源和氮源的最佳浓度。
正交试验因素水平见表１。
表１ 木蹄层孔菌产ＭｎＰ碳氮源正交试验因素水平设计水平因素Ａ：碳源（ｇ／Ｌ）Ｂ：氮源（ｇ／Ｌ）１２０１．５２２３２．０３２６２．５４２９３．０１．２．４ 酶反应的最适ｐＨ值和ｐＨ值耐受性 分别在温度４℃，ｐＨ值为３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０的缓冲液中测定粗酶液中ＭｎＰ活力。
同时，将粗酶液和ｐＨ值为３．０、３．５、４．０、４ ５、５．０、５．５、６．０的缓冲液混合温度为在４℃保持１ｈ和２４ｈ，测定粗酶液中ＭｎＰ活力。
试验中的最高酶活定义为１００％。
１．２．５ 酶反应的最适温度和热耐受性 在最适ｐＨ值，温度为２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃条件下分别测定粗酶液中ＭｎＰ活力。
同时，分别在温度为２０、３０、４０、５０、６０℃条件下将粗酶液保温１ｈ和２４ｈ，测定粗酶液中ＭｎＰ活力。
试验中的最高酶活力定义为１００％。
１．２．６ 金属离子对酶反应的影响 在粗酶液中分别添加终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ和１０ｍｍｏｌ／Ｌ的钙（Ｃａ２＋）、铁（Ｆｅ２＋）、镁（Ｍｇ２＋）、铜（Ｃｕ２＋）、钡（Ｂａ２＋）、锰（Ｍｎ２＋）、锌（Ｚｎ２＋）、钠（Ｎａ＋）、钴（Ｃｏ２＋）、钾（Ｋ＋）。
最适ｐＨ值条件下，温度为３０℃保温１ｈ后测定粗酶液中ＭｎＰ活力。
试验中未添加金属离子的酶活定义为１００％。
１．２．７ ＭｎＰ的动力学研究 当愈创木酚浓度为０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ时，测定粗酶液中的ＭｎＰ活力。
１．２．８ 统计分析 本试验中所有数据均平行重复３次，结果为“平均值±标准差”。
结果使用统计分析软件ＳＰＳＳ进行邓肯多重比较。
２ 结果与分析２．１ 培养方式对木蹄层孔菌产ＭｎＰ的影响振荡培养和静置培养对木蹄层孔菌ＭｎＰ活力的影响，结果见图１。
将木蹄层孔菌在液体培养基中分别培养６、９、１２ｄ后，静置培养产生的ＭｎＰ活力均显著高于振荡培养。
其中，静置培养９ｄ产生的ＭｎＰ活力最大，达到８９．１６Ｕ／Ｌ，相同条件下静置培养是振荡培养（２１．０４Ｕ／Ｌ）的４．２倍。
同时研究发现，静置培养９ｄ与静置培养１２ｄ的酶活力差异不显著。
２．２ 碳源和氮源的选择２．２．１ 不同碳源的选择 在培养基中分别添加１０ｇ／Ｌ的可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、白桦木屑、麦麸作为碳源，研究不同碳源对木蹄层孔菌ＭｎＰ活力的影响。
试验结果见图２，以麦麸作为碳源时，在１０、１２、１４ｄ产生的ＭｎＰ活力均显著高于以玉米粉、白桦木屑作为碳源产生的酶活力。