11-生物技术与人类未来
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目的基因（又称外源基因）； 1）获得需要的目的基因 目的基因 2）目的基因在限制性内切酶和连接酶作用下与载体连 重组DNA分子（克隆和筛选）； 接，形成新的重组DNA分子 重组DNA分子 3）用重组的DNA分子转化 转化受体细胞，使之进入受体细 转化 胞并能在受体细胞中复制和遗传（转化或转染） ； 4）对转化子即获得外源基因的受体细胞进行筛选和鉴 定；(阳性克隆) 5）对获得外源基因的细胞或生物体通过发酵、细胞培 养、养殖或栽培等，最终获得所需的遗传性状或表 达出所需要的产物。
目前最常用的原核细胞的克隆载体包括细菌质粒、 DNA。 λ噬菌体、cosmid质粒等DNA DNA
质粒载体
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个 质粒可以大量 增加其拷贝数。
DNA克隆常用 DNA克隆常用 的质粒载体— 质粒载体—
一种改进的pUC18 一种改进的pUC18
(用标记的单链DNA为探针 探针,与基因组文库杂交 杂交，筛出含有目的基因的菌 探针 杂交 株或噬菌体，将筛出的克隆扩大培养，从中就可调出足够量的目的基因 目的基因） 目的基因
大肠杆菌 质粒载体
噬菌体 载体
逆转录人工合成互补DNA－cDNA文库 互补DNA 文库的构建 (2) 逆转录人工合成互补DNA－cDNA文库的构建
微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后， 才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。
（和连接酶）
限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 限制性内切酶 可以识别并切开核酸序列的特定位点,称分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方 面的开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
生物技术具有多学科交叉和综合运用的特点：
1）其理论来源于实验室大量复杂的基础研究工作 2）是建立在多学科基础上，涉及面广泛的综合性技术。直接 相关的学科至少包括微生物学、分子生物学、化学工程等
生物技术的显著特点：三高一长
1)高技术 高技术:是科学研究密 高技术 集程度最高的产业之一 2)高投入 高投入 3)高利润 高利润
生物技术的定义和特点
1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术 是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动 物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品 为社会服务的技术。 美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应用生 物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术， 其中还包括改良有重要经济价值的植物与动物以及 利用微生物改良环境的技术。 该定义强调了生物技术的商品属性 商品属性。生物工程-应 商品属性 用
现代生物技术发展大事记 现代生物技术发展大事记
1953年 1953年 Watson、Crick发现DNA双螺旋结构 1973年 1973年 Cohn和Boyer等完成了DNA体外重组，一 举打开基因工程学大门 1975年 1975年 Kohler和Milstein创立了单克隆抗体杂 交瘤技术 1976年 1976年 Swanson与Cohn合作，全球第一家生物技 术公司－GeneTech公司问世 1982年 1982年 第一个用基因工程技术生产的药物－人 工胰岛素上市 1988年 美国K Mullis发明PCR技术 1997年 1997年 英国Wilmut等完成首例哺乳动物－绵阳 “多莉”的克隆，生物芯片问世 1990年 人类基因组计划启动，2000年 人类基因 2000年 2000 组工作框架图完成标志功能基因组时代的到来
↓利用生物技术的生产线
周期长--高风险
11.2
生物技术包含的主要内容：
通常生物技术或生物工程主要包括基因工程 基因工程、蛋白质 基因工程 （酶）工程、发酵工程及细胞工程这四大工程，此 外，基因诊断与基因治疗技术、单克隆抗体技术、克 隆动物技术、生物芯片技术以及生物材料、生物能源 技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物等方面的 技术都可属生物技术范畴的内容。 对人类和社会生活影响最大的生物技术领域还可按行 业分为：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技 术、海洋生物技术、材料生物技术、能源生物技术等 等。内容非常广泛，都隐含良好应用前景和商机。
PCR技术的发明
由美国科学家Kary Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋 行驶的汽车——一小段DNA引物 …… 1988年发明了PCR技术 1993年Mullis教授获得 了诺贝尔奖
已在分子生物学、医学、考古 学、法学、人类学等领域广泛应用
■
基因重组和克隆
基因重组和克隆操作最重要的工具有以下3个： (1) 限制性内切酶 (2) 载体 (3) 宿主菌
ⅲ) 在pUC18中有一小
段人为设计和插入的具 有多种限制性酶切位点 的序列，即质粒上带有 多克隆位点。 多克隆位点
ⅳ)带有筛选标记-如lacZ基因，即β半乳糖苷酶的基因 筛选标记 β
pUC118质粒的多克隆位 点MCS整合 整合在lacZ基因中， lacZ 整合 基因编码β半乳糖苷酶的一个亚基， X gal 可以使细菌在含有X-gal底物（一 种半乳糖）和IPTG IPTG（一种乳糖类 IPTG 似物）的平板培养基上形成蓝色 蓝色 的菌落，即X-gal被产生的lacZ酶 的菌落 水解成蓝色。但是，当外源DNA片 段插入到多克隆位点区时，就破 坏了lacZ基因的结构，使 lacZ基 因失去了活性和表达功能，因此， 外源DNA插入的质粒进入的大肠杆 菌就形成白色菌落,也就是说,凡 形成白色菌落 白色菌落的细菌就是携带有 白色菌落 插入片段重组质粒的细菌。
载体： 载体：
因为切割的DNA并不能直接进入到细菌等宿主细胞中,需 要通过合适载体才可能转入到宿主细胞中,并随宿主细胞繁殖 而复制。载体就是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具 工具。 工具
通常载体要求具备以下特性：
①具有合适的限制性酶切位点 (克隆位点) 限制性酶切位点 ②能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 ③ 细胞内拷贝数要多 ④具有合适的筛选标记 筛选标记 ⑤通常载体的分子量要小（但有时要求载体分子量要大些） ⑥ 细胞内稳定性高
(3) 聚合酶链式反应（即PCR技术 PCR技术） 技术 PCR技术就是在体外的小试管中通过酶促反应有选择 地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 优点：高效、快捷、特异性好。 完成PCR的条件--需在小试管中加入4种物质：
① 作为模板的DNA 模板的DNA 模板的DNA序列－－即细胞中提取的微量总DNA； ② 与计划获取的目的基因双链各自3’端序列相互补的两种 3 DNA引物 引物（人工合成的约20个碱基的短DNA单链）； 引物 ③ Taq--DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶； ④ 4种脱氧核苷酸 4×dNTP（即dATP, dTTP, dGTP和dCTP）
mRNA 逆 转录 cDNA (互补DNA） 第二条DNA链 克隆、转染、 建库
基因组文库与cDNA文库的比较
构建基因组文库获取目 的基因存在的问题： 费时费事 有内含子序列 cDNA文库的优势： 1、 不含内含子序 列 2、获取的DNA片段 就是具有特定功能的目 目 的基因 3、可反映细胞代 谢的差异
（全世界生物技术产业还只处于初期发展阶段）
克隆(clone)---无性繁殖（系） 克隆 分子克隆– DNA的无性繁殖技术 分子克隆 上游和下游技术 从研发到进入市场，需要的周期长，至少5年以上
（从1973年实现DNA重组开始）
←重组DNA技 重组DNA技
术图示
（大肠杆菌为例）
重组DNA技术--基因工程操作的一般步骤
wk.baidu.com
→
质 粒 载 体 的 一 般 结 构
例如：细菌质粒pUC18就是一种已被改造的适用的载体 例如：细菌质粒pUC18就是一种已被改造的适用的载体 它有以下特点：
ⅰ) 该质粒比较小 比较小,但可以插入一段较长的DNA片段。 比较小 ⅱ) 进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复
多拷贝。通过宿主的无性繁殖， 制形成大约500个多拷贝 多拷贝 质粒中的外源基因被大量复制的过程称为克隆。
(1) 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建
细胞内总DNA（基因组DNA）的分离提取如下图 分离程序: 苯酚变性 沉淀蛋白 质,离心取 上清，乙 醇沉淀提 取DNA
基因组DNA文库(genomic DNA library)的构建 将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶 电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分 克隆到细菌质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外 别克隆 克隆 包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。
聚合酶链式反应步骤：
变性、退火、延伸 三步曲 变性：双链DNA解链 成为单链DNA 退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合 延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
聚合酶链式反应（PCR）
每一轮聚合酶链式反应可 使目的基因片段增加一倍 理论上30轮循环，目的基 因就被选择性放大获得230 （1.07×109)个基因片段 循环反应在特制的PCR仪中 可自动进行，直到完成 PCR的发明是DNA操作技术 的革命
生物科学成为当今世界自然科学的热点和重 点，主要由于两方面的原因：
（1）二十世纪后叶，分子生物学等领域一系列突 破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生 了革命性的变化； （2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展 为人类带来了巨大的利益和财富。
生物技术将是未来经济发展的新动力
第一次技术革命 第二次技术革命 第三次技术革命 工业革命 信息技术 生物技术 解放人的双手 扩展人的大脑 改造生命本身
已经发现和鉴定的限制性内切酶有200多种
限制性内切酶切与DNA重组的操作： DNA重组的操作：
基因体外重组（基因克隆） 基因体外重组（基因克隆）
1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn Cohn和美国加州大学 Cohn 教授Boyer Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA Boyer 体外重组，打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重 打开了基因工程学大门。 壁垒，一举打开了基因工程学大门 打开了基因工程学大门
11 生物技术与人类未来
11.1 生物技术定义 11.2 生物技术的方法和主要内容
一、基因工程-DNA重组技术与蛋白质工程 二、发酵工程 三、细胞工程 四、动物克隆技术 五、干细胞技术 六、生物芯片技术
11.3 生物技术的应用 11.4 生物技术面临的问题与挑战 11.5 生物技术造福人类
11.1 生物技术的定义和发展概况
■
获得目的基因（外源基因）
获得需要的目的基因最常用的方法：
（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA 文库 基因组DNA 基因组 DNA文库 (genomic DNA library)，从文库中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立 cDNA文库 文库， cDNA文库，从文库中调用； （3）利用聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链式反应（PCR 聚合酶链式反应 PCR）特异性地扩增得到所 需要的目的基因片段； 此外，还有化学合成等方法。 （略）
一、基因工程与蛋白质工程
基因工程:是指在分子 : 水平，设计并实施把 一个生物体中有用的 目的基因 或DNA(遗传 信息) 转入另一个生物 体中，使后者获得新的 遗传性状或表达所需要 的产物。最终实现该技 术的商业价值。 基因工程与建筑工程雷同
基因工程技术是现代生物技术的基础 基因工程技术
基因工程的核心技术就是通过以基因克隆和重组为主 的一系列的分子生物学操作技术，实现不同物种间基 因的转移。又称为重组DNA技术。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起， 并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
限制性内切酶：
识别特定的核苷酸序列 的核酸内切酶。一般识别 长度为4~6个碱基对，又称 为切割工具酶。
例 如 ： EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互补碱基组成的双 链。
DNA片段经内切酶酶切 后形成粘性末端或平端， 互补的粘性末端或平端用 T4连接酶可连接起来
限制性内切酶-DNA的分子刀 限制性内切酶-DNA的分子刀
目前最常用的原核细胞的克隆载体包括细菌质粒、 DNA。 λ噬菌体、cosmid质粒等DNA DNA
质粒载体
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个 质粒可以大量 增加其拷贝数。
DNA克隆常用 DNA克隆常用 的质粒载体— 质粒载体—
一种改进的pUC18 一种改进的pUC18
(用标记的单链DNA为探针 探针,与基因组文库杂交 杂交，筛出含有目的基因的菌 探针 杂交 株或噬菌体，将筛出的克隆扩大培养，从中就可调出足够量的目的基因 目的基因） 目的基因
大肠杆菌 质粒载体
噬菌体 载体
逆转录人工合成互补DNA－cDNA文库 互补DNA 文库的构建 (2) 逆转录人工合成互补DNA－cDNA文库的构建
微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后， 才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。
（和连接酶）
限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 限制性内切酶 可以识别并切开核酸序列的特定位点,称分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方 面的开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
生物技术具有多学科交叉和综合运用的特点：
1）其理论来源于实验室大量复杂的基础研究工作 2）是建立在多学科基础上，涉及面广泛的综合性技术。直接 相关的学科至少包括微生物学、分子生物学、化学工程等
生物技术的显著特点：三高一长
1)高技术 高技术:是科学研究密 高技术 集程度最高的产业之一 2)高投入 高投入 3)高利润 高利润
生物技术的定义和特点
1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术 是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动 物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品 为社会服务的技术。 美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应用生 物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术， 其中还包括改良有重要经济价值的植物与动物以及 利用微生物改良环境的技术。 该定义强调了生物技术的商品属性 商品属性。生物工程-应 商品属性 用
现代生物技术发展大事记 现代生物技术发展大事记
1953年 1953年 Watson、Crick发现DNA双螺旋结构 1973年 1973年 Cohn和Boyer等完成了DNA体外重组，一 举打开基因工程学大门 1975年 1975年 Kohler和Milstein创立了单克隆抗体杂 交瘤技术 1976年 1976年 Swanson与Cohn合作，全球第一家生物技 术公司－GeneTech公司问世 1982年 1982年 第一个用基因工程技术生产的药物－人 工胰岛素上市 1988年 美国K Mullis发明PCR技术 1997年 1997年 英国Wilmut等完成首例哺乳动物－绵阳 “多莉”的克隆，生物芯片问世 1990年 人类基因组计划启动，2000年 人类基因 2000年 2000 组工作框架图完成标志功能基因组时代的到来
↓利用生物技术的生产线
周期长--高风险
11.2
生物技术包含的主要内容：
通常生物技术或生物工程主要包括基因工程 基因工程、蛋白质 基因工程 （酶）工程、发酵工程及细胞工程这四大工程，此 外，基因诊断与基因治疗技术、单克隆抗体技术、克 隆动物技术、生物芯片技术以及生物材料、生物能源 技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物等方面的 技术都可属生物技术范畴的内容。 对人类和社会生活影响最大的生物技术领域还可按行 业分为：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技 术、海洋生物技术、材料生物技术、能源生物技术等 等。内容非常广泛，都隐含良好应用前景和商机。
PCR技术的发明
由美国科学家Kary Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋 行驶的汽车——一小段DNA引物 …… 1988年发明了PCR技术 1993年Mullis教授获得 了诺贝尔奖
已在分子生物学、医学、考古 学、法学、人类学等领域广泛应用
■
基因重组和克隆
基因重组和克隆操作最重要的工具有以下3个： (1) 限制性内切酶 (2) 载体 (3) 宿主菌
ⅲ) 在pUC18中有一小
段人为设计和插入的具 有多种限制性酶切位点 的序列，即质粒上带有 多克隆位点。 多克隆位点
ⅳ)带有筛选标记-如lacZ基因，即β半乳糖苷酶的基因 筛选标记 β
pUC118质粒的多克隆位 点MCS整合 整合在lacZ基因中， lacZ 整合 基因编码β半乳糖苷酶的一个亚基， X gal 可以使细菌在含有X-gal底物（一 种半乳糖）和IPTG IPTG（一种乳糖类 IPTG 似物）的平板培养基上形成蓝色 蓝色 的菌落，即X-gal被产生的lacZ酶 的菌落 水解成蓝色。但是，当外源DNA片 段插入到多克隆位点区时，就破 坏了lacZ基因的结构，使 lacZ基 因失去了活性和表达功能，因此， 外源DNA插入的质粒进入的大肠杆 菌就形成白色菌落,也就是说,凡 形成白色菌落 白色菌落的细菌就是携带有 白色菌落 插入片段重组质粒的细菌。
载体： 载体：
因为切割的DNA并不能直接进入到细菌等宿主细胞中,需 要通过合适载体才可能转入到宿主细胞中,并随宿主细胞繁殖 而复制。载体就是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具 工具。 工具
通常载体要求具备以下特性：
①具有合适的限制性酶切位点 (克隆位点) 限制性酶切位点 ②能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 ③ 细胞内拷贝数要多 ④具有合适的筛选标记 筛选标记 ⑤通常载体的分子量要小（但有时要求载体分子量要大些） ⑥ 细胞内稳定性高
(3) 聚合酶链式反应（即PCR技术 PCR技术） 技术 PCR技术就是在体外的小试管中通过酶促反应有选择 地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 优点：高效、快捷、特异性好。 完成PCR的条件--需在小试管中加入4种物质：
① 作为模板的DNA 模板的DNA 模板的DNA序列－－即细胞中提取的微量总DNA； ② 与计划获取的目的基因双链各自3’端序列相互补的两种 3 DNA引物 引物（人工合成的约20个碱基的短DNA单链）； 引物 ③ Taq--DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶； ④ 4种脱氧核苷酸 4×dNTP（即dATP, dTTP, dGTP和dCTP）
mRNA 逆 转录 cDNA (互补DNA） 第二条DNA链 克隆、转染、 建库
基因组文库与cDNA文库的比较
构建基因组文库获取目 的基因存在的问题： 费时费事 有内含子序列 cDNA文库的优势： 1、 不含内含子序 列 2、获取的DNA片段 就是具有特定功能的目 目 的基因 3、可反映细胞代 谢的差异
（全世界生物技术产业还只处于初期发展阶段）
克隆(clone)---无性繁殖（系） 克隆 分子克隆– DNA的无性繁殖技术 分子克隆 上游和下游技术 从研发到进入市场，需要的周期长，至少5年以上
（从1973年实现DNA重组开始）
←重组DNA技 重组DNA技
术图示
（大肠杆菌为例）
重组DNA技术--基因工程操作的一般步骤
wk.baidu.com
→
质 粒 载 体 的 一 般 结 构
例如：细菌质粒pUC18就是一种已被改造的适用的载体 例如：细菌质粒pUC18就是一种已被改造的适用的载体 它有以下特点：
ⅰ) 该质粒比较小 比较小,但可以插入一段较长的DNA片段。 比较小 ⅱ) 进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复
多拷贝。通过宿主的无性繁殖， 制形成大约500个多拷贝 多拷贝 质粒中的外源基因被大量复制的过程称为克隆。
(1) 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建
细胞内总DNA（基因组DNA）的分离提取如下图 分离程序: 苯酚变性 沉淀蛋白 质,离心取 上清，乙 醇沉淀提 取DNA
基因组DNA文库(genomic DNA library)的构建 将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶 电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分 克隆到细菌质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外 别克隆 克隆 包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。
聚合酶链式反应步骤：
变性、退火、延伸 三步曲 变性：双链DNA解链 成为单链DNA 退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合 延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
聚合酶链式反应（PCR）
每一轮聚合酶链式反应可 使目的基因片段增加一倍 理论上30轮循环，目的基 因就被选择性放大获得230 （1.07×109)个基因片段 循环反应在特制的PCR仪中 可自动进行，直到完成 PCR的发明是DNA操作技术 的革命
生物科学成为当今世界自然科学的热点和重 点，主要由于两方面的原因：
（1）二十世纪后叶，分子生物学等领域一系列突 破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生 了革命性的变化； （2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展 为人类带来了巨大的利益和财富。
生物技术将是未来经济发展的新动力
第一次技术革命 第二次技术革命 第三次技术革命 工业革命 信息技术 生物技术 解放人的双手 扩展人的大脑 改造生命本身
已经发现和鉴定的限制性内切酶有200多种
限制性内切酶切与DNA重组的操作： DNA重组的操作：
基因体外重组（基因克隆） 基因体外重组（基因克隆）
1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn Cohn和美国加州大学 Cohn 教授Boyer Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA Boyer 体外重组，打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重 打开了基因工程学大门。 壁垒，一举打开了基因工程学大门 打开了基因工程学大门
11 生物技术与人类未来
11.1 生物技术定义 11.2 生物技术的方法和主要内容
一、基因工程-DNA重组技术与蛋白质工程 二、发酵工程 三、细胞工程 四、动物克隆技术 五、干细胞技术 六、生物芯片技术
11.3 生物技术的应用 11.4 生物技术面临的问题与挑战 11.5 生物技术造福人类
11.1 生物技术的定义和发展概况
■
获得目的基因（外源基因）
获得需要的目的基因最常用的方法：
（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA 文库 基因组DNA 基因组 DNA文库 (genomic DNA library)，从文库中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立 cDNA文库 文库， cDNA文库，从文库中调用； （3）利用聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链式反应（PCR 聚合酶链式反应 PCR）特异性地扩增得到所 需要的目的基因片段； 此外，还有化学合成等方法。 （略）
一、基因工程与蛋白质工程
基因工程:是指在分子 : 水平，设计并实施把 一个生物体中有用的 目的基因 或DNA(遗传 信息) 转入另一个生物 体中，使后者获得新的 遗传性状或表达所需要 的产物。最终实现该技 术的商业价值。 基因工程与建筑工程雷同
基因工程技术是现代生物技术的基础 基因工程技术
基因工程的核心技术就是通过以基因克隆和重组为主 的一系列的分子生物学操作技术，实现不同物种间基 因的转移。又称为重组DNA技术。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起， 并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
限制性内切酶：
识别特定的核苷酸序列 的核酸内切酶。一般识别 长度为4~6个碱基对，又称 为切割工具酶。
例 如 ： EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互补碱基组成的双 链。
DNA片段经内切酶酶切 后形成粘性末端或平端， 互补的粘性末端或平端用 T4连接酶可连接起来
限制性内切酶-DNA的分子刀 限制性内切酶-DNA的分子刀