中科大gene作业-20页文档资料

Chapter 19 Homologous and Site-Specific Recombination

1. Please explain why most of engineering E. coli cell strain for protein over-expression has the genetic type of RecA- ? (3 points)请解释为什么对于蛋白过度表达的大多数工程大肠杆菌细胞株具有遗传型的RecA-

答：大肠杆菌中的RecA蛋白是第一个被发现的DNA链转移蛋白，这类蛋白质在重组中起着核心作用，促进单链DNA片段与同源双链DNA片段发生链置换。如果某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列，那就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性。用携带有recA基因突变的菌株就几乎没有重组的可能性，这就保证了质粒的稳定。

2. Please read Invitrogen catalog, and explain how a single Gateway entry plasmid can be applied for multiple different applications. Detail description is expected.

(7 points)

答：Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，在构建好一个入门克隆后不再需要使

用限制性内切酶和连接酶。可以直接转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体。由于

重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。这样，

在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。目的基因克隆进入门载体后，可以同

时转移目的基因到多个目的载体。

Gateway技术基于已深入研究的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）（图一）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。 BP反应是利用一个attB DNA 片段或表达克隆和一个attP供体载体(Donor vector)之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway表达克隆仅需两步（图二）：

1 创建入门克隆，通过PCR或者传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

2 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析）。

在BP反应中，基因转移形成入门克隆；在LR反应中，入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

用Gateway技术利用了位点特异重组，进行克隆可以去除用多种限制性内切酶克隆的繁琐步骤，可以方便地将目的片段转入多个表达系统（细菌、酵母、昆虫或哺乳动物）。并且克隆效率达95%以上。当基因快速简便地进入目的表达载体时，还能保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。

3. Please read textbook carefully, briefly design a method to distinguish “sequential exchange” or “concerted cutting” during recombination between attP and attB. (5 points)

答：att位点对于序列有独特的要求，attP比attB长得多。attP完成功能需要240bp长的序列，而attB仅需要23bp 的片段，从-11位到+11位，其中核心序列的每边仅需要4bp。片段长度的大小差异，说明attP和attB在重组中执行不同的功能，所以可知attP提供了更多的信息，使得它能区别于attB。那么，在attP与attB重组的过程中，是使attP和attB链同时切断并发生交换；还是链每次交换一对位点，第一次交换产生Holliday连接点，第二次切出缺口和连接发生使这个连接点释放？“自杀底物”可以使重组反应停留在中间体的阶段，此时核心序列被切开，而这个切口干扰了重组过程，这样就可以识别出已经起始重组但还未完成的分子，这些中间体结构表明单链交换是按前后顺序发生的。

4. Please read textbook carefully and describe differences between type I topoisomerase and type II topoisomerase.

答：DNA拓扑异构酶是可以催化DNA拓扑结构变化的酶。它们暂时解开DNA的一条或两条链，使没有断裂的链穿过缺口，然后重新封住缺口。I型拓扑异构酶在DNA中的一条链上产生一

个暂时的缺口，II型拓扑异构酶引入一个暂时的双链断裂。I型拓扑异构酶不需要ATP，每一次链环数的改变为1；II型拓扑异构酶需要能量ATP，链环数以2的倍数发生改变。

大肠杆菌中有4种拓扑异构酶,称为拓扑异构酶I、Ⅲ、Ⅳ和DNA促旋酶。DNA拓扑异构酶I 和Ⅲ是I型酶; 促旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ是II型酶。

I型拓扑异构酶与其中的一个断裂末端形成共价键，使其环绕另一条链，然后将共价键连接的末端与另一个断裂末端相连。因为保留了键，所以这种反应不需要能量。大肠杆菌促旋酶是II型拓扑异构酶，需要ATP水解提供引入DNA负超螺旋的能量。

Chapter 20 DNA Repair System

1. Please list RecA’s function in both DNA recombination and DNA repair (5 points)答：在DNA重组中：

RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。这个置换反应可以发生在几种不同构型的分子之间，并需要三个一般性条件：其中一个DNA分子必须有单链区域；有一个分子必须有游离的3’端；单链区域和3’端必须位于这两个分子的互补区域中。

单链同化与重组的起始密切相关。单链同化需要一个中间体以使两条单链从一条双链体交叉到另一条，RecA可以催化这个阶段的反应。在细菌中，RecA作用于RecBCD所产生的底物，而RecBCD介导的解链和切割可以产生起始异源双链体连接点形成的末端，RecBCD在chi位点切开释放出3’端，RecA可以携带含此3’端的单链并使它与同源的双链体序列作用，于是就产生了联合分子。

在DNA修复中：

RecA蛋白直接参与重组修复，它还有另一个功能：可以被许多导致DNA损伤或抑制大肠杆菌复制过程的处理激活，这些处理使它引发一系列复杂的表型变化，称为SOS应答。起始应答的事件是RecA被损伤处理所激活，RecA的激活引起LexA基因产物的蛋白酶解切割，这种LexA

发生自我切割后导致其自身的阻遏操纵子的活性失活。LexA蛋白能抑制许多基因的表达，包括起修复作用的recA和lexA。RecA的激活引起LexA蛋白的水解，从而诱导所有这些基因表达。

在重组修复系统中，首先RecBC参与在一条子代双链体中产生单链末端，然后被RecA用来与另一条子代双链体配对。

2. Please briefly describe differences between excision repair and recombination repair (5 points)

答：外切修复系统是把DNA链从损伤位点移去，然后替换它；而重组修复系统是利用重组来替换损伤的双链体区域。理论上，外切修复途径可以发生在任何时间，但是重组修复在一条带有损伤序列拷贝的双链体存在时才能发挥作用，也就是说，它发生在复制以后。具体差别如下：

识别酶能辨别出实际的损伤碱基或DNA空间路径上的改变，由此由识别酶所启动的外切修复系统（excision repair）通常能校正错配。这个系统有两种类型：碱基外切修复和核苷酸外切修复。

而重组修复系统的一个主要作用是重新启动停滞的复制叉。当复制叉遇到损伤，会停止前移，停滞复制叉结构与两条DNA双链体重组产生的Holliday连接点相同，所以成为解离酶的靶标。如果解离酶切割互补链中的任何一对，双链断裂就能产生。这可以用重组系统来修复。

3. Please think about the advantage/disadvantage of the mutation based exploration of biological process and molecular mechanism of some biological processes. Is there any alternative route to explore biological questions? If yes (sure, there is), please briefly describe your comments and suggestions. (10 points)

答：优点：碱基突变包括碱基的添加、删除、点突变等。碱基突变是研究生物学过程和其

中一些分子学机制的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质结构或结构域。对于某些对生物体有影响的碱基，通过这种突变的方法，可以了解基因在生物体中的作用。

缺点：对于一些在生物体中作用不明显的基因，不能通过这种方法对基因的功能有所了解。另外，有一些基因是突变致死的，也不能通过突变的方法来研究其功能。

另外一些研究的方法：

1.可以通过查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内是否有已知功能，来推测想了解的基因的功能。

2.寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为研究其功能的参考。

3.通过RNAi沉默这个基因，干扰基因的表达，来研究基因的功能。

基因簇

Chapter 21, 22 Transposon & Retroviruses and Retroposons

1. Both plasmids and transposons can transfer gene from one location to another location. What are differences between plasmids and transposons? (3 points)

答：质粒是通过接合作用来转移信息。

转座子是基因组中移动的一段不连续序列，可将其本身在基因组内从一个位置转移到另一个位置。转座子不依赖于供体和受体位点序列间的任何联系。质粒是独立形式的元件，在不同的基因组之间转移基因片段。

2. What are three different effects of transposons bring to target DNA? Explain “Selfish DNA”. (4 points)

答：1 在反应中，转座子被复制。转座子中被移动的部分被拷贝，一个拷贝保留在原位点，

而另一个则插入新的位点，因此转座伴随着转座子拷贝数的增加。这种是复制型转座。

2 转座子仅从供体位点向受体位点做物理性移动，从而在供体位点造成断裂，如果断裂不被修复，后果将是致死的。这种是非复制型转位。

3 只有序列的直接移动，没有核苷酸的损失。这种是保守型转位。

自私的DNA是指那些序列的DNA，其在其最纯的形式，有两个不同的特性：（1）DNA序列通过在基因组内形成其自身的的额外拷贝来进行扩散;和（2）它没有对它的宿主有机体的繁殖成功作出具体贡献。

自私DNA：与生物体的基因型无关的序列，唯一的目的是使自己永生化于基因组内。

3. What are differences between DNA and RNA mediated transposon? (5 points)

答：转座子分为两个基本类型：

一种是以编码蛋白质的DNA序列的形式存在，其编码的蛋白能直接操作DNA，从而使转座子能够在基因组内繁殖其自身。这是DNA介导的转座。

另一种与反转录病毒有关，并且它们可移动的特性来自于它们能由RNA转录物产生DNA拷贝，这种DNA拷贝然后被整合到基因组的新位点。这是RNA介导的转座。

（1） RNA介导的转座比DNA介导的转座多一步逆转录过程。RNA介导的转座子要先逆转录为双链cDNA，才插入转座位点。

（2）由RNA介导的转座仅发生在真核生物和病毒中。

（3）反转座子共有的可鉴定的特性为：插入位点会产生短的靶序列的正向重复。

4. Briefly describe mechanisms of replicative and nonreplicative transposition.

(8 points)

答：复制型转座：在反应中，转座子被复制。转座子中被移动的部分被拷贝，一个拷贝保留在原位点，而另一个则插入新的位点，因此转座伴随着转座子拷贝数的增加。在复制型转座中，链转移复合体的3’端作为复制的引物，产生一个称为共合体的结构，它由两个起

始分子融合而成。共合体有转座子的两份拷贝：一份拷贝位于原来复制子之间的每个连接处，取向为正向重复序列。

非复制型转座：转座元件作为实体，直接从一个位点转移到另一个位点，并且是保守的。转座子仅从供体位点向受体位点做物理性移动，从而在供体位点造成断裂，如果断裂不被修复，后果将是致死的。这种是非复制型转位。

Chapter 23 Immune Diversity

1.Please draw a diagram of concensus sequence共识序列 and describe what are consensus sequences’role in Immune Recombination. (5 points)

答：轻链和重链基因组装的机制是相同的，所有参与连接反应的生殖细胞基因片段的边界处都有共有序列。每个共有序列包括一个七聚体和一个九聚体，它们被12bp或23bp的序列所分隔。

作用：带有一种间隔的共有序列仅能与带有另一种间隔的共有序列连接。V片段和J片段的共有序列可以以任何方向进行排列，间隔的不同也不能提供任何方向性的信息，不过都能够阻止一条V基因片段和另一条V基因片段重组以及一条J基因片段和另一条J基因片段重组。

2.Please how random nucleotides随机核苷酸 were generated during gene segment joining and describe the random nucleotides’role in Immunoglublin diversity. (5 points)

答：在RAG蛋白催化断裂和重连的过程中，RAG1能识别七聚体或九聚体上特有的12/23间隔的信号，然后吸引RAG2形成复体物。九聚体提供起始识别的位点，七聚体则提供切割位点。RAG1，2首先在每个连接区产生切口，之后在编码端和信号端的末端游离羟基攻击另一条链的键，形成发夹结构，然后靠近发夹结构的一条链被切割。切割链因为不能配对而产生自由端。这时有一些额外碱基（随机序列）被插入到编码末端，称为N核苷酸。它们的插入由

脱氧核苷酸转移酶催化，并发生在连接过程中所形成的游离3’端。然后单链末端被填充，编码端连接。

作用：确保了编码区的连接能产生一条与V、D和J区域的编码末端直接连接产生的序列不同的序列。在连接处，序列的改变能使该位点编码的氨基酸产生多样性。连接处的编码区碱基对数目的改变能影响读框。

随机核苷酸包括“P核苷酸”和“N核苷酸”。在重排的过程中，重组信号序列（RSS）被重组酶识别，经过一系列变化，在两个片段末端形成发夹结构，再经过内切酶的随机切断发夹结构形成“P核苷酸”。内切酶切割过后，两个片段的单链末端核苷酸序列不能完全配对，由末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt）在末端单链上随机加上脱氧核苷酸，直到能有部分完全配对，这样随机加上的核苷酸称为“N核苷酸”。

“P核苷酸”的随机产生和“N核苷酸”的随机添加更加增加了免疫球蛋白的多样性。

3.What is somatic mutation and explain their roles in secondary response. (5 points)答：发生在体细胞中的突变，只影响其子细胞，不遗传给后代。体细胞突变通常为自发，但有一种指导型的突变，它发生在免疫系统，在那里，在重排的免疫球蛋白基因中，体细胞突变将会产生更多的多样性。

作用：次级免疫应答是通过B细胞的记忆功能来实现的。体细胞突变产生了与抗原有更高亲

区，它们暂时不引发应答。和力的B细胞，尽管这些细胞也经历了同类型转换来选择其他的C

H

它们以记忆细胞的形式存储起来。如果与同一种抗原再次接触，则它们被激活。由于这些细胞是对应这种抗原预先选择出来的，所以它们能够很快通过克隆扩增产生次级免疫应答。

4.Briefly describe differences between humoral 体液immunity and cell-mediated immunity. (5 points)

答：体液免疫应答是由B细胞执行的。此应答是由B细胞分泌的抗体，也就是免疫球蛋白介导的。针对外来分子产生特异性抗体是识别外来抗原的最基本环节。这种识别要求抗体

能够结合到抗原的一小部分结构或区域上。体液免疫在两方面依靠其他的免疫反应组分。首先，B细胞需要T细胞提供信号而分泌抗体；其次，抗原-抗体复合物的形成触发抗原被消灭，它最主要的路径是由补体来完成的。

细胞免疫应答是由一类称为细胞毒性T细胞，也称为杀伤性T细胞的T淋巴细胞所执行的。T细胞的基本功能是识别抗原。细胞免疫通常是由细胞内的寄生物所诱发的，如病毒的感染。病毒感染后，外来抗原被呈现于细胞表面，被T细胞受体识别，此受体是由T细胞产生的，相当于B细胞产生的抗体。这种识别最重要的特征是抗原必须被一种称为主要组织相容性复合物（MHC）的蛋白质所呈递。T淋巴细胞要求能同时识别外来抗原和MHC蛋白，确保了细胞免疫应答仅能发生在被外来抗原感染的宿主细胞内。

Chapter 24 Promoters and Enhances

Regulation of Transcription (Access/Initiate/Increase)

1.Please briefly list different functions of TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH. A series of diagram describing process of RNA transcription initiation, RNA elongation, maturation will be encouraged (5 pts)

答：TFIIA可能是通过消除TAF

的阻遏作用来活化TBP；

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TFIIB可能松散的结合到TATA盒的下游，并且处于对两条DNA链来说非对称的位置，以保护启动子附近从-10到+10位模板链的区域；

TFIID由TBP和多种TAF组成，单独负责识别RNA聚合酶II的启动子；

TFIIE具解旋酶活性，它的结合使被保护的DNA区域边界又向下游延伸了一圈双螺旋，达到+30位；

TFIIF可能采用某种方式把RNA聚合酶II引入正在装配中的转录复合体，并结合到它的上面；

TFIIH具有ATP酶、双向解旋酶和CTD尾部激酶等活性，能和TFIIE一起使得DNA螺旋解

链以便使聚合酶向前运动。

2. Please list all possible roles of CTD of RNA Polymerase II during RNA transcription. (5 pts)

答：RNA聚合酶II CTD结构域是由含7个氨基酸残基的重复序列组成的。CTD中丝氨酸和苏氨酸残基可被高度磷酸化，这与转录起始反应有关。CTD尾部需要被磷酸化，以使RNA 聚合酶II 能从各种转录因子包围中释放出来从而过渡到转录的延伸形式，该阶段大多数转录因子从启动子上解离下来；一些启动子需要CTD的进一步磷酸化来结束不成功的转录起始；CTD也直接或间接地参加了对RNA的加工，它直接促进了承担“5’加帽”和“3’加尾”反应的各种蛋白复合体的形成。

3. Please briefly describe how enhancers increase efficiency of transcription initiation? Please also design a simple experiment to prove the enhancer’s influencing mode (5 pts)

答：增强子的根本作用是增加启动子附近激活剂的浓度。当增强子和启动子分别处于DNA 片段的两端时，它不能有效地进行转录，但是当它们之间以蛋白质桥相连接时，增强子就可以刺激转录，所以关键的特征是让增强子和启动子相互靠近。

设计实验：

1 使增强子和启动子分别位于分开的并且没有相互作用的两个DNA环上时，检测其是否有转录发生；

2 使增强子和启动子分别位于一段不能弯曲线性DNA的两端，检测是否有转录发生；

3 突变增强子区域，使其失去提高启动子附近激活剂浓度的作用，检测转录是否发生。

根据这种增强子作用模型，以上实验应该都不能检测到转录的发生。

可设计启动子和增强子分别位于两个环状DNA中，该增强子可与某一蛋白结合（如NtrC），该蛋白亦可与聚合酶相互作用。当两个环分开时，转录几乎没有发生，当使用蛋白（如NtrC）