慢病毒Cas9表达系统使用说明

本说明书用于：

?构建Cas9蛋白表达细胞系

?在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因

适用于以下产品

货号货号

pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002

pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004

pGR载体系列 CR2011~CR2013

pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016

北京英茂盛业生物科技有限公司

北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916

Tel：010‐62495135

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1、产品简介 (2)

1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)

1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)

2、Cas9表达慢病毒制备 (3)

2.1试剂准备 (3)

2.2简要实验流程 (4)

2.3实验前准备 (4)

2.4病毒制备步骤 (5)

2.4 PEG纯化慢病毒 (6)

3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)

3.1 试剂 (7)

3.2 实验前准备 (7)

3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)

3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)

4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)

4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)

4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)

5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)

5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)

5.2 靶点设计 (13)

5.3 pGR载体构建步骤 (14)

附录1 用到的产品 (17)

附录2 引物列表 (17)

1、产品简介

1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。一旦与crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA结合形成复合物，Cas蛋白中的核酸酶即可对与复合物结合的DNA进行切割。切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。

来自Streptococcus pyogenes 的Cas9由于PAM识别序列仅为2个碱基（GG），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别RNA（gRNA）可以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞，对特异DNA序列剪切，从而促使DNA发生NHEJ ( nonhomologous end‐joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除。

1.2慢病毒Cas9表达系统特点

慢病毒Cas9表达系统采用慢病毒表达Cas9或者Cas9Nicknase蛋白，用于构建稳定表达Cas9蛋白的细胞株。Cas9蛋白的编码框长达4kb，将Cas9基因高效导入细胞是应用Cas9/CRISPR系统进行基因敲除的难点之一，Cas9基因的长度极大地限制了基因导入细胞方法的选择以及基因敲除的实验设计。通过构建稳定表达Cas9蛋白的细胞株，可以更自由地设计基因敲除体系，也可以提供更好的Cas9蛋白表达效率，从而提高基因敲除效率。

慢病毒Cas9基因敲除系统优点：

1、获得更高的基因敲除效率。

2、构建Cas9蛋白稳定表达细胞系，方便在同一细胞中敲除多个基因。

3、进行更灵活的基因敲除实验设计。

应用慢病毒Cas9表达系统进行基因敲除的流程：

包装Cas9过表达慢病毒→筛选Cas9表达细胞株→转入gRNA进行基因敲除→筛选基因敲除成功细胞

2、Cas9表达慢病毒制备 2.1试剂准备

1. Cas9过表达慢病毒载体选择。

货号名称

CR2001 pLV ‐Cas9‐Puro CR2002 pLV ‐Cas9‐Neo CR2003 pLV ‐Cas9Nick ‐Puro CR2004

pLV ‐Cas9Nick ‐Neo

我们现提供4种表达Cas9 蛋白的慢病毒载体，您可以根据抗生素要求和基因敲除实验设计进行选择。

1）抗生素选择：Puromycin 或G418

用嘌呤霉素筛选比较快，仅需4‐7天即筛选出阳性细胞。G418筛选需要7‐14天左右。此外不同的细胞对抗生素的敏感度差别很大。最好在开始实验前对细胞进行抗生素敏感度测试，以选择合适的抗生素种类，确定筛选浓度。

2）Cas9蛋白选择：Cas9和Cas9Nicknase

Cas9蛋白切割DNA双链。Cas9Nicknase是Cas9蛋白的D10A突变体，切割DNA单链。由于DNA上的Nick 缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase需要成对的gRNA辅助才能实现DNA双链断裂。

采用Nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对gRNA的设计要求较高。敲除效率也比Cas9蛋白低一些。

简单地说，Cas9基因敲除效率更高，操作更容易；Cas9Nicknase特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。

2.慢病毒包装载体

Cas9慢病毒表达载体采用3质粒慢病毒系统。您可使用我公司的pH1、pH2；addgene载体psPAX2、pMD2.G 或者pCMV‐dR8.2 dvpr、pCMV‐VSVG均可包装成功。

3.无内毒素质粒提取试剂盒。使用质量可靠的质粒提取试剂盒可以提供更高的转染效率和病毒包装效率。

我们采用Qiagen的Plasmid Plus系列产品可以取得满意的包装效果。

4.转染试剂（可使用我公司转染试剂Polyfect‐V或您的实验室中现有转染试剂）。

5.病毒包装细胞：我公司的293V、HEK293或者HEK293T均可使用。需要注意的是包装细胞状态对于病毒

产量很重要。细胞聚团、贴壁不牢、生长缓慢等均是细胞老化的表现，这样的293细胞是不能使用的。

6.慢病毒纯化试剂盒（可用我们的PEG纯化产品，货号P1201；或者其他公司的商品化试剂盒；推荐用超

速离心纯化）。

7.Polybrene慢病毒感染辅助试剂（6mg/ml，Sigma）。

8.293V培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS

9.病毒培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS，丙酮酸钠1mM。

2.2简要实验流程

293V细胞铺板→转染质粒制备→收集病毒上清→纯化病毒

2.3实验前准备

1.质粒准备

Cas9表达慢病毒载体和包装载体需要用无内毒素质粒提取试剂盒制备。制备方法请按照试剂盒的说明书进行。

2.包装细胞准备

包装慢病毒可以用HEK293、HEK293T或者我公司的293V细胞。293细胞的状态对病毒包装效率影响很大，请选用生长良好，无聚团现象的细胞进行病毒包装。

2.4病毒制备步骤

概述：

以下采用我公司的Polyfect‐V转染试剂（货号P2010）为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。

本例中病毒包装采用10cm培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

1、转染前24小时，将293V细胞以4‐5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5%

CO2培养。细胞转染前密度应达到80‐90%。

2、漩涡震荡混匀Polyfect‐V转染试剂。

3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

离心管1（质粒DNA）离心管2（转染试剂）

Cas9慢病毒载体5μg Polyfect‐V转染试剂 20 μl

pH1载体3.75μg DMEM无血清培养基480 μl

pH2载体1.25μg 总体积500μl

DMEM无血清培养基 X μl

总体积500μl

4、充分混匀。

5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。注意加入顺

序非常重要。

6、室温孵育转染混合液15分钟。

7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

8、37℃培养。

9、4‐6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。

10、转染后48小时收集细胞培养上清。

11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。推荐通过超速离心纯化、

PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。

12、病毒纯化后可以冻存在‐80℃以备以后使用。

注意：

1）Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。

2）Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。

感染细胞时，这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体，造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心

能去除病毒空壳，因此采用密度梯度离心纯化病毒可以显著提高病毒感染效果。如果没有时间进行超速离心，用PEG纯化法或者超滤纯化对提高提高病毒感染效果有一定帮助。

2.4 PEG纯化慢病毒

以我们的PEG慢病毒纯化试剂为例进行慢病毒纯化浓缩。您也可以采用超速离心或者超滤法进行病毒浓缩。

所需试剂、耗材和仪器：冷冻离心机（50ml或15ml容量）；0.45μm过滤器（推荐使用Millipore低蛋白结合滤膜PES或PVDF）；无菌PBS溶液。

操作步骤

1、收集病毒上清液，室温500g离心10分钟，去除细胞碎片，将病毒液转移到一个新的离心管中。

2、用0.45μm过滤器过滤病毒液。

3、将病毒液转移到新的离心管，保证病毒液体积不超过离心管容积的2/3。准确计量病毒液体积，

每10ml病毒液加入PEG慢病毒纯化试剂4.7ml。

4、注意：PEG慢病毒纯化试剂比较粘稠，需要缓慢吸取，缓慢加入。保持病毒液和纯化试剂体的精

确体积比非常重要。

5、反复颠倒混匀，直到病毒液和纯化试剂完全混合。4℃沉淀1.5小时，每0.5小时将混合液反复颠

倒混匀1次。（可将病毒混合液放置在冰水混合物中，或者4°冰箱进行沉淀）。

6、沉淀完成后病毒混合液应该变浑浊。4℃，7000g，10min离心病毒混合液。离心后可见白色沉淀。

去除上清。

7、将离心管倒置在滤纸上，去除残留液体。用原病毒液体积1/20的PBS重悬沉淀。分装用‐80℃冻

存。

3、筛选Cas9表达稳定细胞株

3.1 试剂

1.细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。

2.转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，‐20℃冻存）。

3.Cas9或Cas9Nicknase表达慢病毒。

4.嘌呤霉素或者G418。

3.2 实验前准备

1.目的细胞准备

目的细胞需要满足两个条件才能用于构建Cas9表达细胞系：

1）细胞能被慢病毒感染。表达Cas9蛋白的慢病毒感染效率会低于对照病毒感染效率。我们建议对照病毒感染率能达到50%以上的细胞用于构建Cas9表达细胞系，如果感染效率很低，可能会导致构建不成功。 2）细胞能稳定传代。在实验过程中细胞需要进行病毒感染、抗药基因筛选等多轮实验。细胞能长期传代而且保持性状稳定对实验成功很重要。

2.通过抗生素敏感度实验确定合适的筛选抗生素浓度

不同细胞对抗生素的敏感度差别很大，需要在实验前测试细胞对抗生素的敏感度。另外不同厂家外不同批次的抗生素效力也有区别，重新购买抗生素后需要重新确定合适的筛选浓度。

抗生素敏感度检测实验步骤：

1）在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。第二天在培养基中按G418 (0, 50, 100,200, 400, 800μg/ml)或者嘌呤霉素（0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10μg/ml）加入。

2）用G418筛选处理5‐10天。每2天观察细胞一次。每4天更换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。选择7天左右细胞全部死亡的浓度作为筛选浓度。

3）用嘌呤霉素处理4‐7天。每2天更换新的有抗生素的培养基。选择4天左右细胞全部死亡的浓度作为筛选浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）

抗生素工作范围常用筛选浓度

G418 50‐800 400‐500

Hygromycin 50‐800 200

Puromycin 0.25‐10 0.5‐5

3.Polybrene

Polybrene可以帮助病毒与细胞膜上受体结合从而提高病毒的感染效果。我们一般将Polybrene配制成6mg/ml 的储存液，使用浓度为6ug/ml。使用的时候需注意两点：

1)Polybrene的效果与细胞有关，并非对所有细胞有帮助。

2)Polybrene对极少数细胞有毒性。这种现象比较少见，一般不需要提前对Polybrene毒性进行试验。如果

病毒感染细胞后出现细胞死亡，可以用2‐10ug/ml Polybrene处理细胞，观察是否有细胞毒性以及确定合适的Polybrene浓度。

以下方法可用于感染常见贴壁细胞和部分悬浮细胞

注意：Cas9慢病毒感染效率比较低。用较大量的细胞进行感染有助于提高阳性细胞数量。

3.3 筛选细胞系实验步骤

1、感染病毒前一天将以适当密度铺板。感染病毒时细胞密度在80%左右。

2、取出制备好的Cas9表达慢病毒，室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：

以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例

病毒液 50ul~200ul

补加细胞完全培养基到1ml

加入Polybrene到终浓度为6ug/ml

注：慢病毒几乎没有细胞毒性，最多可以加到细胞培养液体积的40%。Cas9慢病毒的包装效率显著低于空载体病毒。我们推荐Cas9慢病毒的用量为预实验中空载体病毒用量的10倍以上。

3、用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。

4、病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入抗生素浓度实验中确定的合适抗生素对

阳性细胞进行筛选。筛选的过程即维持抗生素浓度直到细胞不再死亡，剩下的细胞生长正常。

5、在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2‐3天应该换液一次，去除死细胞，补加

抗生素。

6、嘌呤霉素筛选时间4‐7天，G418需要10‐14天。

抗生素筛选注意事项：

1)细胞密度对药物筛选效果有影响。在筛选过程中如果细胞死亡较慢，细胞密度过大时应该及时传代，

保持细胞的密度在60‐80%。由于G418发挥作用较慢，用G418筛选初期几乎都是需要传代数次。

2)细胞筛选正常的表现：

嘌呤霉素筛选：加入嘌呤霉素2‐3天细胞开始死亡，死亡的细胞脱落漂浮。4‐5天不再有新的死亡细胞出现，剩下的细胞开始缓慢生长。如果剩下的阳性细胞很少，大概2周后形成成团的细胞克隆。

如果阳性细胞较多，会很快恢复生长，抗生素加压下的细胞生长情况和原来筛选前的细胞基本一样。

G418筛选和嘌呤霉素筛选现象基本一致，但发挥作用较慢。一般7天左右细胞开始死亡，14天左右无新死亡细胞出现。

3)慢病毒导入的基因整合稳定。在抗生素压力下传代数次后，细胞的外源基因表达基本稳定，以后的

培养过程中一般不需要抗生素维持。

3.4 Cas9表达细胞系检测

Cas9蛋白表达细胞系可以用RealtimePCR 检测mRNA 表达或者PCR 检测基因组DNA 。鉴定引物：

Cas9‐F ：ACAGTCTTCACGAGCACATC Cas9‐R ：TCCTCTTCATCCTTTCCCTA 产物大小198bp

举例：

用基因组PCR 检测293T ‐Cas9细胞中的Cas9基因。

1、分别提取293T ‐Cas9细胞和293T 细胞的基因组DNA 。

2、 PCR 扩增

反应体系：

2×Taq Mix 25ul Cas9‐F （10uM ）2ul Cas9‐R （10uM ）2ul 基因组模板 5ul 加水补足50ul

反应条件：95℃ 预变性5min ；95℃ 30sec ，55℃ 30sec ，72℃ 30sec ，35个循环。 3、电泳检测PCR 产物

M 1 2

M ：DL2000 DNA marker 1：293T ‐Cas9扩增产物 2：293T 扩增产物

4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证

原理：

pTYNE载体表达读码框错误的EGFP。pTYNE载体转染细胞基本不能产生荧光。我们根据pTYNE载体上错码的EGFP的上游区域设计并构建了Cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照gRNA表达载体pGR‐Hygro‐P，以及Cas9Nicknase蛋白基因敲除实验的阳性对照载体pGR‐Hygro‐Pf和pGR‐Hygro‐Pr。

pTYNE载体和阳性对照gRNA表达载体共转染Cas9表达细胞，gRNA指引Cas9蛋白对pTYNE载体上的错码EGFP基因切割。细胞对断裂的DNA进行修复，产生正确的EGFP基因，发出明亮的绿色荧光。

通过pTYNE载体实验可以检测Cas9蛋白表达细胞系是否构建成功。

4.1验证Cas9蛋白表达细胞系

我们以稳定表达Cas9蛋白的293T细胞系为例进行验证实验。

1、实验材料

pTYNE质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号CR1011）

pGR‐Hygro‐P质粒（阳性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1021）

pGR‐Hygro‐N质粒（阴性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1022）

Cas9蛋白表达293T细胞系（货号：C1203）

Polyfect‐V转染试剂（货号CR1011）

2、实验步骤：

1)转染前24小时将293T‐Cas9铺到24孔板中。同时准备2个孔。

2)按照下列体系制备2个质粒稀释液

组1 组2

pTYNE 0.4ug pTYNE 0.4ug

pGR‐Hygro‐N 0.4ug pGR‐Hygro‐P 0.4ug

DMEM培养基X ul DMEM培养基 X ul

总体积50ul 总体积50ul

3)准备转染试剂稀释液：

Polyfect‐V转染试剂 3.2ul

DMEM培养基 96.8ul

4)将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分

混匀，室温孵育15min。

5)将转染液加入293T‐Cas9细胞。

6)48小时后检测EGFP荧光表达。

3、检测结果

pTYNE+pGR ‐Hygro ‐ N(阴性) pTYNE+pGR ‐Hygro ‐P(阳性)

4.2验证Cas9Nicknase 蛋白表达细胞系

我们以稳定表达Cas9Nicknase 蛋白的293T 细胞系为例进行验证实验。Cas9Nicknase 需要成对才能切断双链DNA ，因此我们以单个的gRNA 质粒为阴性对照组。

1、实验材料

pTYNE 质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：CR1011）

pGR ‐Hygro ‐Pf 质粒（阳性对照1，货号：CR1023，无内毒素试剂盒制备） pGR ‐Hygro ‐Pr 质粒（阳性对照2，货号：CR1023，无内毒素试剂盒制备） Cas9Nicknase 蛋白表达293T 细胞系（货号：C1204） Polyfect ‐V 转染试剂（货号：CR1011）

2、实验步骤：

7) 转染前24小时将293T ‐Cas9Nicknase 铺到24孔板中。同时准备2个孔。 8) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

组1 组2 pTYNE 0.4ug pTYNE 0.4ug

pGR ‐Hygro ‐Pf 0.2ug pGR ‐Hygro ‐Pf 0.4ug ‐

pGR ‐Hygro ‐Pr 0.2ug DMEM 培养基X ul DMEM 培养基 X ul 总体积50ul

总体积50ul

9) 准备转染试剂稀释液：

Polyfect ‐V 转染试剂 3.2ul DMEM 培养基 96.8ul

10) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul 转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分

混匀，室温孵育15min 。

11) 将转染液加入293T ‐Cas9Nicknase 细胞。 12) 48小时后检测EGFP 荧光表达。

3、检测结果

pTYNE+pGR ‐Hygro ‐ Pf(阴性) pTYNE+pGR ‐Hygro ‐Pf&Pr(阳性)

5、pGR 和pGR ‐EGFP 载体构建

pGR 载体和pGR ‐EGFP 载体用于在哺乳动物细胞中表达gRNA 。载体中的抗性标签和荧光标签可以用于筛选转染成功的细胞。

pGR 和pGR ‐EGFP 需要配合Cas9或者Cas9Nicknase 蛋白才能实现基因敲除功能。已经构建成功的表达Cas9蛋白的细胞系可以通过转染构建好的pGR 或者pGR ‐EGFP 对基因进行编辑。

5.1 pGR 和pGR ‐EGFP 载体图谱

货号名称货号名称

CR2011 pGR ‐Puro CR2014 pGR ‐EGFP ‐Puro CR2012 pGR ‐Neo CR2015 pGR ‐EGFP ‐Neo CR2013

pGR ‐Hygro

CR2016

pGR ‐EGFP ‐Hygro

5.2 靶点设计

CRISPR/Cas9基因敲除系统的靶点由19个碱基构成。靶点前面为转录起始信号G 。靶点后面为PAM 序列NGG 。因此可作为靶点的序列为GN 20GG 。

推荐使用Zhang Lab 的在线设计软件进行设计：https://www.360docs.net/doc/1612693443.html,/。

在设计基因敲除时，在基因的起始密码子附近及下游查找GN 20GG 序列作为靶点。如果没有合适的序列，也可以选择N 20GG 的序列，构建载体时人工加上一个G 作为启动信号。以人的MET 基因(GeneID: 4233)为例，可选的靶点如下：

Start Codon 靶点1

ATAAACCTCTCATA ATG AAGG

CCCCCGCTGTGCTTGCACC TGGCATCCTCGTGCTCCTGTTTACCTTGGTGCAGAGG AGC 靶点2

AATGGGGAGTGTAAAG AGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCGGA AACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTTAAATGAGG AAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGC

靶点挑选要点：

1）Cas9/gRNA基因敲除原理是对基因组DNA序列切割后引发DAN修复，产生DNA序列缺失突变。因此基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。

2）现有的研究显示不同Cas9/gRNA靶点在基因敲除效率上有较大差异，但对其原因尚不清楚。因此同时设计构建2‐3个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点是必要的。

3）现在的研究表明靠近PAM的碱基对靶点的特异性很重要，前7‐12个碱基的错配对Cas9切割效率影响较小。而碱基错配的影响在不同靶序列中差别很大，有的靶序列特异性较高而有的较差。将设计好的靶点序列在基因库中进行BLAST检测是必要的。同时多设计构建2‐3个靶点并且在检测敲除效率的同时检测非特异性切割也有助于获得理想的基因敲除效果。

4）Cas9Nicknase需要挑选成对的靶点。我们一般在正义链和反义链上分别挑选相距20‐30bp的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。

5.3 pGR载体构建步骤

1、根据靶点序列设计和合成引物

干扰靶点序列通过EcoRV位点插入pCR载体中。

插入完成后完整的gRNA表达框序列如下：

U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCC TATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGT AAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTA gRNA-F primer

TGTTTTAAAATG GACTATCATATGCTTACCGTAACT TGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA Targeting sequence gRNA sequence gRNA-R primer AAGGAC GAT ACACC G NNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG TT ATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTT

插入前的gRNA表达框序列如下：

TGTTTTAAAATG GACTATCATATGCTTACCGTAACT TGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA

EcoR V

AAGGAC GATATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTT

插入寡核苷酸序列设计：

正向序列

5’ACACCG NNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

反向序列

3’TGTGGC NNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’

设计时将19nt的基因敲除靶点序列替换上面序列中的N即可。

以前面MET基因的靶点1为例，设计插入寡核苷酸序列方法如下：

1、基因敲除19nt靶序列为：CCCCCGCTGTGCTTGCACC。

2、需合成的正向寡核苷酸序列为：

5’ACACCG CCCCCGCTGTGCTTGCACC GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

3、根据正向寡核苷酸序列生成反向互补序列，即为反向寡核苷酸序列：

5’AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC GGTGCAAGCACAGCGGGGG CGGTGT3’

合成寡核苷酸注意事项：

a）：合成的寡核苷酸质量对于能否成功构建载体至关重要。请务必委托值得信赖的公司进行合成。 b）：必须PAGE纯化寡核苷酸。

2载体连接和鉴定

2.1寡核苷酸退火

用水将寡核苷酸稀释为100 μM。按以下体系配制退火反应体系：

正义寡核苷酸（100 μM） 5μl

反义寡核苷酸（100 μM） 5μl

NaCl 100 mM

Tris‐Cl pH7.4 50mM

加水补足 50μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR仪上，运行以下程序：90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在‐20℃长期保存。

2.2酶切线性化载体

用EcoRV酶切2μg pGR载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。

通常情况下用大约20‐30单位的酶大约3小时可以酶切完全。

酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为50‐100ng/μl。

注意事项：

1、在后面的连接体系中，我们使用的载体浓度为50‐100ng/ul。如果您回收后的载体浓度不在该范围，

请调整连接体系中的载体体积，确保载体用量和推荐用量一致。

2、EcoRV酶切后的载体为平末端，有可能发生载体自连。对回收的线性化载体进行去磷酸化处理可以

减少载体自连发生。但载体去磷酸化也会降低连接效率，我们一般不推荐进行去磷酸化处理。

2.3连接

用水将退火后双链寡核苷酸(10μM)稀释100倍备用。按照以下体系配制连接反应体系：

T4 DNA 连接酶 5U

EcoRV 5U

线性化载体 2μl

稀释100倍后双链寡核苷酸 1μl

10×连接酶Buffer 1μl

50%PEG4000 1μl

加水补足 10μl

反应条件：22℃ 30min，37℃ 15min。

注：

*平末端连接效率较低，在连接体系中添加PEG4000可以提高连接效率。

*在连接体系中添加EcoRV酶可以显著提高阳性率。

2.4 转化感受态细胞及PCR鉴定阳性克隆

用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞（例如Top10，DH5α）均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。

在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后细菌，大约14‐16小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。

鉴定方法可以采用PCR鉴定。

克隆PCR鉴定：

鉴定引物：

gRNA‐F GACTATCATATGCTTACCGTAACT

gRNA‐R CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA

阳性克隆鉴定产物大小为190bp，阴性克隆无条带。鉴定的阳性克隆用引物gRNA‐F测序。

附录1 用到的产品

一、载体

货号品名用途

CR2001 pL V-Cas9-Puro Cas9慢病毒表达载体

CR2002 pL V-Cas9-Neo Cas9慢病毒表达载体

CR2003 pL V-Cas9Nick-Puro Cas9Nicknase慢病毒表达载体

CR2004 pL V-Cas9Nick-Neo Cas9Nicknase慢病毒表达载体

CR2011 pGR-Puro gRNA表达载体

CR2012 pGR-Neo gRNA表达载体

CR2013 pGR-Hygro gRNA表达载体

CR2014 pGR-EGFP-Puro gRNA表达载体

CR2015 pGR-EGFP-Neo gRNA表达载体

CR2016 pGR-EGFP-Hygro gRNA表达载体

CR1021 pGR-Hygro-P Cas9阳性对照载体

CR1022 pGR-Hygro-N Cas9阴性对照载体

CR1023 pGR-Hygro-Pf；pGR-Hygro-Pr Cas9Nicknase阳性对照载体

CR1011 pTYNE 验证载体

二、细胞

C1201 293V 病毒包装细胞

C1203 293T-Cas9 稳定表达Cas9蛋白的293T细胞

C1204 293T-Cas9Nick 稳定表达Cas9Nicknase蛋白的293T细

胞

三、试剂和其他

P2010-1 Polyfect-V转染试剂转染试剂

P1201 PEG慢病毒纯化试剂慢病毒纯化试剂

附录2 引物列表

名称序列用途

Cas9‐F ACAGTCTTCACGAGCACATC Cas9和Cas9Nicknase细胞系鉴定

引物

Cas9‐R TCCTCTTCATCCTTTCCCTA

gRNA‐F GACTATCATATGCTTACCGTAACT pGR载体鉴定及测序引物

gRNA‐R CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因二零一一年五月

目录简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

慢病毒载体使用手册

LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.360docs.net/doc/1612693443.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.360docs.net/doc/1612693443.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

一、包装细胞293T 细胞的培养一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流

慢病毒系统简介及应用

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；

Bac-to-bac表达系统中文版说明书

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括： *pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感

染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒

慢病毒Cas9表达系统使用说明

慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于： ?构建Cas9蛋白表达细胞系 ?在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号 pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002 pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004 pGR载体系列 CR2011~CR2013 pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016 北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916 Tel：010‐62495135 Emai：order@https://www.360docs.net/doc/1612693443.html, Web site：https://www.360docs.net/doc/1612693443.html,

目录 1、产品简介 (2) 1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2) 1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2) 2、Cas9表达慢病毒制备 (3) 2.1试剂准备 (3) 2.2简要实验流程 (4) 2.3实验前准备 (4) 2.4病毒制备步骤 (5) 2.4 PEG纯化慢病毒 (6) 3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7) 3.1 试剂 (7) 3.2 实验前准备 (7) 3.3 筛选细胞系实验步骤 (8) 3.4 Cas9表达细胞系检测 (9) 4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10) 4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10) 4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11) 5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13) 5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13) 5.2 靶点设计 (13) 5.3 pGR载体构建步骤 (14) 附录1 用到的产品 (17) 附录2 引物列表 (17) 1

慢病毒载体,稳定表达

慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。慢病毒结构： 2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）三、慢病毒的使用和优势慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

慢病毒包装实验步骤

慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。插入铺板后图片

慢病毒转染手册

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体

pLVX-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息：载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄筛选标记: 嘌呤霉素备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：

pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA

慢病毒包装操作说明

Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明 A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。 6 1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。在37℃，5%CO2℃条件下过夜。在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。 2.充分混均Xfect Polymer。 3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μlXfectReaction Buffer 592.5μl Xfect ReactionBuffer36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意： Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min

慢病毒生产及使用操作手册

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。

慢病毒包装原理介绍定稿版

慢病毒包装原理介绍 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】