第十一章植物组织培养

第十一章植物组织培养.txt你站在那不要动！等我飞奔过去！ 雨停了 天晴了 女人你慢慢扫屋 我为你去扫天下

了 你是我的听说现在结婚很便宜，民政局9块钱搞定，我请你吧你个笨蛋啊遇到这种事要站在我后面！ 跟我走总有一天你的名字会出现在我家的户口本上。 第十一章 植物组织与细胞培养

☆概念

　它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。

一　植物细胞工程

☆　植物细胞工程的主要内容

◎ 植物细胞、组织和器官的培养

◎ 花药培养技术

◎ 植物原生质体的制备

◎ 植物原生质体的融合

◎ 原生质体的摄入实验

◎ 转基因植物的制作

◎ 染色体（组）的操作技术

本章主要介绍植物细胞、组织和器官的培养

二、植物细胞工程的发展史

1902年，德国植物学家哈伯兰特（G.Haberlandt）最早进行植物细胞培养的试验，被誉为“植物组织培养之父”；

1904年， hanning，在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚,最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞工程。

1922年，美国、德国分别报导了离体根尖的培养；

1934—1939年，先后发现了各种生长素，并利用番茄、胡萝卜的离体培养，初步建立起较为成熟的细胞培养方法，使植物细胞培养进入一个崭新的时代；

1941.荷兰j. van overbeek证明椰子乳汁的活性成分可在体外促进其他种类细胞的分裂和生长。

1943年，美国怀特（White）提出植物细胞具有全能性

1948.中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

1954.skoog发现DNA降解物中含有细胞分裂和生长的活性物质。后被命名为激动素。

50年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作，使细胞培养技术日臻成熟；White、Gautheret、Nobecourt?等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。?在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础

1960年，Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。

?1971年，Takebe?等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972年，Carlson?等通过两个烟草物种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。

1973年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。 1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株 到目前为止，组织培养、原生质体培养、细胞融合已在许多植物上获得再生成功。

三、?植物细胞工程的任务

（1）研究植物器官、组织和细胞在离体培养条件下，所需要的有机营养、无机营养、植物激素等培养条件和刺激因素。 （2）研究植物器官、组织和细胞，在离体培养条件下，所需的温度、湿度和光照等环境条件。 （3）研究植物的不同生理年龄、遗传组成（基因型）在离体培养条件下，形态发生的规律。 （4）研究离体培养条件下再生植株群体的遗传稳定性和变异性。

植物体细胞杂交

植物细胞工程

所采用技术的理论基础

通常采用的技术手段

植物组织培养

植物细胞的全能性

四、植物组织培养

在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性——在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植

（一）植物组织培养的发展简史

① 探索阶段（19世纪初－30年代中）

德国植物生理学家HaHerlandt首次进行了植物细胞培养实验。提出离体的植物细胞具有发育上的全能性，成为植物组织培养的理论基础。

② 奠基阶段（30－50年代）

1934年，White培养番茄离体根尖成功

1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功

White:烟草种间杂种的瘤组织进行组培

Nobecourt：胡萝卜进行组培

以上三人是植物组织培养的奠基人

③ 迅速发展阶段（60年代后）

原生质体，花药，快繁技术迅速发展

1958年Steward和Reinert用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚，并进而获得了完整植株。

科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养

（二、）植物组织培养的理论基础

1、植物的无性繁殖

被子植物的两种繁殖方式：有性繁殖和无性繁殖。

无性繁殖特点：

A、不发生遗传重组，后代与亲代在遗传上完全一致；

B、可短期内获得大量后代；

C、 繁殖方式多样化：营养器官再生、营养器官变态、落地生根等

2、细胞的全能性

生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。

表现全能性的基础和条件

基础： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。

条件：离体，提供营养物质，激素，其他适宜条件（如温度等）

在高等动物中，受精卵细胞、早期卵裂细胞、囊胚期细胞具有全能性

几乎所有植物的体细胞，雌、雄配子体都具有全能性，都能发育成胚

受精卵>生殖细胞>体细胞

植物细胞全能性的差异：

根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 > 居间分生组织> 侧生分生组织 > 薄壁组织(基本组织) > 厚角组织 > 输导组织 > 厚壁组织。

在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官。当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成愈伤组织（一种相对没有分化的细胞团），继而在植物激素等诱导下发生再分化，才能表达出全能性，发育成完整植株。

3、植物细胞的脱分化和再分化

（1）细胞分化

细胞分化

细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。

它包括：

时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。

细胞分化是一个复杂的生物化学过程，有复杂的调控机制。营养物质和激素的种类和配比能深刻影响分化过程，光照则是许多细胞分化的必需条件

细胞的脱分化

脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化

愈伤组织是细胞脱分化的结果

已经脱分化的细胞或组织在一定条件下，它们又可以经过胚状体(由体细胞形成的类似合子胚的结构)或愈伤组织再分化出芽和根，从而发育成一个完整的植株。激素则是在一定条件下能打破操纵基因的控制，使结构基因活化。因此，它直接影响和控制细胞的分化。

（2）细胞的再分化和器官发生

再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。

高等植物细胞脱分化与再分化示意图

（3）植物组织再分化的两条途径，

一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。

另一个是在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。

（4）几个重要概念

外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。分化〔differentiation〕：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。再分化〔redifferentiation〕:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。

胚状体〔embroid在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。

（5）影响植物细胞脱分化和再分化因素：

内部因子：植物的遗传性状、生理状况。

外部因子：营养条件（植物激素、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的ph、渗透压、温度、湿度、光照等）。不同程度的影响植物细胞脱分化、再分化及器官建成的各个过程。

愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根

当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。

其他影响植物细胞脱分化与再分化的条件

物理因素：切割造成的机械和生理隔离，切割创伤产生的物质。

化学因素：化学试剂，辐射处理。

（三） 植物组织培养

利用植物组织培养技术可研究被培养部分（外植体）在不受植物其它

部分干扰下的生长和分化规律，并可以用各种培养条件影响他们的生长和分化，以解决理论和生产中的问题

植物组织培养条件：

含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。

1 实验材料的清洗和消毒

（1）清洗

实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。

（2）消毒

清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在接种之前，须经严格地灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。

对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。

表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性剂。

对器官外植体的灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法。

不同器官的灭菌顺序

(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次

（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗--

-2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养

（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次

（4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次.

一般情况下，如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出需要的茎尖大小培养；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进行相应的外植体消毒。

如果外植体表面污染严重，需流水冲洗1h或更长时间，或者先通过种子

培养得到无菌种苗，然后再用其他各个部分建立组织培养。

2 培养基

培养基是植物细胞、组织和器官离体培养所需的营养基质，其中含有植物细胞生长分化所必需的各种营养成分和生长调节物质。

培养基成分的筛选和优化是植物组织培养中非常重要的步骤

培养基的组成

?除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，每升几十至几千毫克，包括N,?P,?K,?Ca,?Mg,?S。

需要量比较少的元素叫微量营养元素，包括Fe、Cu、Zn、B、?Mo、Mn、Co，Cl。 植物所需的微量元素有其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。

（1）无机营养成分

（2）有机化合物

有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物 *维生素类物质 硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素；而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育；常用的还有VB5、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。? *AA类物质 常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。

*糖类 糖在培养基的作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架 ，为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 ，维持渗透压。 蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。 *其它有机物质 肌醇（环己六醇） 肌醇可以形成果胶物质，利于胚和芽的形成 天然有机物 椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。

（3） 植物生长调节物质

无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。 A、生长素类： 吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、?

IBA（吲哚丁酸）?、IPA（吲哚丙酸）

萘酸类：?NAA（萘乙酸） 苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（?2,4,5-三氯苯氧乙酸）、?2,4,5-TP（?2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。 其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活

性最强的生长素。

生长素的生理作用 1）、促进细胞生长和细胞分裂 2）、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 3）、形成愈伤组织，促进生根 4）、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

B、细胞分裂素类?是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（?6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。 细胞分裂素类功能： 1）、促进细胞的分裂和分化 2）、诱导芽的分化 3）、促进侧芽的萌发和生长 4）、抑制衰老

C、赤霉素（GA3）

D、脱落酸（ABA）

（4） 固化剂和悬浮剂

A、固化剂 琼脂、琼脂糖，琼脂的用量一般在4-10g/L，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。 B悬浮剂 Ficoll（聚蔗糖） （5）ph值

灭菌之前培养基的ph值一般都要调节到5.0—6.0。

一般说来：ph高于6时，培养基会变硬；ph低于5时，琼脂不能很好的凝固。

为稳定ph值，往往加入ph缓冲剂（mes等）

3、 培养基的选择

（1）基础培养基：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养，豆科多用B5培养基。 （2）植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。 （3）有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加

4、 培养基的配制

最简单方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素、和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（比培养基的最终容积少10%），加上琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终容积，调节ph，高压灭菌，制成所需的培养基。

1.按照配方规定的数量称量出各种成分，分别使之溶解于水，然后混合。

2.先配制出一系列浓缩储存液，包括大量元素（浓缩20倍）、微量元素（浓缩200倍）、铁盐（浓缩200倍）、和蔗糖之外的有机物质（浓

缩200倍），然后彼此混合。注意每种成分分别溶解，一粒不剩。

制备储存液和培养基的时候，应使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。

制备过程全部步骤：

称取规定数量的琼脂和蔗糖，加水至培养基最终容积的3/4。加热溶解； 分别加入各种储存液，包括生长调节物质和其他特殊补加物；加蒸馏水至培养基的最终容积；混合后调节ph；分装培养基；用棉塞封口；高压灭菌；培养基室温冷却，至4℃冰箱中保存。

5、 接种

接种是经过表面灭菌的实验材料，按照不同的要求，移至培养基上培养的过程。

接种过程必须严格进行无菌操作一防止杂菌污染。

接种的操作步骤

1)玻璃瓶中放置植物组织块。消毒液消毒。需摇动玻璃瓶2-3次

2)无菌蒸馏水清洗，3-4次

3)取出材料置于无菌培养皿。

4)进行1)时，消毒所要使用器械。蘸入75%酒精，取出火焰灼烧，冷却后可用，每次使用后消毒一次。

5)用消毒后的器械切取适当外植体。

6)接种外植体于培养基上，移入培养室培养。

污染的预防

1)接种室要经常灭菌。

2)超净台使用前要75%酒精消毒或紫外照射灭菌。每次操作前所有物品先放入台内，勿中途拿入。台面放置东西不宜太多。

3)操作人员接种前需肥皂水洗手，穿干净工作服，75%擦手和台面。接种器械75%酒精浸泡，火焰灼烧灭菌。操作时禁止讲话。

4)接种打开包头纸时不要污染瓶口。

（四） 种质保存

超低温保存植物材料的原理与保存动物材料相同。

在-196℃的超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止。因此，细胞、组织、器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。

在降温冷冻过程中，如果细胞内的水发生结冰，也会造成植物细胞结构不可逆性的破坏而死亡。因此，同动物细胞低温保存一样，种质超低温保存成功的关键是在于降温冷冻过程避免细胞内结冻。需使

用冷冻保存剂，选择合适的降温冷冻速度和化冻方式。

1.超低温保存方法

（1）材料的选择

对组织培养的材料，在保存前要对其加速传代，以提高分裂细胞的比例。

（2）预处理

加入预冷的保护剂（0℃），处理20~60min，提高细胞抗寒力。（3）降温冰冻

四种方法：1.快速冷冻2.慢速冷冻3.预冻4.逐级降温

（4）采用迅速解冻法。30~40 ℃。

（5）活力测定

TTC或FDA染色法测定细胞活力和存活率。

（6）再培养

根据植物种类，提供和满足原来培养条件进行培养，使细胞恢复分裂能力，诱导器官分化和植株再生。

2.超低温保存的意义

（1）能保持细胞培养物的稳定性。

（2）长期保存植物种质资源。

（3）长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质。

（五）植物细胞的大规模培养技术

1.植物细胞大规模培养的产业化前景

组织及细胞培养技术生产植物次生产物方面已获得巨大成就

细胞培养与药学和工艺学结合打开了次级代谢产物的宝库

许多药用植物的大规模细胞培养都获得成功

在我国人参细胞培养技术已实现产业化

利用发酵罐大规模培养生产药物、食品、调料、香精和颜料等日用化工产品，成为生物技术的重要组成部分，并日益发展为一个新兴产业。植物次生代谢产品具有广阔的市场前景。

2. 植物细胞大规模培养系统

（1）悬浮细胞培养系统

大规模培养需生物反应器：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、旋转式生物反应器。

（2）固定化培养系统

按支持物不同分：包埋式固定化培养系统；附着式固定化培养系

统。

（3）植物器官培养系统

根据不同的培养体系、不同的培养目的、确定不同类型的生物反应器，是该技术应用的核心。

3.植物细胞大规模培养的影响因素

（1）外植体的选择

不同遗传背景会有不同培养结果，甚至同一植株，用不同部位组织进行培养时，其产物或积累量也有可能不同，同时，去做外植体的组织所处发育阶段，以及母本本身所受的环境条件和营养条件都会对营养物产生影响。因此，外植体选择格外重要。

（2）环境因子

光、温度以及摇床的震荡频率等都会影响到细胞培养物的生长和产物的合成

1）光的影响 光对不同培养物的影响是不同的。

2）温度 不同植物细胞培养物的生长和次生产物的合成对温度有一定的要求。

3）振荡频率摇床的震荡频率细胞培养物的生长和代谢物的积累等都会产生影响

（3）培养基的选择

选择适当的培养基对细胞培养是关键问题，一方面要满足植物细胞生长量的培养，还要是细胞能合成和积累尽可能多的次生产物。不同植物细胞可能适应不同培养基，对培养基的选择需充分探索。 在设计培养基时必须设计一系列试验，确定各种成分的最佳组合和浓度；培养基的设计还要考虑培养基的ph。

在培养基中添加特定产物的已知前体，在一些培养中客观察到较好效果。

植物细胞的大规模培养技术生产次生物质的优点：

1.避免野生药用植物资源的破坏和濒危药用植物的灭绝。

2.可应用于生物转化

3.获得新的生物活性化合物的重要途径

思考题

1.愈伤组织有什么特点？它在细胞工程中有什么重要性?

2.愈伤组织形成再生植株需要经过什么途径？

3.植物组织与动物细胞的超低温保存原理及方法有何不同？

4.植物细胞的几种大规模培养系统各有什么特点？影响因素是什么？