锥栗果实双向电泳体系的建立
福建农林大学学报(自然科学版)第39卷第5期Journa l of Fujian A griculture and Forestry U n i versity(N a t ura l Sc i ence Ed iti on)2010年9月
锥栗果实双向电泳体系的建立
郑诚乐,钟凤林,潘东明,刘小芝
(福建农林大学园艺学院,福建福州350002)
摘要:通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同p H值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于p H4-7.
关键词:锥栗;蛋白质组;双向电泳
中图分类号:S664.2;Q946.33文献标识码:A文章编号:1671-5470(2010)05-0475-05
Establis h m ent of t wo-di m ensional electrophoresis syste m for chinquapin fruits
Z HENG Cheng-le,Z HONG Feng-li n g,PAN Dong-m ing,LI U X iao-zh i
(Co lleg e o fH o rti culture,Fu ji an A g ricu lt ure and F orestry U niversity,Fuzhou,F uji an350002,Ch i na)
Abstrac t:T he conven tiona l t w o-di m ensi onal electropho res i s techno l ogy w as i m proved i n o rder to deve l op an appropriate approach for proteo m ics of ch i nquapin fruits.T he study w as done by opti m izi ng different prote i n extraction me t hods and co m pa ri ng IPG str i ps at d ifferen t p H values.W it h the i m proved pro tein extraction m ethod,a stab l e,reproduc i b l e and h i gh reso l u tion2-D e l ectrophoresis m ap w as obta i ned.A fter sil ver staini ng,m ore than400prote i n spo ts w ere detected,w ith t he ir isoe l ec tric po i nts(pI)m a i nly at p H 4-7.
K ey word s:chinquapi n(Castanea henry i R ehd.&W il s.);pro teom e;t w o-di m ensi onal e l ec trophoresis
双向电泳(t w o-d i m ensional e lectropho resis,2-DE)是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学研究的各个方面.双向电泳技术利用蛋白质的等电点和相对分子质量差别将各种蛋白质区分开来,其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段.对蛋白进行分离、鉴定,分析特异蛋白的功能及其作用机制已成为当今研究热点[1-3].
锥栗(Castanea henry i Rehd.&W ils.)是我国南方栽培驯化最早、利用最久的经济林树种之一,也是我国古老的名特优稀落叶果树[4,5].锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜,含有淀粉、糖、蛋白质等主要营养成分及18种钙、锌、磷、钾、铁等矿物质[6].目前对锥栗果实营养品质的研究主要集中在成分分析方面[4-9],有关其营养品质的变异和相关性的研究尚未见报道.应用双向电泳对锥栗蛋白质组分进行质谱分析在国内外都少见报道.因此,本试验通过建立适于处暑红锥栗果实蛋白质分离的双向电泳体系,对蛋白质样品的制备、电泳参数和固相p H梯度干胶条等进行优化,以期提高锥栗果实蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,得到适于其分析的双向电泳试验条件.
1材料与方法
1.1试剂与仪器
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、I PG胶条(pH3-10,13、18c m;p H4-7,13、18c m)、I PG buffer(p H3-10;p H4-7)、胶条覆盖液(矿物油)、Phar m y lte、碘乙酰胺、C HAPS、二硫苏糖醇(DTT)和TE M ED均购自Am ersha m Phar m acia公司;苯甲基磺酰氟(P M SF)购自Sig m a公司;其他试剂为国产分析纯.
收稿日期:2009-09-22修回日期:2010-03-10
基金项目:国家支撑计划项目(2007BAD07B01);福建省科技厅资助项目(K02058).
作者简介:郑诚乐(1963-),男,副教授,博士.研究方向:果树栽培.Ema i:l zcl2003@126.co m.通讯作者潘东明(1956-),男,教授,博士生导师.研究方向:果树栽培生理及生物技术.Em ai:l pdm6666@126.co m.
IPGphor ó,E ttan DALT si x ,M ulti T e m p ó,EPS 601,I m age scanner ò扫描系统,双向电泳分析软件I M P 6.0均为美国通用公司产品.
1.2 蛋白质样品的提取
2007年8月8日从建瓯采集正常发育与败育趋势的处暑红锥栗幼果果实,用液氮速冻,保存在-40e 下备用.
1.2.1 TCA-丙酮沉淀法的提取 称取2g 果实样品,加入液氮研磨成细粉,装入离心管中,加入8mL 冷丙酮?(含体积分数为10%的TC A 、0.7g #L -1B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置2-4h ,在20000g 下离心15m in ,弃上清液;取沉淀物,加入8mL 冷丙酮ò(含体积分数为0.07%的B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置30m i n ,在20000g 下离心15m in ,弃上清液;重复上一步;沉淀中残留的丙酮挥发干净后,于-20e 保存[4].称取20m g 丙酮干粉,加I EF ,用400L L 上样缓冲液溶解.缓冲液含480g
#L -1尿素、50g #L -1两性电解质(p H 3-10)、20g #L -1NP -40、50g #L -1B -巯基乙醇.涡旋混匀后于37e 下水浴2h ,在15000g 下离心20m in ;取上清液加入4倍体积的冷丙酮,室温沉淀1h ,在15000g 下离心20m in ,弃上清液;沉淀加I EF ,用50L L 上样缓冲液溶解,于37e 下水浴30m in ,在15000g 下离心5m in ,取上清液分装冻存.
1.2.2 裂解液提取 称取1g 样品,加入液氮研磨成细粉,装入离心管中,加I EF ,用3mL 裂解液(与1.2.1的上样缓冲液成分一致)溶解.涡旋混匀后于37e 下水浴2h ,在15000g 下离心20m i n ;取上清液加入4倍体积的冷丙酮,室温沉淀1h ,在15000g 下离心20m i n ,弃上清液;取沉淀物,加入8mL 冷丙酮ò(含体积分数为0.07%的B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置30m i n ,在20000g 下离心15m i n ,弃上清液;重复上一步骤2次;沉淀中残留的丙酮挥发干净后,加I E F ,用50L L 上样缓冲液溶解,于37e 下水浴30m in ,在15000g 下离心5m i n ,取上清液分装冻存.
1.3 蛋白质含量的测定
蛋白质含量的测定采用Bradford 法[10].Bradford 储存液由100mL 95%乙醇、200mL 88%磷酸、350mg
考马斯亮蓝G-250组成.工作液由425m L 双蒸水、15mL 95%乙醇、30mL 88%磷酸、30mL B radford 储存液组成,经滤纸过滤,用棕色瓶保存于室温下.用BSA 做标准曲线.将BSA 用双蒸水配制为1m g #mL -1的
标准溶液,吸取一定体积的标准溶液和样品液放入5mL 的Eppendorf 管中,最大体积为80L L ,不足80L L 的添加双蒸水至终体积为80L L,再加入4m L B radford 工作液混合均匀,在2m i n 内测D 595n m ,测量在1h 内完成.利用不同BSA 的光密度值作标准曲线,计算得到样品中蛋白质的含量.
1.4 锥栗蛋白质组的双向电泳
1.4.1 双向电泳 剥开I PG 胶条保护膜后,将I PG 胶条胶面朝下置于预先加好样品液的聚焦槽凹槽中,矿物油覆盖后,室温水化16-18h(水化上样240L g),然后进行等电聚焦(I EF)电泳.参照Am ersha m 公司双向电泳手册,I EF 采用I PGpho r ó-第一向等电聚焦仪(Am ersha m Phar m acia)进行,选用13c m 胶条(pH 3-10),蛋白400L g 泡涨上样.I EF 参数设置:300V 12h,500V 1h ,1000V 1h ,5000V 2h ,8000V 持续至总伏小时达65000h .
将聚胶好的胶条分别在含有1%DTT 和2.5%碘乙酰胺的平衡液(6mo l #L -1尿素,75mm ol #L -1Tris -H C ,l p H 8.8,29.3%甘油,2%SDS,0.002%溴酚蓝)中平衡20m i n .
1.4.2 银染 Bu l m 银染采用40%甲醇、10%乙酸固定胶1h ,30%甲醇洗胶2次,每次20m i n .水洗20m in .0.02%硫代硫酸钠增敏1m in .水洗3次,每次20s .冷的0.2%Ag NO 3、0.02%冷甲醛在4e 染色20m in .水洗,每次20s .更换盛胶的容器.水洗1m i n .0.05%甲醛,3%Na 2CO 3显色.观察颜色的变化,在显色液变黄时更换显色液,当染色完全时,5%乙酸终止显色.水洗3次,每次10s .1%乙酸4e 保存.
1.4.3 凝胶图像分析 分析软件是I m age M aster T M 2D P lati n u m soft w are ,用I m age scanner ò扫描系统成像,激发光为532nm 激光,扫描分辨率为10@10
-6m.利用I M P 6对凝胶图谱进行背景扣除、标准化、点探
测及匹配.#476#福建农林大学学报(自然科学版)第39卷
2结果与分析
2.12种蛋白质提取方法的比较
2种蛋白质提取方法的比较表明,TC A-丙酮沉淀法获得了较大的提取物,但定量分析发现之中仍然有大量的杂质,双向电泳结果较差,效果不理想(图1).这是由于TCA-丙酮沉淀法直接将干物质沉淀下来,蛋白质与膜或者其他组分的结合并没有很好地分离,而锥栗果实中纤维素和多糖等非蛋白质成分含量特别高,需要大量的裂解液才能从干粉中重新溶解蛋白质,因此,获得的蛋白质溶液浓度低,双向电泳检测不到蛋白质点,而浓缩蛋白质不仅费事,而且会损失部分蛋白质.而利用裂解液提取蛋白质,能够把蛋白质与纤维素、多糖等成分很好地分离,大量的沉淀物丢弃后,得到的蛋白质粗提物含量高,经过沉淀、溶解后得到蛋白质浓度高(图2),双向电泳结果表明其分离的蛋白质点多,蛋白质点清晰,杂质含量少,效果理想,适合锥栗果实的蛋白质提取.
图1TCA-丙酮沉淀法提取的总蛋白电泳结果图Fi g.1The p rot ein s a m p l es extracted w ith acetone
图2p H3-10蛋白质双向电泳扫描图谱
Fi g.2I m ages of p rot ein s pots for2-DE fro m p H3-10I PG s tri
ps
图3软件分析pH3-10蛋白质图谱
Fi g.3I m age analys i s of c h i n quapin p rotei n
2.2不同p H值IPG胶条的比较
为获得正常发育与败育趋势处暑红幼果果实蛋白质差异表达的信息,分别将蛋白质样品在p H3-10、p H 4-7的I PG胶条进行2-DE.在相同电泳参数条件下,蛋白质样品在p H3-10的双向电泳分离得到蛋白质点为400?20(图2、3);在p H4-7的双向电泳分离得到蛋白质点为350?50(图4、5),p H4-7的I PG胶条分离得到的蛋白质分布更加均匀,能够形成更宽、更清楚的pH范围.因此,p H4-7的I PG胶条比p H3-10的得到的蛋白质信息量更大,更适合于锥栗幼果果实功能蛋白质的分离.以上说明,p H范围宽的I PG胶条适合于植物材料的初步筛选,而p H范围窄的I PG胶条适合于植物材料功能蛋白质的分离.
2.3正常果实与败育趋势果实的比较
通过p H4-7的线性I PG胶条对锥栗正常发育与败育趋势幼果果实的蛋白质进行2-DE比较分析,应用I m ageM aster TM2D Plati n um软件对蛋白质胶进行多项分析检测,均可以获得高敏感、高分辨的图像(图4、5).软件分析每块胶得到蛋白质点为350?50.以锥栗正常
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第5期郑诚乐等:锥栗果实双向电泳体系的建立
发育幼果果实的蛋白质胶作为参照胶,发现丰度变化在2倍以上、重复性好的差异表达蛋白质60个.说明本方法适合于锥栗幼果果实差异蛋白质组学的分析
.
3 讨论
自1975年O c Farrell 建立蛋白质双向电泳系统以来,经过不断改进和发展,现已成为大量、快速、高分辨率地分离蛋白质的方法,是蛋白质组学研究最常用、最有效的手段之一,可清楚、直观地呈现每个蛋白质的等电点和相对分子质量以及表达量,是其他分离方法所无法比拟的
[10].样品制备和溶解处理的好坏直接影响双向电泳的效果,是双向电泳最为关键的一步.选择适宜的提取方法是成功的前提[11].锥栗果实的多糖及淀粉等物质对I EF 干扰大,而TCA-丙酮沉淀法对其多糖、酚类
物质的去除效果有限,导致蛋白的丢失,因此,本试验采用缓冲液直接提取方法,简单快速,蛋白质点清晰可见,蛋白分离效果佳.
IPG -DALT 系统操作简便,分辨率高,重复性好.不同p H 范围的I PG 胶条得到的蛋白点数不同,要根
据情况加以选择[12].本研究表明,p H 4-7的I PG 胶条比p H 3-10的I PG 胶条得到的蛋白质信息量更大.
p H 范围宽的IPG 胶条能反应锥栗胚胎蛋白质的特征,但难以有效区分等电点接近的蛋白.在p H 4-7分离出大量的蛋白质,说明锥栗胚胎的功能性蛋白质主要分布在该区域.
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图像分析和数据处理是蛋白质组学研究的重要内容,可以将每个蛋白质的等电点、分子质量、表达量等信息进行数字化,输入数据库,同时也是比较蛋白质组学进行差异表达分析的基础和前提[13].采用I m -age M aster T M 2D Platinum 软件对蛋白质胶进行多项分析处理,可获得高敏感、高分辨的图像,并保证结果的可靠性,适用于分离植物胚胎的蛋白质.本研究对正常发育与败育趋势锥栗幼果果实的蛋白质胶进行多项分析处理,获得了丰度变化在2倍以上、重复性好的差异表达蛋白质60个.
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(责任编辑:陈幼玉) #
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双向电泳常见问题
双向电泳常见问题 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？ 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ 这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 ％满）的矿物油。 3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。 5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 10. 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？ 可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。11. 为什么2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？ 横的脱尾可能是：1 ）一向等电聚焦不完全；2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3 ）
闽北锥栗主要病害发生规律及防治技术
闽北锥栗主要病害发生规律及防治技术 张发备（福建省建瓯市龙村乡农技站353112） 摘要：为促进锥栗生产的进一步发展，经 10 多年的生产、调查、试验、分析，初步掌握了闽北锥栗主要病害的发生规律及危害症状，并提出了科学有效的综合防治技术措施， 以供参考。 关键词：闽北地区；锥栗；主要病害；发生规律；综防措施 锥栗是福建省建瓯市特色果品，龙村乡是建瓯市锥栗著名产区, 现有栽培面积4533 hm2,年产量3000t，栽培历史悠久,历史上有名的“贡闽榛”就产于龙村。近年来，随着锥栗栽培面积集中成片的快速开发，品种引进频繁交流及管理粗放，为锥栗病 害侵染繁殖提供了生存环境，导致病害种类逐渐增多, 危害程度亦逐年加重，严重地影响了锥栗生产的进一步发展。因此，自1998年开始，笔者对龙村乡锥栗园病害的发生规律进行了认真调查、分析，并对主要病害进行了综合防治技术研究、试验，取得 了较显著成效，现将结果介绍如下。 1 锥栗主要病害 经调查，危害龙村乡锥栗的病害有栗疫病、栗叶斑病、栗炭疽病、栗白粉病、栗黑根立枯病、栗芽枯病、栗叶枯病、栗锈病等8种，但对生产上影响较大的主要病害是栗疫病、栗叶斑病、栗炭疽病、栗白粉病、栗黑根立枯病5 种。 1.1 栗疫病 病原菌属鞭毛菌亚门真菌，多发生在树蔸基部及主干的树皮上，尤其是嫁接口部位受害最重。发病初期，病斑呈水渍状、圆形或不规则形，后逐渐扩大蔓延，病部肿涨隆起，皮层组织坏死腐烂，并分泌出具酒糟味黑色汁液，后期皮层干缩纵裂，树势衰弱，叶小而黄，最终病斑环绕主干一周，导致栗树枯死。 病菌在栗树主干皮层内越冬，一般3月开始发病，5～8 月为发病盛期，10 月后病情逐渐停止。该病菌为弱寄生菌，土质肥沃、栽培管理好、树势强旺的锥栗树发病少；反之管理粗放、冰雹、冻害、病虫害、施肥不当、过度修剪、机械损伤、日灼等都会加 重该病害的发生。此病能远距离传播，主要靠接穗和苗木传播。
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景 1 双向电泳技术 1.1双向电泳技术概述 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。 1.2 双向电泳技术的原理 双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦( isoelectric focusing ,IEF) 将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通过分子量分离蛋白质。所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高，一般可分离
锥栗果实双向电泳体系的建立
福建农林大学学报(自然科学版)第39卷第5期Journa l of Fujian A griculture and Forestry U n i versity(N a t ura l Sc i ence Ed iti on)2010年9月 锥栗果实双向电泳体系的建立 郑诚乐,钟凤林,潘东明,刘小芝 (福建农林大学园艺学院,福建福州350002) 摘要:通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同p H值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于p H4-7. 关键词:锥栗;蛋白质组;双向电泳 中图分类号:S664.2;Q946.33文献标识码:A文章编号:1671-5470(2010)05-0475-05 Establis h m ent of t wo-di m ensional electrophoresis syste m for chinquapin fruits Z HENG Cheng-le,Z HONG Feng-li n g,PAN Dong-m ing,LI U X iao-zh i (Co lleg e o fH o rti culture,Fu ji an A g ricu lt ure and F orestry U niversity,Fuzhou,F uji an350002,Ch i na) Abstrac t:T he conven tiona l t w o-di m ensi onal electropho res i s techno l ogy w as i m proved i n o rder to deve l op an appropriate approach for proteo m ics of ch i nquapin fruits.T he study w as done by opti m izi ng different prote i n extraction me t hods and co m pa ri ng IPG str i ps at d ifferen t p H values.W it h the i m proved pro tein extraction m ethod,a stab l e,reproduc i b l e and h i gh reso l u tion2-D e l ectrophoresis m ap w as obta i ned.A fter sil ver staini ng,m ore than400prote i n spo ts w ere detected,w ith t he ir isoe l ec tric po i nts(pI)m a i nly at p H 4-7. K ey word s:chinquapi n(Castanea henry i R ehd.&W il s.);pro teom e;t w o-di m ensi onal e l ec trophoresis 双向电泳(t w o-d i m ensional e lectropho resis,2-DE)是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学研究的各个方面.双向电泳技术利用蛋白质的等电点和相对分子质量差别将各种蛋白质区分开来,其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段.对蛋白进行分离、鉴定,分析特异蛋白的功能及其作用机制已成为当今研究热点[1-3]. 锥栗(Castanea henry i Rehd.&W ils.)是我国南方栽培驯化最早、利用最久的经济林树种之一,也是我国古老的名特优稀落叶果树[4,5].锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜,含有淀粉、糖、蛋白质等主要营养成分及18种钙、锌、磷、钾、铁等矿物质[6].目前对锥栗果实营养品质的研究主要集中在成分分析方面[4-9],有关其营养品质的变异和相关性的研究尚未见报道.应用双向电泳对锥栗蛋白质组分进行质谱分析在国内外都少见报道.因此,本试验通过建立适于处暑红锥栗果实蛋白质分离的双向电泳体系,对蛋白质样品的制备、电泳参数和固相p H梯度干胶条等进行优化,以期提高锥栗果实蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,得到适于其分析的双向电泳试验条件. 1材料与方法 1.1试剂与仪器 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、I PG胶条(pH3-10,13、18c m;p H4-7,13、18c m)、I PG buffer(p H3-10;p H4-7)、胶条覆盖液(矿物油)、Phar m y lte、碘乙酰胺、C HAPS、二硫苏糖醇(DTT)和TE M ED均购自Am ersha m Phar m acia公司;苯甲基磺酰氟(P M SF)购自Sig m a公司;其他试剂为国产分析纯. 收稿日期:2009-09-22修回日期:2010-03-10 基金项目:国家支撑计划项目(2007BAD07B01);福建省科技厅资助项目(K02058). 作者简介:郑诚乐(1963-),男,副教授,博士.研究方向:果树栽培.Ema i:l zcl2003@126.co m.通讯作者潘东明(1956-),男,教授,博士生导师.研究方向:果树栽培生理及生物技术.Em ai:l pdm6666@126.co m.
板栗种植技术完整版
板栗种植技术标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
板栗（学名：Castanea mollissima），又名栗、、、风栗，是植物，原产于中国，分布于越南、台湾以及中国大陆地区，生长于海拔370~2800米的地区，多见于山地，已由人工广泛栽培。栗子营养丰富，维生素C含量比高，更是苹果的十几倍。栗子中的矿物质也很全面，含钾、锌、铁等。虽然含量没有高，但仍比苹果等普通水果高得多，尤其是含钾量比苹果高出3倍。 1、形态特征 板栗是壳斗科（山毛榉科）栗属中的乔木或灌木总称，约有7-9种。我国一般分为2种：野生板栗和杂交改良板栗。我国普遍种植的是杂交培养后的改良品种，因个大、味甜、抗病性强被我国广泛种植。板栗原生于北半球温带地区，大部分板栗树高20~40米，为落叶乔木，只有少数是灌木。各种板栗树都结有可食用的坚果，单叶、椭圆或长椭圆状，长10~30厘米，宽4~10厘米，边缘有刺毛状齿。雌雄同株，雄花为直立柔荑花序，雌花单独或数朵生于总苞内。坚果包藏在密生尖刺的总苞内，总苞直径 5~11厘米，一个总苞内有1~7个坚果。花期5~6月，果熟期9~10月。 ，落叶乔木，高15~20m。树皮深灰色；小枝有短毛或散生长绒毛；无。叶互生，排成2列，卵状椭圆形至长椭圆状披针形，长8~18cm，宽 4~7cm，先端渐尖，基部圆形或宽楔形，边缘有锯齿，齿端芒状，下面有灰白色星状短绒毛或长单毛，侧脉10~18对，中脉有毛；叶柄长1~1.5cm，有毛；托叶早落。 花单性，雌雄同株；雄花序穗状，直立，长15~20cm，雄6裂，雄蕊10~12；雌花集生于枝条上部的雄花序基部，2~3朵生于一有刺的总苞内。雌花萼6裂，，6室，每室1~2枚，仅1枚发育，柱头顶生，点状。 壳斗球形，直径3~5cm，内藏
建瓯锥栗产业现状
关于发展锥栗产业的意见 锥栗是建瓯唯一拥有原产地域保护，最具历史、最具特色、最具规模的传统农业产业。20世纪90年代以来，建瓯市把锥栗作为农民增收的重要产业来抓。通过实施“科技兴榛，富民强市”产业发展战略，促进锥栗产业的快速发展，使之成为独特且有魅力的特色产业。但是建瓯锥栗产业大而不强，规模也仅仅体现在量的概念上，有广阔的发展空间亟待释放，需要进一步努力，实现突破，将锥栗大县变为锥栗强县。 一、锥栗产业现状 1、栗果品质一流 建瓯属亚热带海洋性季风气候，东南沿海低山丘陵区，气候温暖，光照丰沛，水源充足，四季分明，建瓯的群山，阻挡了寒流侵袭，形成独特的微域气候，空气湿润，多雾，日夜温差大，极少冻害、风害。独定的气候环境和优越的光、热、水、土资源条件为锥栗生理和生化过程物质代谢创立了稳定的生态、生产最适宜环境，形成了独特的品质性状的感官特色：坚果呈圆形或圆锥形，一般平均果高为2.1—3.0cm，直径1.8—3.5cm，果皮具有黄褐色、红褐色、棕褐色的亮丽光泽，果仁淡黄色，肉质细嫩，风味鲜美。鲜食则脆甜爽口，炒煮食则甜糯滑爽，口留余香，还可以清炖、燔焖。理化质量特色：栗仁含蛋白质7.63%、脂肪2.23%、水溶性总糖12.57%、淀粉64.2%，还含有17种氨基酸和多种维生素，其中维生素C含量高达30.2—40.8mg/100g。2004年8月9日，国家质检总局批准自对建瓯锥栗实施原产地域保护。 2、面积、产量、种质第一 锥栗其自然分布于我国长江流域以南到南岭以北的广大地区，大多作为速生阔叶用材树种利用，作为经济作物栽培，主要在闽、浙两省，20世纪50年代以前仅限于建瓯、政和、松溪，浙南山区于20世纪70年代末开始从
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
锥栗丰产栽培技术
锥栗丰产栽培技术 锥栗属于壳斗科落叶大乔木,果材兼用的木本粮树种,主要分布在秦岭,淮河以南的皖、川、桂、闽、赣、浙等省(区).福建栽培锥栗历史,已有百余年之久.闽北以建瓯市为主产区,向周围建阳、政和等县(市)拓展,形成锥栗产业带。 锥栗树适应性强、抗寒、抗病虫害，栽培管理上比较粗放。坚果品质优良，营养丰富，经济价值高，市场前景十分广阔，深受广大群众喜爱。本文就目前生产上存在问题，阐述锥栗园丰产优质栽培技术。 锥栗是林果兼用树种，种仁属优质的干果，被人体吸收率高达95%以上。锥栗果还含有人体所需的胡萝卜素、氨基酸等，营养价值高于面粉、大米和薯类。锥栗可鲜食、炒食、菜食或清炖，也可磨粉制作糕点、代乳粉，还可加工成罐头、锥栗糕等副食品。在国际市场上供不应求，发展前景看好。锥栗是一种高产的木本粮食作物，且盛果期达50～80年。 锥栗喜温暖湿润的环境，喜光，耐寒、耐旱、耐瘠薄，适应性强。适生于年均气温11～20℃，年降雨量1000～1500mm的气候条件，能耐绝对最低温-16℃。要求平均相对湿度80%以上，日照时数为1500小时左右，无霜期280天以上。要求深厚、疏松、肥沃、湿润和排水良好的酸性土壤(pH 值5.0～5.5)，也能耐贫瘠土壤。
1 优良品种简介 1.1.靖州大锥栗 壳斗科、栗属（Casranea henryi rehd. Et wils），落叶乔木干果和木本粮食树种。湖南省靖州县实生选优定向繁育。果形大（平均单位重28.6-32.4g、平均单粒重 8.4-9.6g），早实、丰产性好，抗逆性强、耐贮运（常温下有效存放期60天以上）。 1.2白露仔 为早熟主栽品种，为丰产、稳产品种。萌蘖分枝性强，树冠较直立，叶较大，长11.2-18.3cm，宽4.9-5.7cm，深绿色，叶背生带棕色茸毛(叶脉为多)。果苞较小，苞刺较疏，但较粗硬。白露左右成熟，总苞成熟时呈现2裂状，少有3裂，含坚果1个(少有2个)。果中等大小，圆锥形、棕褐色，果壳毛茸较少、果顶尖而瘦、果底小肾脏向外凸出成钝尖为其品种特征，果120-140粒/kg，果肉淡黄色，品质中等，在肥沃湿润的南坡上生长良好。结实大小年现象不明显。种植时应适当增加密度。 1.3乌壳长芒 中熟品种，树较高大，树形开张，叶长16.5-23.3cm，宽4.95-6.9cm，青绿色。新梢顶部及幼叶背面有棕黄色茸毛，老叶较光滑，披针状椭圆形或长椭圆形。总苞较大，苞刺密且长为其主要特征。秋分后成熟，成熟时呈二裂状，果较大，
闽北锥栗主要病害发生规律及防治技术修订稿
闽北锥栗主要病害发生规律及防治技术 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
闽北锥栗主要病害发生规律及防治技术 张发备（福建省建瓯市龙村乡农技站353112） 摘要：为促进锥栗生产的进一步发展，经10 多年的生产、调查、试验、分析，初步掌握了闽北锥栗主要病害的发生规律及危害症状，并提出了科学有效的综合防治技术措施， 以供参考。 关键词：闽北地区；锥栗；主要病害；发生规律；综防措施 锥栗是福建省建瓯市特色果品，龙村乡是建瓯市锥栗着名产区, 现有栽培面积4533 hm2,年产量3000t，栽培历史悠久,历史上有名的“贡闽榛”就产于龙村。近年来，随 着锥栗栽培面积集中成片的快速开发，品种引进频繁交流及管理粗放，为锥栗病害 侵染繁殖提供了生存环境，导致病害种类逐渐增多, 危害程度亦逐年加重，严重地影 响了锥栗生产的进一步发展。因此，自1998年开始，笔者对龙村乡锥栗园病害的发 生规律进行了认真调查、分析，并对主要病害进行了综合防治技术研究、试验，取得 了较显着成效，现将结果介绍如下。 1 锥栗主要病害 经调查，危害龙村乡锥栗的病害有栗疫病、栗叶斑病、栗炭疽病、栗白粉病、栗黑根立枯病、栗芽枯病、栗叶枯病、栗锈病等8种，但对生产上影响较大的主要病害是栗疫病、栗叶斑病、栗炭疽病、栗白粉病、栗黑根立枯病5 种。 栗疫病 病原菌属鞭毛菌亚门真菌，多发生在树蔸基部及主干的树皮上，尤其是嫁接口部位受害最重。发病初期，病斑呈水渍状、圆形或不规则形，后逐渐扩大蔓延，病部肿涨隆起，皮层组织坏死腐烂，并分泌出具酒糟味黑色汁液，后期皮层干缩纵裂，树势衰弱，叶小而黄，最终病斑环绕主干一周，导致栗树枯死。 病菌在栗树主干皮层内越冬，一般3月开始发病，5～8 月为发病盛期，10 月后病情逐 渐停止。该病菌为弱寄生菌，土质肥沃、栽培管理好、树势强旺的锥栗树发病少；反之管理粗放、冰雹、冻害、病虫害、施肥不当、过度修剪、机械损伤、日灼等都会加重该病害的发生。此病能远距离传播，主要靠接穗和苗木传播。
双向凝胶电泳技术原理与应用
双向凝胶电泳技术原理与应用 Principle and application of two-dimensional gel electrophoresis 姓名：XX 班级：检验本科1113班 学号：XXX 【摘要】人类基因组计划与美国塞莱拉遗传信息公司于2001年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱，至此，人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构基因组学等新的概念的提出，蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2.DE）是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一 【abstract】Human gene group plans and United States sailaila genetic information company Yu 2001 in United States Science under magazine and United Kingdom natural under magazine joint announced, they draws out has accurate, and clear, and complete of human gene Group map, at this point, human gene group plans has basic completed, as Hou gene group era of comes, protein group learn get has unprecedented of development, protein group research aimed at reveals gene express of real implementation life activities of all protein of express law and biological function. Includes proteome, proteomics, structural proteomics and functional genomics of new concepts, such as proposed, proteomics has become extremely active in the field of biological sciences. Two-dimensional gel electrophoresis (two-dimensional electrophoresis,2.DE) is one of the three key core technologies of proteome research
任职资格体系概念
一、任职资格体系问题的提出： 在大量的管理和咨询实践中，我们发现，企业往往受到以下管理方面的困惑：公司方面明确了使命、愿景、价值观，但只是挂在网上做给别人看，公司说的与员工做的根本就是两回事，公司高层期望员工应有的职业素养只是一厢情愿； 公司经过反复调研、考察、论证，决定拓展新项目，一切就绪后才发现无人可用，只得作罢；领导力发展方面没有系统规划，人才准备度不够成为不少高速增长公司的瓶颈； 关键岗位的用人决策的依赖直觉与个人经验，由于缺乏有效的标准和方法，甚至存在“试人”的现象，数据显示国内管理人员招聘成功率不足50%； 公司建立了能力模型（也称素质模型、胜任力模型），可用于招聘选拔等，但是面临岗位晋升、工资晋级等实质问题时，又显得束手无策，无据可依； 经过公司考察，将在业务上屡创佳绩的某明星员工提拔为管理人员。结果业务专家沦为平庸的经理，不但四周的人不满，本人的职业生涯也陷入泥潭，进退两难； 不少老板看到公司在创业期过后，员工的工作激情不再，效率低下，于是引进咨询项目，建立起科学系统的绩效管理系统，以图改进公司绩效，提升员工个人能力，结果却是上下均应付了事，对强制分布的做法甚至处处设法抵制。老板一头雾水，不知问题出在哪里； 公司通过薪酬改革等一系列措施，建立了激励机制，有效性却非常有限，有些公司的员工甚至比以前更为不满了； 下属工资不能高于主管，技术人员不往管理岗位发展就没有前途，不少技术骨干纷纷另谋出路； 任何员工都有主观愿望，希望把工作做好并有所成就，但由于员工发展通道不明确，在公司看不到个人的未来，公司飞速发展，个人却没有相应增值，员工日益消极； 公司非常舍得为中高层干部花钱培训，但往往收效甚微，有的培训课程下来，公司甚至更加忙乱了； 一旦某些管理人员或明星员工离职，身后往往留下一大片空白，对知识、经验、技能的提炼和传递缺乏有效性和系统性，成为不少公司业务断层的难治之症。二、问题的原因 上述问题其实都可以归纳为以下三个问题： 企业需要什么样的员工，希望员工如何做事，员工应有什么样的贡献？ 解决之道在于：在投入上，企业要明白员工应具有什么样的素质、知识、技能，在员工作业的过程中，企业要将期望员工的行为明确传递给员工，最后，再管理好员工的贡献，如此形成一个闭合管理循环。这也是任职资格体系的系统性、有效性所在 三、任职资格体系的介绍
建瓯市锥栗种植现状及造林管理技术
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/1711818003.html, 建瓯市锥栗种植现状及造林管理技术 作者：陈水电 来源：《现代园艺》2013年第04期 摘要：本文主要介绍了建瓯市山地锥栗种植的现状，并从育苗、嫁接、造林地选择、整地与造林、拉枝、整形修剪、肥水管理、病虫害防治等方面，对锥栗造林管理技术做了重要探讨，对建瓯市锥栗产业获得速生丰产有一定的借鉴意义。 锥栗（Ca stanea henryi（skan）Rehd et Wils）是建瓯特产，壳斗科植物，其果实富含淀粉、糖、蛋白质以及脂肪，营养丰富，碳水化合物含量比小麦高，脂肪含量比稻米高出2～3倍，且含有抗坏血酸和胡萝卜素。其果香甜可口，生食、炒食均可，还可加工成月饼、罐头等食品。 1 建瓯锥栗种植现状 建瓯锥栗栽培历史有1800多年，历史上的“贡闽榛”就产于建瓯“西乡”，生产的锥栗具有 独特的“糯、甜、香”特色，为“中国名特优经济林锥粟之乡”。建瓯市锥栗种植面积、产量和栽培品种资源均为全国之最，2004年8月9日，建瓯锥栗被列入国家原产地域保护产品。20世纪80年代以来，建瓯市实施“科技兴市，富民强市”的发展战略，市委市政府把开发锥栗产业，创名优品牌摆上议事日程。将发展锥栗产业列为全市5大主导产业之一，并成立建瓯市锥栗生产指挥部，建瓯市锥栗协会等机构，加大锥栗开发力度，增加科技和资金的投入，使锥栗产业开发得到了有序发展。 建瓯市锥栗栽培面积由1997年的5333.33hm2，投产面积9333.33hm2，产量900t，发展到现在栽培面积28000hm2，投产面积20000hm2，产量22500t的规模。 2 苗木培育 2.1实生苗 实生苗就是利用种子播种培育的苗木，优点是根系发达、生长健壮、寿命长、适应力强。主要是用来作砧木，繁育优良的嫁接苗，在圃地培育到苗高50cm左右时开始嫁接。 2.2采穗 休眠期，选择5～10年生锥栗母树，在树冠外围中上部选取充分成熟、健壮、芽眼饱满的结果枝，粗度要求为0.5～1.0cm，基本与砧木粗度相一致。采取接穗后，将接穗按50或100 根捆成1扎，再用湿度60%的河沙贮藏于室内。 2.3嫁接
构建任职资格体系
轻轻松松构建任职资格体系 默认分类2010-05-25 13:57:45 阅读58 评论0 字号：大中小订阅 子曰：生而知之，学而知之，困而知之。中国人用人讲究看悟性或者叫学习领悟力，而这是看不见摸不着的内在能力。无独有偶，美国的麦柯里兰胜任模型理论将人的胜任力分为显性的知识与技能以及隐性的社会角色、自我概念、特质、动机，并且认为胜任力决定人的行为，特别是隐性的胜任力从根本上决定了人的行为。英国任职资格体系认为，知识、技能、态度（简称KSA）决定了员工的行为，因为态度无法具体衡量，所以习惯上是通过知识技能测试再加上行为举证来判断员工是否胜任某岗位。可见对组织内部各个岗位任职资格的认定十分必要，它是所有人力资源管理的基础和依据。那么企业该如何构建自己的任 职资格体系呢？ 从理论出发，了解任职资格 总的来说，企业内部每一个员工的任职资格都必须通过岗位任职行为标准或岗位资格标准来体现，因此要想在组织中真正推行任职资格的管理，必须从概念上准确认知岗位任职行为标准和岗位资格标准。 岗位任职行为标准 岗位任职行为标准是指员工完成对应岗位业务范围内工作活动的成功行为的总和，它强调的是胜任的任职者要做什么、怎么做以及按照什么要求输出什么。 一个完整的岗位任职行为标准应该包括：职责、任务、行为标准三要素。所谓“职责”，是通过“名词+动词”的方式来描述在工作中应扮演的角色，它强调的是做什么。所谓“任务”，是指每项职责履行所需要完成的多项工作步骤及内容，同项职责下面的各项任务关系可以是流程关系，也可以是并列关系。它强调的是怎么做。所谓“行为标准”是指每项任务要按什么要求输出什么，它对应的是行为结果，也可以是技能的熟练程度（做到什么程度）。行为标准一般可分为“需要与他人合作完成（需要他人指导）”、“单独完成”、“训练他人”等级别，各项行为标准要有对应的逻辑关系。表1为某企业培训经理的任职资格行为标准（部分）。
锥栗高产栽培技术
锥栗高产优质栽培技术 一、及时施肥和进行根外追肥 1、萌芽肥：施肥时间在“正月”底到“春分”，每株施碳铵1—3斤。施肥深度30cm，注意不能与过钙混施，以免降低肥效。 2、壮果肥：在“端午”节前施完，施肥深度10cm，株施含硫三元复合肥1-3斤，此期应注意少伤根，特别是不能伤了大根，否则易引起落果。 3、补体肥（采果肥）：施肥深度30cm以上，株施桐饼肥3-5斤+硼砂1两+呋喃丹1两+过钙1斤，饼肥应先充分腐熟后与其它肥料拌匀施，此次施肥应于采果后立即施下。 4、根外追肥：锥栗是高锰作物，同时对硼肥敏感。缺硼易引起空苞现象，如出现缺肥现象，可叶面喷施0.5%硫酸锰溶液或是0.1-0.2%硼砂溶液，其它肥料如 0.3%kcl溶液或0.3%磷酸二氢钾溶液。 二、整形修剪 1、幼树整形：自然开心形，适于矮化密植栽培。具体方法：(1)苗木定植后，在离地面70cm处短截，萌芽后顶端30cm整形带内的枝条保留，整形带以下的枝条一律抹除。在整形带内选留3-4个角度适宜，方位错开的枝条为主枝，主枝与主干的夹角为60度，其它枝条摘心作为辅养枝，（2）主枝长到处50cm以上时应进行摘心，定植第二年，在各主枝抽生的
（1）夏季修剪：主要是抹芽、疏删、摘心和拉枝。 （2）冬季修剪：先剪除徒长枝、病虫枝、荫蔽枝、交叉枝、重叠枝等扰乱树形、影响通风透光的枝条。对于放任树应先降低树高，用两年时间分批将主干枝短截1/3-1/2，利用剪口芽培育成矮化、开张、丰产的树形。对连年结果长势较弱的结果枝应进行短截，重新培养健壮的结果母枝，其余朝外生长长势较旺的结果枝一律不得短截，以免影响产量。 三、冬季管理 1、采果后注意迅速补充肥料，以恢复树势,同时及时防治叶片病虫害,延长叶片光合作用功能,增加树体营养积累。 2、主干刷白：在离地面80CM高的主干上进行刷白，作用：防冻、防日烧、防病虫。刷白剂配方：水20斤+生石灰5斤+硫磺和盐各0.5斤 3、全面清园：清除地面枯枝、落叶、落苞和杂草集中烧毁，全园透喷一次5波美度的石硫合剂，铲除越冬病虫残体，减轻次年病虫为害。 四、锥栗病虫害综合防治 1、近年危害较重的几种主要病虫害的防治措施： （1）、叶片红点病：用爱苗+多菌灵在萌芽展叶后隔7-10天喷一次，连喷2-3次。 （2）、酮干病：在早春气温回升到栗树发芽前，及时刮除病斑集中烧毁，并涂40%腐烂敌30-50倍液或843康复剂原液或5倍甲基托布津。
IEF-SDS PAGE双向电泳技术
双向电泳 一、材料 样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH 二、试剂 SDS-PAGE所需试剂 1、30％Acry-Bis (w/v) 29.2％Acry29.2g 0.8％Bis0.8g 加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配 2、10％的SDS贮液(w/v) RT保存，因SDS在4℃会析出 3、Tris-HCl buffer ①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer 100ml含Tris18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存 ②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer： 50ml 含Tris6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存 4、TEMED 以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存 5、10％AP 1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置 6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存 终浓度 Tris碱3g 250mM Gly（25.05）14.4g 250mM SDS 1g 0.1% (192mM) 加水至1L，可不调PH 7、甘油液4℃31ml 丙三醇 5.5ml DDW 25.5ml
8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250） 总体积100ml 终浓度 甲醇Methanal 45ml 45% 水45ml 冰醋酸10ml 10% R250 0.25g 0.1% 改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇） 100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。 9、脱色液 7.5ml的冰醋酸 5ml的甲醇 加水至100ml 或者用含有少量NaCl的清水进行脱色 IEF 试剂 10、一向裂解液Lysis buffer ，-80℃贮存 总体积MW 10ml 终浓度 urea 60.06 4.2042g 7M 硫脲(thiourea) 76.12 1.5224g 2M CHAPS 614.89 0.4g 4% DTT 154.25 0.108 70mM Amphylyte PH3~9.5 200μl Tris-base 121.14 0.048456g 40mM 临用前加EGTA (100mM) 400μl 4mM PMSF(100mM) 200μl 2mM 11、一向管胶覆盖液Overlay buffer ，-80℃贮存 Lysis buffer 稀释一倍即可 12、上下槽电泳液（现配） 上槽阴极液（20mM的NaOH）：10ml 1M的贮液加水至500ml 下槽阳极液（10mM的H3PO4）：5ml 1M的贮液加水至500ml 注：若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换 13、平衡缓冲液：一向管胶之后的balance buffer 2% SDS 10%甘油 5%β-巯基乙醇/DTT 62.5mM的Tris-HCl (PH6.8) 微量溴酚蓝
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展 摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。 关键词: 双向电泳，应用，前景 1.1双向电泳技术概述 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别， 产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。 1.2双向电泳基本原理 1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。 2双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其分辨率已从15 个蛋白质点发展到10 000多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨 1 000～3000 个蛋白质点。因此，近年来，双向电泳被广泛应用于农业、医学等研究领域。 2.1 在动物科学中的应用 在动物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于小鼠血清蛋白、卵巢蛋白、兔晶状体蛋白质、昆虫离体细胞膜蛋白、户尘螨蛋白、家蚕雌性附腺及其Ng突变体蛋白质、大腹园蛛毒素蛋白质、家蚕蛋白质、牛精液蛋白、猪巨噬细胞蛋白等方面的研究。如钟小兰等[2]利用双向电泳技术分析肝郁症模型大鼠血清蛋白质组的差异表达。王治东等[3]采用蛋白质组学的双向电泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了8Gy γ射线照射后24 h 小鼠血清蛋白质的变化。马翔等[4]通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组，并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究。刘奕志等[5]通过双向电泳和质谱鉴定有效分离和分析兔晶状体蛋白质组的特性，为白内障的防治带来新的前景。柳亦松等[6]以大腹园蛛粗毒为材料利用双向电泳技术获得蛋白质组双向电泳图谱，检测到500 个左右的蛋白质点，并对其中部分蛋白质点进行了质谱分析。靳远祥等[7]采用双向凝胶电泳和计算机辅助分析方法，分别对家蚕（Bombyx mori）限性黄茧品种雌蚕（黄茧）和雄蚕（白茧）的中部丝腺组织细胞蛋白质进行分离和比较分析。 2.2 在植物中的应用 在植物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于水稻蛋白质、小麦蛋白质、茶树蛋白质、杉树蛋白质等方面的研究。如易克等[8]利用双向电泳技术对水稻种子胚乳蛋白进行了分析，获得了较好的电泳图谱，为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电泳分析技术。Picard 等利用双向电泳分析了亲缘关系较近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性。林金科等[9]利用双向电泳技术分析了茶树蛋白质组，探索出一种可获得重复性好，清晰度高的蛋白质双向电泳图谱技术，并发现