腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统
AdEasyTM操作手册
目录
第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4
4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5
4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5
4.2.1 共转化的一般原则 5
4.2.2 共转化方法 5
4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6
4.4.1 细胞铺板 6
4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8
5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9
5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12
5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14
5.5.6 免疫测定14
5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18
5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19
5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22
6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24
6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27
缩写英文全称中文全称
Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点
Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位
pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose
50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(一般使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)经过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们一般感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，特别是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表示蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病
毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表示重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb 的外源DNA，当前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表示。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表示重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表示基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表示的最佳系统，它能够使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高
这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。另外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA 分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表示盒可达7.5kb。
5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表示而且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增：293细胞能够适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表示重组蛋白。
8. 能同时表示多个基因这是第一个能够在同一细胞株或组织中用来设计表示多个基因的表示系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表示盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表示一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表示情况。
第三章AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表示盒装入转移载体，然后再经过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是经过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子经过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它
酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。
3.2 Ad EasyTM系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见5.2.2）。进行这些测定之前，必须先扩增QBI-293A细胞（见5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑测定可让你观察到病毒空斑的形成。
第四章主要流程4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表示盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA
位点供基础表示和高表示重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV 的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。表 1 AdEasyTM转移载体特性载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明pShuttle 7.5kb ——MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）转染位点（PacI）将完整的表示盒装入多克隆位点（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表示蛋白4.1.1 克隆的一般原则AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：1）在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。2）重组腺病毒质粒在转染QBI-293A细胞之前也必须用PacI进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI位点，如果有则必须进行定向突变。3）克隆能力是指质粒载体能够克隆而且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表1，建议插入基因的长度最好不超过它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。4）如果要插入多个表示盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如
CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。5）在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表示。这里没有提供详细的操作方法，但在CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表示实验。但某些启动子控制下的蛋白表示水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。6）载体DNA可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA进行转化和转染实验，因为污染的DNA 将大大降低菌落和空斑的形成数。
4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体构建重组AdEasyTM转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。1．若cDNA含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，能够使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位点的引物进行PCR或连接含有酶切位点的接头使cDNA产生新的酶切位点。PCR 插入酶切位点的方法较快速，但对于长cDNA则应使用连接接头，因为在扩增过程中Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。2．插入基因的鉴定能够用限制性内切酶分析或PCR的方法。3．转化之前用PmeI或EcoRI将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。4．琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65℃20分钟进行灭活。5．凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于
降低背景信号。6．重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/ul。每个转化实验取1ug进行，包括对照。
4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生4.2.1 共转染的一般原则1）将线性化转移载体和pAdEasyTM-1 DNA共转化BJ5183必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108已足够）。2）DH5α不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒DNA。3）本实验需要2ug线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需1ug。
4.2.2 共转化方法同时进行实验组和对照组的转化实验：实验组共转化：1ug线性化重组转移载体（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1载体（100ug/ul）对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体1．将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为2管，每管40ul。2． 40ul感受态细胞中至多加入6ul DNA，且DNA必须溶于水，避免含有离子。3．将BJ5183转入2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。
4．按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5 Ohms、2.5KV、C=0。5．用1mlLB重悬转化物。6．转入15~50ml离心管中，37℃震荡培养60分钟。7．将转化物铺3~5块 LB/Kan（50ug/ml）培养板，37℃培养24小时。建议分别铺100、300和600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到40~100个菌落。8．挑出24个最好的克隆，转入2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养10~15个小时。不要储存BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组AdEasyTM质粒。9．用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒DNA抽提试剂盒能够用。重组质粒大小约40kb，由于它是低拷贝质粒，因此小量制备时应相应调整具体操作。
4.2.3 预期结果20%以上的菌落应含有大质粒（近40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。
将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后一般得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含
有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增：转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必须的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。1．将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。2．将1-5ul DNA加入40ul DH5α感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。3．将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。4．按照说明转化DH5α：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。5．将转化混合液重悬于1ml LB中。6．转入15-50ml离心管中，37℃振荡培养60分钟。7．培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）8．取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养24小时。未用的转化液可在4℃保存-2周。9．每个重组子挑1~3个克隆转入5ml LB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。10．用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。11．取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul 0.1×TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。
注意：培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：无菌在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。DNA纯度磷酸钙转染中所用的DNA必须是高纯度的，一些DNA污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。沉淀时间以前的资料都建议磷酸钙- DNA共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应20分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后1分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。
4.4.1 细胞铺板每块板都用DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到70%汇合率。由于共转染是经过细胞表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。1．转染前一天以7.5×105 QBI-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.0~1.5×106。37℃CO2孵箱中培养。CO2孵箱有助于保持合适的PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在CO2孵箱中。2．转染前3-4小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的
生长力。将培养皿放回CO2孵箱中。
4.4.2 磷酸钙转化技术1．每个转染都必须用5ug无菌的线性化重组腺病毒DNA。2．标记一个1.5ml离心管为编号1。用微量移液枪加入169ul无菌水和5ul 2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ug DNA。3．准备第2管离心管（编号2），加入250ul 2×HBS缓冲液。4．用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打能够形成较小的颗粒。等一分钟后再加入细胞培养皿内。5．在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。6．培养皿放入孵箱培养过夜。4小时后，沉淀颗粒在200×倒置显微镜下应清晰可见，特别在无细胞的培养皿表面。7．第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪重复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8．将细胞分装入4个60mm培养皿（每个培养皿中加5ml DMEM5%）或
一块6孔板中（每孔加3ml DMEM5%），静置6小时使其贴壁。6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。
第五章常见技术
昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A 细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。因此，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM 后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说一般是一个好的对照。QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：表2：汇合率与细胞数量汇合率(%) 60mm培养皿100mm培养皿
50 1.60×106 3.5×106 75 2.40×106 5.25×106 100 3.20×106 7.00×106
5.1.1 QBI-293A细胞初始培养
1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。
2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。
3. 将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g离心5分钟使细胞沉淀。
4. 弃去上清。
5. 将细胞用10mL DMEM 10%重悬，轻轻打匀
6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。
7. 在5% CO2孵箱中37℃培养过夜。
8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实验，否则按5.1.2所述继续培养。
5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代
1. 室温下胰酶消化1~3分钟使贴壁细胞脱落
2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。
3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。在5% FBS中，细胞倍增的时间是26小时，在10% FBS中稍短一些。
5.1.3 QBI-293A细胞的冻存建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表
型。
1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。
2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。
3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。
4. 用血球计数器进行细胞计数。
5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞，细胞终浓度为1×106/mL。
6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。
7. 将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。
8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。
5.2 QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。
QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。10~20的MOI值一般见于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在90~95%左右，因为细胞在感染数小时内将停止生长。加入病毒的量可经
过MOI值测定（见5.3）或病毒滴度测定（见5.8）确定。在这个MOI值条件下，被感染细胞的形态在1~2天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见 5.2.2）。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分，这一表现称为细胞病理效应（CPE）。感染后3天，所有细胞都将呈现CPE。当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。另外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。
病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为限制病毒的扩散，一般在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。感染后7天左右能够在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天能够在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.360docs.net/doc/197527925.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.360docs.net/doc/197527925.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。 产品订购和技术支持 山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处 美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室 广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室 山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.360docs.net/doc/197527925.html, Phone: 400-077-2566 https://www.360docs.net/doc/197527925.html,(美国) https://www.360docs.net/doc/197527925.html,（中国） 欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
pLVX-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 （1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装； （2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间 超过6个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小 包装病毒产品（购买时请提出）。 （二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞 用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。 感染目的细胞 2
pLVX-DsRed-Monomer-N1慢病毒载体使用说明
pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1载体基本信息： pLVX-DsRed-Monomer-N1载体质粒图谱和多克隆位点信息： 载体名称: pLVX-DsRed-Monomer-N1 质粒类型: 慢病毒表达载体；荧光报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8751 bp 5' 测序引物及序列: CMV-F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (Invitrogen) 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: DsRed-Monomer（C-端） 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin) 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系，293、CV-1、CHO等 备注: pLVX-DsRed-Monomer-N1载体表达C端DsRed-Monomer 融合蛋白； DsRed-Monomer是DsRed的单体突变体，与DsRed相比， 编码序列经过了人工优化，适用于在哺乳动物细胞中的 高水平表达； CMV启动子是过表达启动子。 稳定性: 稳表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 慢病毒
pLVX-DsRed-Monomer-N1载体简介： Description pLVX-DsRed-Monomer-N1 is an HIV-1-based, lentiviral expression vector that allows you to express your gene of interest fused to DsRed-Monomer, a monomeric mutant of the Discosoma sp. red fluorescent protein. Genes cloned into the multiple cloning site (MCS),located upstream of the DsRed-Monomer coding sequence, are expressed as N-terminal fusions of the DsRed-Monomer protein. Expression of the fusion protein is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE) located just upstream of the MCS. Lentiviral particles derived from the vector allow the expression of DsRed-Monomer fusion proteins in virtually any cell type, including primary cells. The unmodified vector expresses DsRed-Monomer, and may be used to produce marker virus to optimize infection protocols. pLVX-DsRed-Monomer-N1 contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and nhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-DsRed-Monomer-N1 also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and