生物制品检验大实验

生物制品检验技术实验总结报告

前言：

生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人工原组织和液体等生物材料制备的。用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品[1]。

一、概述：

生物制品的种类，根据采用的材料、制法或用途不同，可分为六类：疫苗类药物、抗毒素及抗血清类药物、血液制品、重组DNA制品、诊断制品以及其他制品[2]。生物制品的特点，分子量不是定值、生化法结构确证、需检查生物活性、要求安全性检查、需做效价测定[3]。生物制品检验的性质是运用化学或生物化学的方法和技术来研究生物制品的质量及其控制方法，是一门研究和开发生物制品及其质量控制的“技术学科”[4]。此次生物制品检验技术实验主要包括生物制品中水分的测定、生物制品中蛋白质含量的测定、氨基酸的分离鉴定。

二、实验原理：

实验一生物制品中水分的测定

此次实验运用直接干燥法测量奶粉中水分的含量。其原理基于生物制品中的水分受热以后,产生的蒸汽压高于空气在电热干燥箱重中的分压,使制品中的水分蒸发出来,同时,由于不断的加热和排走水蒸汽,而达到完全干燥的目的,制品干燥

的速度取决于整个压差的大小[5]。

实验二生物制品中蛋白质含量的测定

此次实验运用经典的凯氏定氮法测量蛋白质含量，其原理是样品用浓硫酸消化时，其中的含氮有机物分解放出氨，氨与硫酸化合生成硫酸铵。在消化时常加入硫酸铜和硫酸钾作催化剂，以加速分解速度并提高消化的温度。消化完毕，加入强碱使消化液中的硫酸铵分解，放出氨。利用蒸汽蒸馏法，用硼酸溶液吸收蒸馏出来的氨，氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成离子，使吸收液中的氨离子浓度下降，然后用标准酸溶液滴定，使吸收液中的氢离子恢复到原先的浓度，即可从消耗的酸量，计算样品中的含氮量。样品消化，蒸馏的化学反应可归纳如下[16]：

(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O

实验三氨基酸的分离鉴定——纸层析法

此次试验运用纸层析法，其原理是用滤纸作为惰性支持物，层析溶剂由有机溶剂和水组成的物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：Rf=原点到层析中心的距离/原点到层析剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数[10]。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本试验利用纸层析法分离氨基酸[11]。

三、材料与试剂：

实验一

实验样品：实验样品为奶粉。

实验二

仪器药品：

凯氏蒸馏器、凯氏烧瓶、消化架、三角烧瓶、滴定管、移液管、量筒

烧杯、天平、2%硼酸、浓硫酸、催化剂：硫酸铜和硫酸钾按3∶1混合，研细。混合指示剂：0.1%溴甲酚绿酒精溶液10ml，0.1%甲基红酒精溶液2ml，混合即得，贮于棕色瓶内。

器材：

层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸

实验三

试剂：

1、扩展剂：将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层备用[13]。

2、氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸，脯氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，亮甘酸溶液

及他们的混合液

3、显色剂：50-100毫升0.1%水和茚三酮正丁醇溶液

四、实验方法：

实验一

测定时，精确称取奶粉2~10g（视样品性质和水分含量而定），置于已干燥、冷却并称至恒重的有盖称量瓶中，移入95~105℃常压烘箱中，开盖2~4小时后取出，加盖置干燥内冷却0.5小时后称重[6]。再烘1小时左右，又冷却0.5小时后称重。重复此操作，直至前后两次质量差不超过2mg即算恒重[7]。

实验二

1．样品的消化

(1)在分析天平上准确称取生物制品干粉（40─60目过筛）100─500mg（视样品中含氮量而定）2份。

(2)取50ml凯氏烧瓶3只，将称好的样品分别送入第1、2只烧瓶底部，第3只烧瓶不加样品，作为空白对照，以测定试剂中的微量含氮化合物。于各个烧瓶中加入催化剂0.3g，浓硫酸5ml，然后将烧瓶置于通风橱消化架上，先用小火加热，待瓶内水分蒸完，硫酸开始放出SO2白烟，可加大火焰，使液体保持微沸状，直至溶液呈透明蓝绿色为止。在消化过程中，要经常转动烧瓶，使得瓶壁上的碳化颗粒，为浓硫酸回流至瓶底，使消化完全。为了缩短消化时间，当溶液变为浅棕色时，可加3─4滴30%过氧化氢。消化完毕，冷却，待蒸馏。

2．氨的蒸馏

(1)蒸馏装置的洗涤：先用自来水将凯氏定氮仪清洗干净，按图1装置好。在蒸汽发生瓶中（烧瓶1）加入约2/3体积的蒸馏水，加入浓硫酸数滴（在酸性情况下，水中氨不会蒸馏出来）及沸石（或毛细管数根）使沸腾均匀，关闭活塞A和B，将烧瓶1中的水煮沸，使蒸汽充分洗涤仪器，并检查装置的各个部分有无漏气现象，然后打开活塞B，让蒸汽洗涤漏斗约5分钟，再将活塞B关闭，继续蒸馏约5分钟，使全部蒸馏器洗涤干净。先移去三角烧瓶，再移去煤气灯，略等数秒钟，此时烧瓶1内气压下降，积聚在蒸馏瓶3内的水，被吸到管2内，开启活塞A，废液即从管2底部放出。以后每个样品蒸馏完毕，都需进行上述的洗涤过程2─3次。

(2)消化液的蒸馏：先打开活塞A和B，再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及2滴混合指示剂的三角烧瓶，放在冷凝管下端，使管口浸入液面下。

取蒸馏水1ml加到凯氏烧瓶中，使与消化液混合，小心地将此溶液从漏斗倒入蒸馏瓶3中，再用少量蒸馏水洗涤克氏烧瓶，洗液也从漏斗倒入蒸馏瓶3中，如此洗涤3次。然后从漏斗加入30%NaOH7ml，用蒸馏水少许洗涤漏斗2次，每次放液时都应控制活塞B，保留少许蒸馏水于漏斗内，密封之以防逸出氨气。关闭活塞A和B，立即将烧瓶1加热沸腾，开始蒸馏。三角烧瓶中的液体由棕紫色变为蓝绿色，再继续蒸3分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约

1cm，继续蒸馏1分钟。用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端，洗涤液直接流入三角烧瓶中，然后移去三角烧瓶，再移煤气灯，使蒸馏瓶3中的废液吸到管2中，开启活塞A放出废液。然后按上述步骤洗涤蒸馏器备用。

3. 滴定

蒸馏完毕后，将三角烧瓶内的溶液，用0.01mol/L盐酸滴定，使溶液从蓝绿色变为淡紫色，即为终点。分别记下样品和空白所消耗的0.01mol/L盐酸ml数，分别以V s和V0表示之[8]。

实验三

1、取层析纸一张。在纸的一端距边缘2厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1-1.5厘米作一记号。

2、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，干后再点一次。每点在纸上的扩散直径最大不超过3毫米。

3、扩展用线将滤纸缝成筒状，只得两边不能接触。将盛有扩展剂的培养皿迅速的置于密封的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米）到溶剂上升15-20厘米时即取出滤纸，用铅笔描绘出溶剂前沿线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

4、显色用喷雾器均匀的喷上0.1%的茚三酮正丁醇溶液；然后置于烘干箱烘干5分钟就可显现出各个层析斑点

五、数据处理：

实验一

测定结果按下式计算[9]：

水分（%）=m1?m2

m1?m3=30.7495?30.6616

30.7495?27.5786

=0.02772×100%=2.77%

式中m1----------干燥前奶粉于称量瓶质量，30.7495g m2---------干燥后奶粉与称量瓶质量，30.6616g

m 3--------- 称量瓶质量，27.5786g

实验二

按下式计算样品中的蛋白质含量[14]：

蛋白质含量（%）=(V s?V0)×C×14×6.25

W

×100%

=(9.50?0.90)×0.01×14×6.25

65

×100%=11.58%

式中V s为滴定样品用去的盐酸体积，0.90mml。

V0为滴定空白用去的盐酸体积，9.5ml。

C为标准盐酸的摩尔浓度，0.01(mol/L)。

14为氮的原子量。

W为样品重量，65mg。

6.25为氮－蛋白质转换系数的平均值。材料不同转换系数也不同。实验三

计算分析：

1、断混合氨基酸中的单组分。

从下向上依次为：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。

2、计算各种氨基酸的R f值（各种单组分、混合氨基酸液）。

六、结果与讨论：

实验一

通过实验数据处理后可知，奶粉样品中的含水量为2.77%，而一般安全水分为14%。测定奶粉样品含水量在安全水分之内，此奶粉制品水分认为合格。经讨论，奶粉中含水量如果过高直接会影响奶粉制品的物理状态、味道、口感和保质期，所以奶粉制品必须严格控制其含水量[17]。

实验二

通过凯氏定氮法测量蛋白质含量从实验数据可知，样品蛋白质含量在11.58%,但此法灵敏度较低，况且实验过程中会出现各种误差，误差范围大概为2%，将氮转化为氨，再用酸吸收后测定，实验比较耗时。所以此种检验方法适用于实验室基本测量不适用于精确测量[15]。

实验三

纸层析法分离鉴定氨基酸，从显色剂喷淋烘干后的滤纸清晰看见单组分氨基酸的层析斑点，黄色的斑点是脯氨酸，其余氨基酸均为粉红色斑点。而混合液层析呈现多个纵向排列的斑点，脯氨酸的黄色斑点在混合液中可明显辨认出，其余氨基酸通过计算比较R f值可以分辨出混合液中氨基酸的种类。从滤纸显色结果讨论，由于点样量控制不好，导致混合液中分离后缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的斑点粘连，不清晰也不独立。分离效果不是很好，但可知混合样中存在以上三种氨基酸。

七、结束语：

通过本次生物制品检验技术实验，不仅锻炼了自己的实际动手能力和检测技能，并加深了对理论知识的掌握。更加全面地掌握了直接干燥法测定水分、凯氏定氮法测定蛋白质含量、纸层析法氨基酸的分离鉴定流程与实际操作过程，深切体会到了实验过程中的注意事项和控制条件，进一步了解了生物制品检验技术在生活中的实际应用与生产中的重大意义。

参考文献：

[1]章金刚,倪道明.生物制品的现状与展望[J] 中国输血杂志, 2006, (05) .

[2]刘文军.生物制品专刊序言[J]生物工程学报, 2011, (05)

[3]廖忠东.生物制品的种类及特点[J]. 中国家禽, 2003, (19)

[4]陈玉琴.我国生物制品的现状与发展策略[J]. 中国药事, 2000, (01)

[5]中国生物制品标准化委员会办公室.2000.国外生物制品管理和标准

[6]Lansky D.Validation of Bioassays for Quality Control. Dev Biol Stand,1999,

[7]ICH Q2A.Test on Validation of Analytical Procedures

[8]王军志,生物技术药物研究开发和质量控制.北京科学出版社,2002，

[9] 张庆新主编，产品质量抽样检验手册。北京中国标准出版社，1994

[10] 杨玉萍.“氨基酸纸层析分离方法”实验教学设计[J]. 新乡学院学报(自然科学版). 2010(03)

[11] 尉向海.食品中水分及其测定方法的规范化探讨[J].中外医疗. 2009(02)

[12] 张庆新主编，产品质量抽样检验手册。北京中国标准出版社，1994

[13] 姚军. 两种测定食品水分方法的比较研究[J]. 食品研究与开发. 1999(02)

[14] 钟广蓉,时国庆,王海鸥,尹春华,邱丽娜. “氨基酸的分离与分析”实验教学设计[J]. 中国电力教育. 2009(16)

[15] 喻小燕,陈锋菊.差异蛋白质组学的分离鉴定技术[J]. 科技信息(学术研究). 2008(34)

[16]李宁,吴松锋,朱云平,杨晓明.鸟枪法蛋白质鉴定质量控制方法研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展. 2009(06)

[17] 宋占侠主编，企业质量检验工作指南。沈阳：辽宁人民出版社，1996