高效液相色谱和气相色谱的异同点

高效液相色谱和气相色谱的异同点

不同点：

一、流动相不同：HPLC为液体流动相，GC为永久性气体作流动相（通常叫做载气）

二、进样器不同：高效液相为平头进样针，气相色谱为尖头进样针

三、色谱柱长不同：

（1）气相色谱柱通常几米到几十米

（气相色谱由于载气的相对分析量较低，分子间隙大，故粘度低，流动性好，组

分在气相中流动速度快，因此可以增加柱长，以提高柱效）。

（2）液相色谱柱通常为几十到几百毫米

四、分析种类有差异：

气相色谱分析的对象多为（不适绝对）：分子质量小于1000，低沸点，易挥发，热稳定性好的化合物。

液相色谱：更适用于分析高沸点，难挥发，热稳定性差，分子质量较大（1000 - -2000）的液体化合物。

五：样品柱前变化不同：气相色谱的样品在柱前必须变为气体（气化室汽化），

而液相色谱的样品在柱前则无变化。

六、所用检测器有差异：

液相主要为：紫外检测器，荧光检测器、示差折光检测器.....

气相色谱主要为：氢火焰离子化检测器（FID）,热导检测器（TCD）,电子捕获检测器（ECD）,火焰光度检测器（FPD）,氮磷检测器（NPD）.....

相同点：基本原理相同。

都是利用物质在流动相和固定相中的分配系数的差别，从而在两相间反复多次（1000-1000000次，甚至更多）的分配，使原来分配系数差别很小的各组分分

离开来。

?Owen发现异卵双生牛的天然免疫耐受现象(1945)，明确自身识别问题，伯耐特(Burnet，1949)提出免疫耐受理论，梅德华(Medawar，1953)实验证实胚胎期耐受理论。耶那(Jerne，1955)提出天然抗体选择学说，完成

免疫网络学说(1974)，伯耐特等(Burnet & Talmage, 1957)完善克隆选择学说等

免疫防御(immunologic 抗感染

defense)

免疫稳定(immunologic 消除炎症或衰老细胞

homeostasis)

免疫监视(immunologic 控制癌变细胞

surveilance)

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称

为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较

大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液

施加高压。一般可达150～3.5万KPa。

2. 高速：流动相在柱的流速较经典色

谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相

色谱法少得多，一般少于 1h 。

3. 高效：近来研究出许多新型固定

相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采

用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析

的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达

10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5.适应围宽：气相色谱法与高效液相

色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能

力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便

等优点，但是受技术条件的限制，沸点太

高的物质或热稳定性差的物质都难于应用

气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，

因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总

数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效

液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约

占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分

为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、

反相高效液相色谱、高效离子交换液相色

谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相

色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱

分离或分析各种化合物的原理基本上与相

对应的普通液相层析的原理相似。其不同

之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率

高、重复性好，且须在色谱仪中进行。

编辑本段主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱

法可分为下述几种主要类型：

1 ．液—液分配色谱法

(Liquid-liquid Partition

Chromatography)及化学键合相色谱

(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与

固定相之间应互不相溶（极性不同，避免

固定液流失），有一个明显的分界面。当

试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography):

流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但

固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相

通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定

液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在

应用很广泛（70~80%）。

2 ．液—固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂（如

硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作

用的不同来进行分离的。其作用机制是：

当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞

争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中

心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K 越大，保留值越大。]

3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC 是基于离子交换树脂上可电离的离子与流

动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆

交换，依据这些离子以交换剂具有不同的

亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可

表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+

X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX

[-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都

可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合

物，从而控制溶质离子的保留行为。其原

理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相

式中：X+水相--流动相中待分离的有

机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁

基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。

当达平衡时：

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论：DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如

酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一

些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药

物等分离。

5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶

液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导

检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分

在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交

换色谱法相同。

以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离

子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，

发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应

的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了

电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸

H+Br-，可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最

佳方法。也可用于阳离子分析。

6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的

孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到

数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互

作用力的不同来进行分离，而是按分子大

小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和

溶质的流动力学体积或分子大小有关。试

样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间

隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的

分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直

接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些

很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗

粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在

色谱图上最后出现。

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处

理系统，下面将分别叙述其各自的组成与

特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样

间完成进样操作，进样量是恒定的。这对

提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和

梯度仪三部分。高压泵的一般压强为

l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在

柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动

速度，这对提高分辨率、回收样品、保持

样品的生物活性等都是有利的。流动相贮

存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样

品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有

一个基团的差别或是同分异构体）都能获

得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），

径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃

管或钛合金等材料制成，住装有直径为5～10μｍ粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的

树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶

表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加

之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固

定相的制备一样），或者用化学法偶联各

种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯

基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配

体的有机化合物。因此，这类固定相对结

构不同的物质有良好的选择性。例如，在

多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离

出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达

到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效

应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区

传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨

率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒

度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温

度从室温调到60C，通过改善传质速度，

缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面

广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、

多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检

测下限为10-10g/ml）；线性围宽；对温

度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗

脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，

糖类化合物的检测大多使用此检测系统。

这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度

低（检测下限为10-7g/ml），流动相的变

化会引起折光率的变化，因此，它既不适

用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品

的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，

其发射光的荧光强度与物质的浓度成正

比。因此，这一检测器只适用于具有荧光

的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺

类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其

灵敏度很高（检测下限为10-12～

10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脱作品的

检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

编辑本段操作注意要点

1)．首先对流动相进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为有机系和水系，常用的孔径为0.20um和0.45um。

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气

10-20分钟。

3)．正常情况下，仪器首先用甲醇冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相(如流动相为缓冲试剂，则要二次重蒸水冲洗10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净

为止) 。

4)．一般情况下，流动相冲洗20-30分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器

基线走后，方可进样测试。

5)．同时进两针标样，将其结果相比较，其结果的比值在0.98-1.02之间后，就可以正式进行样品的测试了。

6)．样品测试结束后，就要进行色谱仪及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓

冲试剂，同样也要用重蒸水清洗10-20分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损

色谱柱。

7)．关机时，先关计算机，再关液相

色谱。

8)．填写登记本，由负责人签字。

编辑本段注意事项

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M 的去离子水。脱气后的流动相要小心振动

尽量不引起气泡。

2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)．压力不能太大，最好不要超过

150kgf/cm2 .

5). 因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结

晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变

流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清

洗。