DNA甲基化的总结

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。

甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不

同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA

甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。

?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录

因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜

ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化

相关蛋白的作用有关，甲基化ＣｐＧ结合蛋白可以占据转录因子的结合位点，从而抑制基因的表达

未甲基化的CpG岛通常是转录因子Spl的结合位点，而CpG甲基化可导致基因转录被抑制。基因的上游启动子区域通常被认为是CpG密集的区域。然而，我们对不同内含子中CpG岛的出现情况进行分析，结果发现56．01％的第一内含子序列至少具有一个CpG岛，而其它内含子中，具有CpG岛的序列比例只有14．07％，远远低于第一内含子。对不同位置内含子(即第一内含子，第二内含子等)

中的CpG岛进行统计发现，其它任何位置具有CpG岛的内含子比例也均低于第一内含子(图1)。例如，22．3％的基因第二内含子中含有CpG岛，第三内含子中有CpG岛的比例为17．58％。这再次表明相对于其它内含子，小鼠基因的第一内含子中CpG岛最密集。这个现象说明基因第一内含子中很可能含有与Spl相关的转录调控元件

死亡相关蛋白激酶(death—associated protein kinase，DAPK)是一种由钙调蛋白调节的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是细胞凋亡的正性调节因子之一【3 J。DAPK可被多种因子激活，如INF．1、Fas、TNF—B、Ceramide(神经酰胺)、ERK、C—myc 和E2F等，提示它可能是各种细胞凋亡诱导信号的一个汇合点HJ。DAPK基因启动子的甲基化是目前肿瘤研究的热点之一，现已发现人类多种肿瘤组织中DAPK 基因表达缺失与其基因甲基化有关∞剖。另一方面，有实验表明，肿瘤患者血浆DNA水平明显高于正常人，肿瘤患者外周血中游离DNA带有恶性细胞DNA的生物学特性，。DNA甲基化主要是由DNA甲基转移酶催化，S一腺苷蛋氨酸提供甲基给胞嘧啶，形成5．甲基胞嘧啶。5一甲基胞嘧啶是真核细胞中唯一存在的天然修饰方式，占3％一4％。启动子区富含CpG序列，故易发生甲基化

由于在经典形式(如mPerl、mCryl、mDBP和mMKPl中)和非经典形式(如mPer2中)的E—box中常常包含DNA甲基化潜在靶点——CpG双核苷酸，因此有研究推测E—box的甲基化极可能参与分子水平的节律性表达一J。此外大多数E—box都位于CpG岛中，附近其他CpG岛序列的甲基化亦可能调节E—box的节律性功能活动。在肿瘤组织和细胞系中发现一些E—box和CpG岛在发育过程中被甲基化¨州3|。本实验组前期实验¨41结果也表明mPerl的E—box3和E—box4发生明显甲基化。

甲基化CpG结合域蛋白1(methyl-CpGbinding domain protein 1，MBDl)是一个重要的转录调控因子，它可通过调控DNA甲基化，进而控制肿瘤甲基化相关基因的表达

，而DNA异常甲基化可干扰基因的转录过程，引起抑癌基因的失活，导致肿瘤的发生雎]。甲基化CpG结合域蛋白MBDl是一个重要的转录调控因子，它可通过结合DNA甲基化位点，调控基因的甲基化，进而控制甲基化相关基因的转录表达，已发现MBDl在多种恶性肿瘤组织和细胞系中均存在高表达【6]

在DNA甲基化过程中，胞嘧啶从DNA双螺旋突出进入与酶结合部位的裂隙，通过甲基转移酶，把活性甲基从S．腺苷甲硫氨酸转移至5．胞嘧啶位上，形成5．甲基胞嘧啶。DNA甲基转移酶分两种：一种是维持DNA甲基转移酶(maintenance DNA methyltransferase)，即DNMTI，主要在模板链的指导下使复制后处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，这样就获得与亲本DNA完全相同的甲基化形式，从而构成了表遗传信息在细胞和个体世代间的传递机制；另一种是重新DNA甲基转移酶(de novo DNA methyltransferase)，即DNMT3a和DNMT3b，它们可在未甲基化的DNA双链上进行甲基化，不需要母链的指导，主要负责发育所需的重新甲基化以及异常甲基化的形成。然而在某些情况下，DNMTl和DNMT3也可以分别发挥重新甲基化和维持甲基化的作用[6]。DNA甲基化对哺乳动物的正常发育至关重要，通过基因敲除证明DNMTl和DNMT3b对于胚胎发育是必需的，而缺乏DNMT3a的小鼠将在出生后几周内死亡[7，8]。甲基化有许多重要的生物学意义，它通常被看作转录抑制的标志，并得到了大多数人的认可。抑制转录的机制可能有3种[9]：(1)

南京医科大学博士学位论文DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合，减低了序列特异的转录因子结合的亲和·忙k[10，1 1]。甲基基团不影响碱基配对但可影响蛋白伸入DNA大沟中与DNA相互作用。(2)甲基化转录抑制是通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物(repressor)而起作用。目前发现这一类甲基．CpG．结合蛋白主要有MeCP2、MeCPl／MBDl、MBD2、MBD4等[12．14】。它们能与特定DNA序列

中甲基化的胞嘧啶结合，从而阻断转录因子与基因调控序列的结合。(3)DNA甲基化后可通过甲基一CpG．结合蛋白募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)形成复合物，使组蛋白去乙酰化，导致染色质结构聚集，从而抑制基因的转录[15]。正常情况下，哺乳动物DNA甲基化状态受到严密的调控，如女性的一条X染色体因高度甲基化而失活；持续的低甲基化状态使看家基因一直处于活性转录状态；在生物发育的某一阶段或细胞分化的某种状态下，原先处于甲基化状态的基因可被诱导去除甲基化而出现转录活性。

DNMT抑制剂：如5．氮杂脱氧胞苷(5-aza．dC，地西他滨)等，可使抑癌基因CpG岛高甲基化得到解除，从而重新激活抑癌基因，起到治疗作用。目前已在白血病、骨髓增生异常综合征、非小细胞肺癌等肿瘤中取得了很好的疗效[53]。(2)HDAC抑制剂：如曲古抑菌素A、苯丁酸盐等。对肿瘤细胞的选择性大于对正常细胞的选择性、副作用少，是HDAC抑制剂优于其他药物的重要特点。HDAC抑制剂能抑制组蛋白去乙酰化，改变参与细胞存活和分化的蛋白水平，如增加抑癌基因的表达和减少抗凋亡基因的表达，从而抑制体外或动物模型中瘤细胞的增殖，或诱发瘤细胞的分化和凋亡。(3)靶向诱导DNA甲基化：对于低甲基化高表达的肿瘤相关基因，则可以诱导其启动子甲基化，使该基因沉默。靶向诱导DNA甲基化，是针对某基因启动子或其附近的区域设计一段甲基化的寡核苷酸链(MON)，使其与靶基因中一条DNA链的特定位点结合，形成半甲基化的中间体，该中间体成为DNMTl的底物，使DNA另一条链也发生甲基化，从而使靶基因的特定位点完全甲基化。实验证明，运用这一原理设计的针对IGF2与GSTPl基因启动子区域的甲基化寡核苷酸链，能有效地诱导基因启动子

甲基化，而减少基因的表达[54，55]。(4)应用RNA干扰技术：用双链RNA或小片段干扰RNA(siRNA)转染细胞，含有启动子序列的RNA能降解同源的mRNA，或指导同源的DNA启动子甲基化，导致基因沉默；也可选择性地耗竭DNMT的mR_NA，降低DNMT的活性，恢复沉默基因的表达。

目前认为OPQ 甲基化后抑制基因转录导致基因失活的机制可能在以下几个方面：!基因启动子甲基化后可直接阻止转录因子与启动子结合；"甲基化结合蛋白与甲基化的OPQ 特异结合后会与转录因子竞争结合OPQ 的结合位点，或使染色体高度聚集，不适于转录；#间接通过组蛋白去乙酰基酶（SOQH-）作用发生组蛋白去乙酰化，去乙酰化后的组蛋白与OPQ 结合能力增强，转录因子不易进入启动子区域而抑制转录。

：基因转录的表达抑制是以H,L 岛甲基化的积累剂量为依赖的［F］，有学者认为，H,L 岛甲基化只有达到一定比例（ D ;?N）时，才足以完全抑制基因表达，而低比例的甲基化只能降低基因的转录表达［9］。与遗传引起的变化不同，表观遗传导致的改变是潜在可逆的。H.(* 等［G?］采用去甲基化因子@"$T$#10)%)*’处理具有!" #$%&’()* 甲基化阳性的细胞后，细胞恢复了!" #$%&’()* 的/UPQ 功能和蛋白表达，这对于研究开发去甲基化药物治疗肿瘤具有重要意义。由此可见，研究肺癌!" #$%&’()* 基因启动子H,L 岛甲基化与蛋白表达的关系具有深远的临床意义。

甲基化抑制基因转录的机制

甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。

对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较高时，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1（methylCpG-binding protein1）结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。

DNA甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。随着个体发育，当需要某些基因保持"沉默"时，它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则去甲基化。

I．DNA甲基化抑制基因转录的直接机制

某些转录因子的结合位点内含有CpG序列，甲基化以后直接影响了蛋白质因子的结合活性，不能起始基因转录。

II.甲基化抑制转录的间接机制

CpG甲基化，通过改变染色质的构象或者通过与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合。

与不含甲基化的染色质相比，甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，说明甲基化与非甲基化DNA在构象上有差异。已经分离纯化了数个与甲基化DNA特异结合的蛋白质。MeCP1可以与至少12个对称的甲基化CpG结合，而MeCP2仅同单个甲基化的CpG序列结合。

DNA甲基化、组蛋白去乙酰化与基因表达抑制

2010-05-20 02:47:52 来源：易生物实验浏览次数：1176 网友评论0 条

DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表遗传的修饰方式。

关键词：乙酰基因表遗传DNA甲基化组蛋白去乙酰化甲基化DNA结合蛋白DNA甲基转移酶

DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA m ethyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表遗传的修饰方式。一些抑癌基因由于启动子的甲基化而使该基因表达失活从而导致肿瘤发生的理论已经被广泛认可［1］。已有研究发现，选择性地结合于甲基化DNA 的特异性的转录抑制子MeC P2（methyl-CpG binding protein 2），即甲基化CpG 结合蛋白（methyl-CpG binding prot

eins），与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）在细胞中共存于一个复合物中［2］。因而有理由认为DNA 甲基化调节基因表达与组蛋白去乙酰化之间有密切的关系。

1 甲基化CpG 结合蛋白、DNMTs 与HDAC

1. 1 甲基化CpG 结合蛋白与HDAC 甲基化CpG 结合蛋白是一组序列特异性的DNA 结合蛋白［3］，其靶序列仅仅由2 个碱基组成：5-甲基化胞嘧啶及紧跟其后的鸟嘌呤（5mCp G）。目前已知在哺乳动物中有5 种甲基化DNA 结合蛋白（图1），其中4 种是MeCP2、M BD1、MBD2、MBD4，它们通过一种保守的蛋白质基序即甲基化DNA 结合结构域（methylat ed DNA-binding domain，MBD）而结合5mCpG［4］。MeCP2 是最早发现的甲基化DNA 结合蛋白。1998 年Nan 等［2］在研究中发现，MeCP2 能募集（recruit）HDAC。这一发现有机地把DNA 甲基化和组蛋白去乙酰化的功能联系起来。MeCP2 含有2 个结构域，1 个是甲基化DNA 结合结构域，另一个是转录抑制结构域（transcriptional - repression dom ain，TRD）。MeCP2 以甲基化依赖的方式结合到染色质上，通过TRD 与桥蛋白Sin3A 和HDAC 的共同抑制复合体紧密联系。该复合体包含有至少7 种蛋白，其中有转录抑制子Sin3 A，HDAC1 和HDAC2 等［2］，Sin3A 是一种基因转录抑制因子，它的参与可引起基因失活。该复合体将DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化联系起来。MBD1、2、4 主要在MBD 基序上与MeCP2 有同源性，具有优先结合甲基化CpG 的能力。MBD1 在体外主要优先结合高密度的甲基化DNA，在转染的细胞中，它通过HDAC 依赖的方式抑制转录［5］。与这4 种蛋白相似，MBD3 也包含有高度保守的MBD 基序。尽管它与MBD2 蛋白有大于70% 的氨基酸相似性，却没有特异性结合甲基化DNA 的能力［6］。

目前已知MBD3 是转录抑制复合体Mi2 / NuRD（nucleosome - remodelling histione dea cetylase）的组成成分。Mi2 / NuRD 同时具有染色体重构和组蛋白去乙酰化的活性，通过M BD3-MBD2 间的相互作用而聚集到甲基化区域并发挥作用［7］。第5 种是Kaiso，它不具备MBD 基序，通过锌指基序结合甲基化的DNA（主要是CGCG），从而发挥作用［8］。在这5 种甲基化CpG 结合蛋白中，MBD1、MBD2、MeCP2 和Kaiso 具有转录抑制子的功能，并且这种抑制作用绝大部分是通过与HDAC 复合体的相互作用而实现的［8］，提示甲基

化抑制基因转录有赖于抑制性的染色质环境。与其他MBD 家族成员不同的是，MBD4 并不具有抑制基因转录的功能，具有G/ T 错配糖基化酶的活性和5-甲基化胞嘧啶DNA 糖基化酶的活性［9］，因而起着DNA 修复的作用［10］。MBDs 是DNA 甲基化模式与组蛋白修饰之间的桥梁，在肿瘤发生的表遗传通路上起重要的作用［11］。

图1 哺乳动物中的甲基化CpG 结合蛋白上排方框是包含MBD 结构的蛋白，下排方框的Kaiso 通过锌指结构结合DNA。蛋白质按功能分类：结合甲基化CpG 的转录抑制子有MBD1、MBD2、MeCP2 和Kaiso；MBD3 是Mi / NuRD 共同抑制子复合物的非DNA 结合

成分；MBD4 是G - T 错配糖基化酶

1. 2 DNMTs 与HDAC DNMTs 是DNA 甲基化反应的催化剂，在染色质重构和基因表达调控中起关键作用［12］。DNMTs 的结构主要由3 部分组成，即N 端调节结构域、C 端催化结构域和中间的连接部分［12］。目前，在真核生物中发现双链DNA［14］；DNMT3 主要是参与DNA 的从头甲基化（de novo methylation），即催化非甲基化的DNA 成为甲基化的DNA 状态［15］；DNMT2 具有催化区域，可与DNA 上的特异位点结合，但它没有完整的调节区域，因而不具备甲基转移酶活性。DNMT1 和甲基化CpG 结合蛋白之间的物理联系已经报道。DNMT1 能与MBD2 和MBD3 免疫共沉淀成为1 个潜在的复合体。MBD2 和MB D3 是大分子MeCP1 抑制子复合体的成分。该复合体在体外能优先结合、重建和去乙酰化含

有甲基化DNA 的核小体［16］。DNMT1 还能直接与HDAC1 / 2 相互作用［17］。MBD2-MBD3 复合体以去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素TSA 敏感的方式在半甲基化和完全甲基化的D NA 以及抑制的转录中显示了结合亲和力。因而，这些结果提示存在最大的“all-in-one”型转录抑制复合体的可能性。也就是说，由1 个DNA 修饰单位（DNMT）、1 个甲基化胞嘧啶识别单位（甲基化CpG 结合蛋白）和1 个组蛋白修饰单位（HDAC）共同组成了1 个“all in on e”型的转录抑制复合体，并且该复合体通过3 个亚单位间的相互作用，在指引DNMT1 募集到DNA 复制后半甲基化的序列、在S 期使基因表达沉默、或者使新组装的组蛋白去乙酰化等方面起重要作用［13］。