细胞冻存与复苏

一，步骤

（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,终止培养，用PBS洗培养物一次。用胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管或者合适的EP管中离心(1400r/min，5分钟)。

（2）去上清液，加入含10%小牛血清的完全培养基0.75ml和0.15ml的FBS 重悬，之后取10ul计数。之前4℃预冷DMSO 10分钟后，逐滴加入已无菌的0.1ml DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为5×105/mL 之间。

（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷存管（封上封口膜，防止水进入，污染）置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

二，注意事项

1对于两毫升的离心液可以用EP管分开离心，这样可以利于操作并且减少污染的几率。

2取枪头时应注意动作幅度和技巧。

3DMSO有毒。用之前要预温。

4试剂要分装。

1，取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

2，取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

3，解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

4，若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。具体原理如下： 1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。 2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤： 1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。 2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。

3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。 4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。 5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。通过控制好冷冻和复苏的操作步骤，加入适当的保护剂，可以有效降低细胞损伤，保证细胞的存活率和生活特性。细胞冻存与复苏技术的应用，对于细胞学研究和细胞工程等领域都具有很大的意义。

细胞的冻存与复苏

细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。（二）方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消

化。 3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。（三）注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。二、细胞的复苏（一）仪器、用品与试剂 37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。

细胞冻存与复苏-注意事项

细胞冻存与复苏-注意事项方法：冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞： 1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次 2胰酶消化 3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止 4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤注意事项： 1.错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。 1.细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。 1.盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。 1.单薄的冻存盒：

放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！） 1.-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。 1.液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。 1.取错细胞：找不到/拿错冻存管。解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。二、细胞复苏：方法： 1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3.离心，1000rpm，5min； 4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶， 37℃培养箱静置培养； 5.次日更换一次培养液，继续培养。注意事项： 1.取错细胞：

细胞冻存、复苏和传代

细胞冻存 1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时冻存为佳。 2.准备：胰酶、培养基、PBS、胎牛血清、DMSO、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。 3.弃细胞瓶中培养基。1ml PBS洗一次，弃PBS。加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。 4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。 5.1200rpm下室温离心5分钟。在此期间，将胎牛血清滤菌处理后，按DMSO:FBS=1:9的比例配置冻存液。 6.离心后弃上清，加入1ml冻存液。细胞重悬后加入冻存管，冻存管置入冻存盒，置于- 80℃下保存。细胞复苏 1.水浴锅预热至37℃。-80℃冰箱中取出冻存细胞，37℃水浴下快速融化（1分钟左右为宜）。 2.准备：培养基、1ml灭菌枪头、25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。 3.吸取细胞悬液至15ml离心管中。1200rpm下室温离心5分钟。期间，新的25T细胞瓶中加入4ml培养基。 4.弃上清，尽量吸干净，加入1ml培养基重悬，直接加入至25T细胞瓶，晃匀后送入培养箱进行培养。细胞传代 1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时传代为佳。 2.准备：胰酶、培养基、PBS、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。 3.弃细胞瓶中培养基。1ml PBS洗一次，弃PBS。加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。 4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。 5.1200rpm下室温离心5分钟。每25T细胞瓶加入4ml培养基，其余据面积依次换算。 6.离心后弃上清，加1ml培养基重悬，根据经验于25T细胞瓶（或六孔板）中加入适量重悬细胞液。晃匀，镜下观察是否混匀，送入培养箱进行培养。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。步骤： 1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。 2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。 3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。 4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。复苏： 1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。 2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。观察细胞的生长和形态变化。原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的

存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。注意事项： 1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。 2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。 3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。 4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。 5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。

细胞的冻存和复苏

背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。细胞冻存操作步骤： 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液，冰上预冷； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管； 3. 离心500rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，由慢至快，滴入配制好的冻存培养液，用吸管轻柔吹打使细胞均匀（在冰上进行）；一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1ml（若冻存多于1支，则每支要均匀分装）； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70℃冰箱中放3天左右，取出冻存管，移入液氮容器内。注意事项： 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。细胞复苏操作步骤： 1. 从液氮容器中取出冻存管，迅速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化； 2. 当最后一小块冰快融化时，将冻存管放在冰浴上。 3. 用吸管吸出细胞悬液，由慢至快滴入已经加10倍以上冻存液的培养皿中，轻轻混匀； 4. 第二天，换培养液或者3. 用吸管吸出细胞悬液，由慢至快滴入已经加10倍以上冻存液的离心管中，轻轻混匀；离心，500rpm，5min； 4. 弃去上清液，加培养液吹匀，转至培养皿。注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜

细胞冻存与复苏步骤

细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤 1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。确保细胞在保存前是健康和活跃的。 2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。 3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。 4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。 5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。 6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。二、细胞复苏步骤 1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。 2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。 3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。 4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。

5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。 6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。 1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。 2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。 3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。 4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。在未来，随着技术的不断完善和应用的广泛推广，我们可以更好地利用这项技术来促进科学的发展和社会的进步。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。在细胞传代培养过程中，注意以下几点： •选择合适的培养基和培养条件； •周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目； •保持细胞复合度和细胞同型性。冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。 ## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。推荐以下步骤： •用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致； •在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度； •更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。

如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。

冻存细胞复苏步骤

冻存细胞复苏步骤冻存细胞复苏是一种常用的细胞保存方法，它可以将细胞冷冻保存在极低温度下，以防止其失活或死亡。当需要使用这些冻存细胞时，我们需要进行复苏步骤，使其恢复到正常的生活状态。下面将介绍冻存细胞复苏的步骤。第一步：预备工作在进行细胞复苏之前，我们需要做一些预备工作。首先，准备好培养皿和培养基。培养皿应该是无菌的，以确保细胞复苏的成功。培养基应该是适合细胞生长的，可以提供必需的营养物质和生长因子。其次，准备好所需的实验器材和试剂。第二步：取出冻存细胞将冻存细胞保存管从液氮罐中取出，迅速将其放入37摄氏度的水浴中。在水浴中加热的过程中，可以轻轻摇晃管子，以加快冻存细胞的解冻速度。当冻存细胞完全解冻后，将其转移到无菌的培养皿中。第三步：培养细胞将解冻后的细胞转移到培养皿中后，加入预先准备好的培养基。培养基应该是预热的，温度应与细胞生长温度相适应。将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。同时，确保培养基中的氧

气和二氧化碳浓度适当。第四步：观察细胞生长在细胞复苏的过程中，我们需要定期观察细胞的生长情况。通过显微镜观察细胞的形态和数量变化，判断细胞是否成功复苏。如果细胞开始生长并形成典型的细胞群落，说明细胞复苏成功。第五步：细胞传代当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞传代，以维持细胞的正常生长和功能。细胞传代是将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，以减少细胞密度，防止细胞过度生长。传代的时机应该根据细胞的生长速度和培养皿的容量来确定。细胞复苏是一项关键的实验操作，它可以使冻存的细胞重新恢复到正常的生长状态。通过合理的操作步骤和严格的操作要求，可以提高细胞复苏的成功率。在进行细胞复苏时，我们需要注意操作的无菌性、培养基的配制和温度的控制等因素，以确保细胞复苏的顺利进行。同时，及时观察细胞的生长情况，并进行适当的细胞传代，可以保持细胞的正常生长和功能。冻存细胞复苏是一个复杂而重要的过程。只有严格按照操作步骤进行，并注意细节和细胞的特性，才能够成功复苏冻存的细胞。细胞复苏的成功不仅对于科研工作具有重要意义，也为细胞保存和应用提供了有效的手段。

细胞冻存与复苏的基本原则

细胞冻存与复苏的基本原则 1. 引言细胞冻存与复苏是一种重要的生物技术，它可以将活体细胞保存在极低温度下，并在需要时重新激活这些细胞。这项技术在医学、科学研究和生物工程等领域具有广泛的应用前景。本文将介绍细胞冻存与复苏的基本原则，包括冷冻过程、保护剂的选择、解冻过程以及相关实验技术。 2. 冷冻过程细胞冷冻是将活体细胞从正常生长温度（通常为37摄氏度）迅速降温到极低温度（通常为-196摄氏度）的过程。这个过程需要严格控制，以避免对细胞造成伤害。 2.1 温度控制在开始冷冻之前，必须确保液氮罐内的温度稳定在-196摄氏度。为了达到这个目标，可以使用液氮罐内置的温度计进行监测，并通过添加适量的液氮来保持温度稳定。 2.2 冷冻容器的选择为了保护细胞免受冷冻过程中的机械损伤，需要选择合适的冷冻容器。常见的冷冻容器有液氮罐、干燥冰和低温保存管等。其中，低温保存管是最常用的容器，因为它可以提供良好的细胞保护效果，并且方便存储和操作。 2.3 冷却速率控制快速降温是细胞冷冻过程中至关重要的一步。过快或过慢的降温速率都会对细胞造成损伤。通常情况下，推荐使用缓慢降温法，即将细胞置于预先调整好的液氮罐中，并逐渐将其浸入液氮中。

3. 保护剂的选择在细胞冷冻过程中，添加适量的保护剂可以减少细胞受到的损伤，并提高其存活率。常用的保护剂包括甘露醇、甘油和DMSO等。 3.1 甘露醇甘露醇是一种具有良好保护细胞功能的保护剂。它可以通过降低细胞内外渗透压的差异，减少细胞脱水和冰晶形成，从而保护细胞免受冷冻损伤。 3.2 甘油甘油是另一种常用的保护剂，与甘露醇类似，它也可以减少细胞脱水和冰晶形成。此外，甘油还具有良好的渗透性，可以迅速进入细胞内部，并提供额外的保护作用。 3.3 DMSO 二甲基亚砜（DMSO）是一种强效的保护剂。它可以通过改变细胞膜的流动性和稳定性来保护细胞，并防止冷冻过程中产生的机械损伤。 4. 解冻过程解冻是将经过冷冻保存的细胞重新恢复到正常生长状态的过程。正确的解冻方法对于维持细胞活力至关重要。 4.1 温度控制在解冻过程中，必须确保温度逐渐升高到37摄氏度。可以使用温水浴或恒温培养箱等设备来控制解冻温度。 4.2 解冻液的选择解冻液的选择也非常重要。一般来说，解冻液应包含适量的培养基和保护剂，以帮助细胞快速恢复生长状态。

动物细胞冻存和复苏的原则

动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面： 1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。 2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。 3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。 4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO

等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。 5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。 6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。 7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。记录的内容包括细胞种类、代数、冻存日期、复苏日期、冻存方法、复苏步骤等信息。这些信息对于后续的研究和管理都非常重要，有助于保证细胞的来源和可追溯性。总之，动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。在进行冻存和复苏过程中，应该遵循一定的原则和方法，确保细胞的存活率和稳定性。同时，建立完整的记录管理体系也有助于保证细胞的来源和可追溯性。

细胞冻存与复苏

细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法预先配制冻存液：20%血清培养基 10%DMSO （二甲基亚砜）取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！ 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。注意事项：

细胞的冻存及复苏

细胞的冻存与复苏背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70 C冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196 C,理论上储存时间是无限的。原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砚(DMSO )作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

（一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10〜90%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm , 5min ; 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5 x 106/ml 〜1 x 107/ml; 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1〜1.5 ml ; 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1〜-2C/ min ;当温度达-25C以下时，可增至-5C〜-10C/ min ;至IJ-100C时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20 C冰箱2h，然后放入-70C冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37 C温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37C水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm , 5min ; 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37 C培养箱静置培养 5. 次日更换一次培养液，继续培养。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备： ●细胞培养通风橱（即生物安全柜） ●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱） ●离心机 ●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项: ●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。 ●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。 ●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75% 酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。 ●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：

在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。 b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。 c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。 d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存： a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。 b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。 c)使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后，计算出冻存溶液的体积，从而保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。 d)约800-1000rpm下离心5-10分钟，无菌条件下小心弃去培养基，不要搅动细胞沉淀。 e)用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀，分装至冻存管中，做好标记后进行梯度降温至液氮环境中保存，入库。 *对于传统的细胞冻存，需要进行程序降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）冻存，为避免操作流程的繁琐不可控，可选用无血清非程序降温细胞冻存液，包括Cellregen无血清细胞冻存液和无血清低

细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项

培养细胞的冷冻保存与复苏 ⏹概述✧冻存过程 ⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果 ♦冷冻速率✧讨论 ♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏 ♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏 ♦冷冻保护剂✧主要材料 ⏹冷冻保存方法✧复苏过程 ♦非玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏 ✧冻存结果✧主要材料 ✧讨论✧复苏过程 ♦玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ⏹

Polge等人（1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于—790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956)、Rey(1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂.Lovelock(1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO）。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。返回页首冷冻保存与复苏原理在低于—700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰.如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤.如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因

细胞传代冻存复苏步骤

细胞传代冻存复苏步骤 1.细胞培养首先，需要从细胞库中取出要冻存的细胞，并将其接种在适当的培养基上。培养基应该包含适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的正常生长和分裂。 2.细胞生长将培养皿置于恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和气体环境。细胞需要在培养基中适当的时间内生长和扩增。通常，培养时间为2-3天，视细胞类型而定。 3.细胞检查在细胞生长期间，必须定期对细胞进行检查，以确保其健康和无污染。细胞检查可通过显微镜观察细胞形态和活力，或通过细胞培养基中的染料检测细胞活性。 4.细胞分离一旦细胞达到所需的数量，即可进行细胞分离。使用适当的胰蛋白酶或其他消化酶来分离细胞。细胞分离后，将其转移至新的培养皿中。 5.细胞计数使用血细胞计数板或其他形式的计数器来计数细胞数目。细胞计数是决定细胞数量和密度的重要步骤，以确保在冻存过程中使用适当的细胞浓度。 6.冻存液制备

冻存液是保护细胞冻存过程中的关键溶液。常见的冻存液成分包括培养基和甘油、DMSO（二甲基亚砜）等保护剂。这些成分具有保护细胞免受冻结和解冻过程中的损伤的作用。 7.细胞冻存将细胞和冻存液混合在一起，使用冷冻管或冻存管将其分装。然后将冻存管放入冷冻容器中，使其逐渐冷却至极低温（通常为-80℃或液氮温度）。 8.细胞解冻在需要复苏细胞时，从冷冻容器中取出冻存管，快速解冻至37℃。解冻时应非常小心，以免损伤或破坏细胞。可选择将冻存管置于37℃水浴中解冻，或使用预先加热的介质进行解冻。 9.细胞复苏一旦细胞完全解冻，将其迅速转移到预先准备好的培养皿中。加入适量的培养基和生长因子，为细胞提供所需的营养和环境条件。将培养皿放入恒温培养箱中，并维持适当的生长条件。 10.细胞生长观察在细胞复苏后，定期观察细胞的生长和活性。使用显微镜观察细胞形态和增殖情况，确保细胞正常生长。如果发现任何细胞死亡或异常现象，可能需要采取相应的措施来解决。 11.细胞传代一旦细胞复苏并正常生长，可以进行细胞传代以扩增细胞数量。细胞传代是将细胞分离并移植到新的培养皿中，以保持细胞的健康和生长。