细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存
（一）仪器、用品与试剂
细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法
1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消
化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项
1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。
4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。
二、细胞的复苏
（一）仪器、用品与试剂
37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。
（二）方法
1、准备工作：开启恒温水浴锅，将温度调节在37℃，取一离心管，加入10ml细胞培养基。
2、从液氮罐中小心取出冻存管，立即放入水浴锅中快速摇晃让冻存液融化。
3、用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。
4、打开冻存管，将冻存液小心转移到预先加入有培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。
5、小心弃掉上清，加入5ml左右培养基重悬细胞。
6、将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。（三）注意事项
1、冻存液融化要迅速，但不宜完全融化后再洗涤，应在水浴时保留一小块冰块。
2、洗涤的次数可适当增加，以尽可能除去冻存液成分的残留。
3、若是复苏冻存在安瓶中的细胞，应格外小心，防止玻璃瓶爆炸伤害机体。
4、离心速度不宜太高，避免对细胞的损伤。
动物细胞培养中细胞的冻存与细胞复苏
动物细胞培养中细胞的冻存与细胞复苏 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于一196~C液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)， 可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。 材料：冻存管，离心管，细胞培养用材料，500 mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75%酒精棉。 药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0.25%胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜(DMSO)或甘油，0.5%台盼蓝染液，液氮。 仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。
(一)细胞冻存 1.取待冻存的细胞用胰酶消化(见相关实验细胞传代培养部分)，用培养基将细胞冲洗下来。800 r/min离心5 min，弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞，则可直接离心收集细胞。 2.加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或者10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×106个/mL左右，并可适量增加牛血清浓度至20%。 3.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(写上细胞种类、时间及冻存条件等)。 4.冻存管在4℃下存放30 min，转放-20℃ 1.5～2 h，再转人-70℃ 4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃)，注意进行登记。 (二)细胞复苏 1.取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。 2.从液氮中取出冻存管立即投人40℃水中迅速解冻。 3.取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。 4.离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加人3 mL新鲜培养基，于小培养瓶中培养。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 一、细胞的冻存 （一）仪器、用品与试剂 细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。 （二）方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消
化。 3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。 （三）注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。 二、细胞的复苏 （一）仪器、用品与试剂 37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。
细胞冻存与复苏-注意事项
细胞冻存与复苏-注意事项 方法： 冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞： 1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次 2胰酶消化 3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止 4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存 悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤 注意事项： 1.错误的时机： 细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解； 连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。 最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。 1.细胞太少： 冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。 解决： 离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。 1.盖子不紧： 冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。 解决： 选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。 1.单薄的冻存盒：
放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。 解决： 选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！） 1.-80度太久： 放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决： 尽快转入液氮。 1.液氮不足： 液面不能漫过所有细胞。 解决： 定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。 1.取错细胞： 找不到/拿错冻存管。 解决： 每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。 二、细胞复苏： 方法： 1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以 上培养液，混匀； 3.离心，1000rpm，5min； 4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶， 37℃培养箱静置培养； 5.次日更换一次培养液，继续培养。 注意事项： 1.取错细胞：
细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质
细胞复苏与冻存
细胞冻存与复苏 原则：慢冻快融 在超低温的液氮中进行冻存(-196度）。在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性,以及细胞器的损伤,并最终导致细胞的死亡。因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。因此，细胞的冻存和融化过程要在“缓冰速融”下进行。一般冷冻时，在－30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，－30度以下可快速冷冻，使温度降至－196度。 冰冻时还要加入5～10％的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。 在细胞复苏过程中,必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶,造成细胞死亡。 一、细胞复苏 如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没
有及时稀释接种 KEY： 1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 Protocal (以贴壁细胞系tsA201为例) 1．.准备材料：37℃～40℃水浴，37℃预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片 2．细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min以上，超净台开启通风10 min。培养液孵温至于37℃ 3．培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将7-10 ml左右新鲜培养基移入离心管中，备用。 4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉）。立即放入40℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用），以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的： 掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。 二、原理： 细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 三、步骤： （一）材料准备： 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒 置显微镜、培养箱、微量加样器。 2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。 3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。 4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。 （二）细胞复苏步骤： 1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。 3.离心，1 000 rpm，5 min。 4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。 5.次日更换一次培养液，继续培养。 四、注意事项： 1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
一、目的： 学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。 二、原理： 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段时期。在一代中，细胞培增3～6 次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100 个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。 细胞接种2～3 天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。 三、步骤： （一）材料准备： 1. 生长良好的细胞，密度约为90% 2. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃）、倒置显微镜、 培养箱、微量加样器。 3. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。 4. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶、1×PBS。 5. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。 （二）细胞传代步骤： 1.将长成单层的细胞培养皿（60mm）从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中，吸出瓶内的培养基。 2. 加入1×PBS 2ml，轻轻旋转培养皿以清洗细胞，吸出弃去1×PBS。 3. 加入胰蛋白酶0.5ml，静置3-5 分钟。 4. 静置期间，在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中，加入2倍体积完全培养基（含血清），本次加入1ml 完全培养液，吹打，制成细胞悬液。
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤 一、细胞冻存步骤 1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。确保细胞在保存前是健康和活跃的。 2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供 细胞生长和增殖。 3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减 少冷冻过程中对细胞的伤害。 4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。常见的冷冻介质包 括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。 5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管 或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。 6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。 二、细胞复苏步骤 1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。培养基 通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。 2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴 中解冻，避免长时间暴露在室温。 3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。 4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。 6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。 1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。 2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。 3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。 4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。 细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。在未来，随着技术的不断完善和应用的广泛推广，我们可以更好地利用这项技术来促进科学的发展和社会的进步。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 一、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶 性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应 快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 二、慢冻程序 1、标准程序：采用细胞冻存器 当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min； 当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min； 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。 2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃ 的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。 3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16 ~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。 三、低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分 在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰 晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法 1、预先配制冻存液 10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹 打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml） 3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 液氮长期保存 五、保存细胞的复苏方法 1、快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管， 使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 2、解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接 进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。 3、如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生 长培养液的培养瓶中。
细胞冻存与复苏-注意事项
方法： 冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞： 1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次 2胰酶消化 3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止 4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存 悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤 注意事项： 1.错误的时机： 细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解； 连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。 1.细胞太少： 冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。 解决： 离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。 1.盖子不紧： 冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。 解决： 选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。 1.单薄的冻存盒： 放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。 解决： 选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！） 1.-80度太久： 放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：
尽快转入液氮。 1.液氮不足： 液面不能漫过所有细胞。 解决： 定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。 1.取错细胞： 找不到/拿错冻存管。 解决： 每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。 二、细胞复苏： 方法： 1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以 上培养液，混匀； 3.离心，1000rpm，5min； 4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶， 37℃培养箱静置培养； 5.次日更换一次培养液，继续培养。
动物细胞冻存和复苏的原则
动物细胞冻存和复苏的原则 动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面： 1.冻存前细胞状态 在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。 2.冻存方法 常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。 3.冻存温度 动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。 4.复苏步骤 细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO
等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。 5.细胞状态监测 在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。 6.及时传代 为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。 7.记录管理 在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。记录的内容包括细胞种类、代数、冻存日期、复苏日期、冻存方法、复苏步骤等信息。这些信息对于后续的研究和管理都非常重要，有助于保证细胞的来源和可追溯性。 总之，动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。在进行冻存和复苏过程中，应该遵循一定的原则和方法，确保细胞的存活率和稳定性。同时，建立完整的记录管理体系也有助于保证细胞的来源和可追溯性。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤 1.细胞培养 首先，需要从细胞库中取出要冻存的细胞，并将其接种在适当的培养 基上。培养基应该包含适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的正常生 长和分裂。 2.细胞生长 将培养皿置于恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和气体环境。细 胞需要在培养基中适当的时间内生长和扩增。通常，培养时间为2-3天， 视细胞类型而定。 3.细胞检查 在细胞生长期间，必须定期对细胞进行检查，以确保其健康和无污染。细胞检查可通过显微镜观察细胞形态和活力，或通过细胞培养基中的染料 检测细胞活性。 4.细胞分离 一旦细胞达到所需的数量，即可进行细胞分离。使用适当的胰蛋白酶 或其他消化酶来分离细胞。细胞分离后，将其转移至新的培养皿中。 5.细胞计数 使用血细胞计数板或其他形式的计数器来计数细胞数目。细胞计数是 决定细胞数量和密度的重要步骤，以确保在冻存过程中使用适当的细胞浓度。 6.冻存液制备
冻存液是保护细胞冻存过程中的关键溶液。常见的冻存液成分包括培养基和甘油、DMSO（二甲基亚砜）等保护剂。这些成分具有保护细胞免受冻结和解冻过程中的损伤的作用。 7.细胞冻存 将细胞和冻存液混合在一起，使用冷冻管或冻存管将其分装。然后将冻存管放入冷冻容器中，使其逐渐冷却至极低温（通常为-80℃或液氮温度）。 8.细胞解冻 在需要复苏细胞时，从冷冻容器中取出冻存管，快速解冻至37℃。解冻时应非常小心，以免损伤或破坏细胞。可选择将冻存管置于37℃水浴中解冻，或使用预先加热的介质进行解冻。 9.细胞复苏 一旦细胞完全解冻，将其迅速转移到预先准备好的培养皿中。加入适量的培养基和生长因子，为细胞提供所需的营养和环境条件。将培养皿放入恒温培养箱中，并维持适当的生长条件。 10.细胞生长观察 在细胞复苏后，定期观察细胞的生长和活性。使用显微镜观察细胞形态和增殖情况，确保细胞正常生长。如果发现任何细胞死亡或异常现象，可能需要采取相应的措施来解决。 11.细胞传代 一旦细胞复苏并正常生长，可以进行细胞传代以扩增细胞数量。细胞传代是将细胞分离并移植到新的培养皿中，以保持细胞的健康和生长。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输 细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细 胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和 物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去 原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。细胞 冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保 护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如 细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原 因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释 放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜 通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷 冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞 内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂， 这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提 高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使
细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰 晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用 时要注意以下几点： （1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-19 6℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防 止焊接部裂开。 （3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专 用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 易生物仪器库：https://www.360docs.net/doc/4419220219.html,/yp/product-list-42.html 易生物试剂库：https://www.360docs.net/doc/4419220219.html,/yp/product-list-43.html 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为：
细胞冻存(Cell Freezing)和复苏技术原理和操作步骤
细胞冻存（Cell Freezing）和复苏技术原理和操作步骤 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成 冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可 使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞 仍能生长，活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性， 分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 二、操作步骤 （一）冻存 1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。 注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 （二）复苏 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤5。）
冻存细胞复苏步骤
冻存细胞复苏步骤 冻存细胞复苏是一种常用的细胞保存方法，它可以将细胞冷冻保存在极低温度下，以防止其失活或死亡。当需要使用这些冻存细胞时，我们需要进行复苏步骤，使其恢复到正常的生活状态。下面将介绍冻存细胞复苏的步骤。 第一步：预备工作 在进行细胞复苏之前，我们需要做一些预备工作。首先，准备好培养皿和培养基。培养皿应该是无菌的，以确保细胞复苏的成功。培养基应该是适合细胞生长的，可以提供必需的营养物质和生长因子。其次，准备好所需的实验器材和试剂。 第二步：取出冻存细胞 将冻存细胞保存管从液氮罐中取出，迅速将其放入37摄氏度的水浴中。在水浴中加热的过程中，可以轻轻摇晃管子，以加快冻存细胞的解冻速度。当冻存细胞完全解冻后，将其转移到无菌的培养皿中。 第三步：培养细胞 将解冻后的细胞转移到培养皿中后，加入预先准备好的培养基。培养基应该是预热的，温度应与细胞生长温度相适应。将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。同时，确保培养基中的氧
气和二氧化碳浓度适当。 第四步：观察细胞生长 在细胞复苏的过程中，我们需要定期观察细胞的生长情况。通过显微镜观察细胞的形态和数量变化，判断细胞是否成功复苏。如果细胞开始生长并形成典型的细胞群落，说明细胞复苏成功。 第五步：细胞传代 当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞传代，以维持细胞的正常生长和功能。细胞传代是将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，以减少细胞密度，防止细胞过度生长。传代的时机应该根据细胞的生长速度和培养皿的容量来确定。 细胞复苏是一项关键的实验操作，它可以使冻存的细胞重新恢复到正常的生长状态。通过合理的操作步骤和严格的操作要求，可以提高细胞复苏的成功率。在进行细胞复苏时，我们需要注意操作的无菌性、培养基的配制和温度的控制等因素，以确保细胞复苏的顺利进行。同时，及时观察细胞的生长情况，并进行适当的细胞传代，可以保持细胞的正常生长和功能。 冻存细胞复苏是一个复杂而重要的过程。只有严格按照操作步骤进行，并注意细节和细胞的特性，才能够成功复苏冻存的细胞。细胞复苏的成功不仅对于科研工作具有重要意义，也为细胞保存和应用提供了有效的手段。
细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏 ⏹概述✧冻存过程 ⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果 ♦冷冻速率✧讨论 ♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏 ♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复 苏 ♦冷冻保护剂✧主要材料 ⏹冷冻保存方法✧复苏过程 ♦非玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏 ✧冻存结果✧主要材料 ✧讨论✧复苏过程 ♦玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ⏹
Polge等人（1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于—790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956)、Rey(1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂.Lovelock(1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO）。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 返回页首 冷冻保存与复苏原理 在低于—700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰.如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤.如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因
传代细胞的冻存与复苏SOP
1. 目的 规范细胞的保存与复苏方法。 2. 范围 各种细胞的保存与复苏 3. 职责 3.1.质量管理部：负责本程序的起草。 3.2.质量管理部QC人员：负责本程序的操作。 3.3.总经理：负责本程序的审批。 4. 定义 无 5. 引用标准 无。 6. 材料 6.1. 材料准备： 6.1.1. DMEM培养基 6.1.2. 细胞消化液 6.1.3. 二甲基亚砜 6.2. 仪器设备 低速离心机、液氮罐 6.3. 器械、用具 细胞冻存管、小试管 7. 流程图 无 8. 内容 8.1. 细胞保存 8.1.1. 将细胞按常规进行消化。 8.1.2. 将消化好的细胞加入小试管中。 8.1.3. 500～1000rpm离心10分钟
资料整理 8.1.4. 倒掉上清，加入已配制好的细胞保存液中（含10%二甲基亚砜的细胞生长 液） 8.1.5. 轻轻吹打将细胞悬起，倒入细胞冻存管中。 8.1.6. 做好标记（包括细胞名称、细胞代数、冻存日期）。将冻存管放入带绳的 纱布袋中。 8.1.7. 将纱布袋放入4℃冰箱中预冷2小时。 8.1.8. 再放入-20℃冷冻柜中预冻2小时。 8.1.9. 然后放入液氮中。做好记录。在绳上做好标记。 8.2. 细胞的复苏 8.2.1．配制细胞生长液 8.2.2．准备一杯40℃左右的温水 8.2.3．将准备复苏的细胞管从液氮中取出快速放入40℃左右的温水，使其以最 短的时间融化。 8.2.4．500～1000rpm低速离心10分钟。 8.2.5. 倒掉上清，用已配制好的细胞生长液将细胞悬起。 8.2.6．转入细胞培养瓶中。37℃培养。 8.2.7．于次日细胞贴壁后，换掉液体。 9. 注意事项 9.1．随时注意观察液氮罐中液氮液面，少于三分之一时及时添加。 9.2．从液氮中取出细胞时，注意不要冻伤。 9.3．把握细胞慢冻快融的原则，细胞复苏后的存活率比较高。 10. 附录及派生记录 10.1. 无 11. 相关文件 无 12. 修订记录
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏 细胞冻存与复苏 细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。 细胞的冻存【用品】 （1） 5%胰蛋白酶 （2）含10%~20%血清培养液 （3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】 （1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。 （2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。 （3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。 （4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。 细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。 细胞的复苏 【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】 （1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。 （2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养
细胞复苏的步骤(干货分享)
细胞复苏的步骤 细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。 一、细胞冷冻保存ﻫ1、材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO （SiｇmａD-2650）、无菌塑料冷冻保存管(Nalgeｎe 5０00-0０20)、０。4％(w/v）trypan ｂlue（GibcoBRL152５０—061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYO１０SeriesIＩ）ﻫ2、冷冻保存方法： （1)传统方法: 冷存管置于4℃１0分钟—-—＞—２0℃3０分钟－－—＞－80℃16～１8小时（或隔夜)—-－＞液氮槽vａpｏrｐｈase长期储存。ﻫ-２0℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-８0℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以－1~—3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-１20℃，再放在液氮槽vａpｏrph ａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存. 3、步骤：ﻫ(1）冷冻前24—48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 (2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DＭＳO)至2０％浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用.
(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０．1ml）计数细胞浓度及冻前存活率. （4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSＯ最后浓度为５~10％），使细胞浓度为1～5×106ceｌls／ml，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vｉal,并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后,注明细胞名称、代数、日期.然后进行冻存。 4、注意事项：ﻫ（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphas ｅ）且存活率高之状态，约为80~90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如ｈyｂridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生. （２）细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-７0度可保存数月。 （３)注意冷冻保护剂之品质。ＤＭＳＯ应为试剂级等级,无菌且无色（以0。22miｃｒon ＦGLＰTelfｌｏn过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D—2６50),以5～1０ｍl小体积分装,4℃避光保存，勿作多次解冻。Glｙceｒoｌ亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免ＤMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DＭSＯ可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用１０％甘油冻存。ﻫ(4）冷冻保存之细胞浓