培养细胞的冷冻保存与复苏原理及注意事项

一、细胞冷冻保存原理

细胞冷冻保存是在细胞外胞质和死亡之前，通过冷冻手段将细胞保存在低温状态，这样就可以最大程度保存细胞的形态和活力，使它们暂时处于休眠状态，为后期复苏提供条件。其原理是在低温和抗冻液的作用下，使细胞的活力及细胞外液体的高浓度的盐离子外溢出细胞，从而防止细胞受到冻伤和细胞凋亡。低温能降低细胞内外活性物质的酶活性，抑制细胞代谢过程，可阻止及减缓细胞的死亡。

二、细胞冷冻复苏原理

细胞冷冻复苏，是指将冷冻保存的细胞从冰箱中取出，经过适当温度的回升，使其恢复活性的过程。细胞冷冻复苏的原理是冷冻复苏液中的温度上升，和大量尿素和甘油类等抗冻液成分的存在，因而使细胞的活性慢慢恢复，最终实现细胞冷冻复苏。

三、细胞冷冻保存和复苏的注意事项

1、冷冻温度要尽可能低，最好能够达到低于-150℃。

2、冷冻液的配制要仔细谨慎，需要用到高浓度的尿素和甘油，以及根据实验要求，加入抗生素和补充物质。

3、冷冻保存前，要进行充分的诱导，保证细胞变性成功，并进行细胞质量检测，以便确定最佳冷冻条件。

4、细胞必须用冰水冷却至0℃，然后再放入冰箱。

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。具体原理如下： 1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。 2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤： 1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。 2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。

3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。 4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。 5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。通过控制好冷冻和复苏的操作步骤，加入适当的保护剂，可以有效降低细胞损伤，保证细胞的存活率和生活特性。细胞冻存与复苏技术的应用，对于细胞学研究和细胞工程等领域都具有很大的意义。

细胞的冻存与复苏

细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。（二）方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消

化。 3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。（三）注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。二、细胞的复苏（一）仪器、用品与试剂 37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。

细胞复苏与冻存

细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存(-196度）。在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性,以及细胞器的损伤,并最终导致细胞的死亡。因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。因此，细胞的冻存和融化过程要在“缓冰速融”下进行。一般冷冻时，在－30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，－30度以下可快速冷冻，使温度降至－196度。冰冻时还要加入5～10％的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。在细胞复苏过程中,必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶,造成细胞死亡。一、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没

有及时稀释接种 KEY： 1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 Protocal (以贴壁细胞系tsA201为例) 1．.准备材料：37℃～40℃水浴，37℃预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片 2．细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min以上，超净台开启通风10 min。培养液孵温至于37℃ 3．培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将7-10 ml左右新鲜培养基移入离心管中，备用。 4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉）。立即放入40℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用），以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。步骤： 1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。 2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。 3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。 4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。复苏： 1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。 2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。观察细胞的生长和形态变化。原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的

存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。注意事项： 1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。 2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。 3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。 4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。 5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。

细胞复苏,传代与冻存

一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、步骤：（一）材料准备： 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。 2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。 3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。 4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。（二）细胞复苏步骤： 1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。 3.离心，1 000 rpm，5 min。 4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。 5.次日更换一次培养液，继续培养。四、注意事项： 1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。

一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段时期。在一代中，细胞培增3～6 次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100 个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3 天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。三、步骤：（一）材料准备： 1. 生长良好的细胞，密度约为90% 2. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。 3. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。 4. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶、1×PBS。 5. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。（二）细胞传代步骤： 1.将长成单层的细胞培养皿（60mm）从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中，吸出瓶内的培养基。 2. 加入1×PBS 2ml，轻轻旋转培养皿以清洗细胞，吸出弃去1×PBS。 3. 加入胰蛋白酶0.5ml，静置3-5 分钟。 4. 静置期间，在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中，加入2倍体积完全培养基（含血清），本次加入1ml 完全培养液，吹打，制成细胞悬液。

细胞冻复苏的原理

细胞冻复苏的基本原理细胞冻复苏是指将生物细胞在极低温下冷冻保存，然后通过适当的方法将其重新恢复到正常的活动状态。这种技术在医学研究、细胞保存和生物学实验中得到了广泛的应用。细胞冻复苏的基本原理可以分为以下几个步骤：冷冻、保存、复苏。 1. 冷冻冷冻是将细胞通过适当的方法暴露在极低温度下，以减缓其新陈代谢的过程。这样可以降低细胞内的反应速率，减少细胞损伤和死亡的风险。冷冻过程中需要涉及到控制温度、添加冷冻保护剂等步骤。常用的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等，它们具有较高的渗透性，可以降低冷冻过程中细胞内外渗透压差造成的细胞膜破裂和细胞器损伤。在冷冻过程中，必须将细胞缓慢降温以避免冷冻过程中的温度梯度对细胞结构和功能的不利影响。常用的冷冻方法包括冰浴法、液氮冷冻法等。 2. 保存冷冻后的细胞需要妥善保存，以防止细胞死亡和损伤。通常情况下，细胞会被保存在液氮中，这是因为液氮的温度极低（通常为-196℃），可以有效地防止细胞新陈代谢过程的进行，从而达到长期保存细胞的目的。在保存过程中，必须确保细胞样品充分冷冻且不会受到氧气、水分和其他有害物质的污染。此外，细胞容器也需要选择适合保存的材料，以减少细胞与容器之间的相互作用。 3. 复苏复苏是将冷冻保存的细胞重新恢复到其正常的活动状态。复苏的关键是确保细胞的完整性和功能不受损害。在复苏过程中，首先需要将细胞从液氮中取出，迅速放入恢复液中。恢复液通常是一种富含营养物质的培养基，能够提供细胞所需的营养物质和生长环境。恢复液中还可以添加一些抗氧化剂和解冻剂，以减少冰冻阶段对细胞的伤害。随后，细胞需要经历逐渐升温的过程，以使细胞逐渐从冷冻状态回到正常活动状态。升温过程应尽量缓慢，以避免温度梯度引起的细胞膜破裂和细胞器损伤。在细胞逐渐升温的过程中，还需要对细胞进行适当的培养，包括提供适当的温度、湿度和气体环境。此外，还可以通过添加生长因子、激素和细胞贴壁因子等来促进细胞的复苏和生长。

实验室培养细胞的冻存复苏

实验四细胞冻存和复苏一、目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、概述细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、材料（一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机

3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸（三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏

5. 移液枪（五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备： ●细胞培养通风橱（即生物安全柜） ●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱） ●离心机 ●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项: ●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。 ●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。 ●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75% 酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。 ●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：

在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。 b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。 c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。 d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存： a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。 b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。 c)使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后，计算出冻存溶液的体积，从而保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。 d)约800-1000rpm下离心5-10分钟，无菌条件下小心弃去培养基，不要搅动细胞沉淀。 e)用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀，分装至冻存管中，做好标记后进行梯度降温至液氮环境中保存，入库。 *对于传统的细胞冻存，需要进行程序降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）冻存，为避免操作流程的繁琐不可控，可选用无血清非程序降温细胞冻存液，包括Cellregen无血清细胞冻存液和无血清低

细胞冻存与复苏的基本原则

细胞冻存与复苏的基本原则 1. 引言细胞冻存与复苏是一种重要的生物技术，它可以将活体细胞保存在极低温度下，并在需要时重新激活这些细胞。这项技术在医学、科学研究和生物工程等领域具有广泛的应用前景。本文将介绍细胞冻存与复苏的基本原则，包括冷冻过程、保护剂的选择、解冻过程以及相关实验技术。 2. 冷冻过程细胞冷冻是将活体细胞从正常生长温度（通常为37摄氏度）迅速降温到极低温度（通常为-196摄氏度）的过程。这个过程需要严格控制，以避免对细胞造成伤害。 2.1 温度控制在开始冷冻之前，必须确保液氮罐内的温度稳定在-196摄氏度。为了达到这个目标，可以使用液氮罐内置的温度计进行监测，并通过添加适量的液氮来保持温度稳定。 2.2 冷冻容器的选择为了保护细胞免受冷冻过程中的机械损伤，需要选择合适的冷冻容器。常见的冷冻容器有液氮罐、干燥冰和低温保存管等。其中，低温保存管是最常用的容器，因为它可以提供良好的细胞保护效果，并且方便存储和操作。 2.3 冷却速率控制快速降温是细胞冷冻过程中至关重要的一步。过快或过慢的降温速率都会对细胞造成损伤。通常情况下，推荐使用缓慢降温法，即将细胞置于预先调整好的液氮罐中，并逐渐将其浸入液氮中。

3. 保护剂的选择在细胞冷冻过程中，添加适量的保护剂可以减少细胞受到的损伤，并提高其存活率。常用的保护剂包括甘露醇、甘油和DMSO等。 3.1 甘露醇甘露醇是一种具有良好保护细胞功能的保护剂。它可以通过降低细胞内外渗透压的差异，减少细胞脱水和冰晶形成，从而保护细胞免受冷冻损伤。 3.2 甘油甘油是另一种常用的保护剂，与甘露醇类似，它也可以减少细胞脱水和冰晶形成。此外，甘油还具有良好的渗透性，可以迅速进入细胞内部，并提供额外的保护作用。 3.3 DMSO 二甲基亚砜（DMSO）是一种强效的保护剂。它可以通过改变细胞膜的流动性和稳定性来保护细胞，并防止冷冻过程中产生的机械损伤。 4. 解冻过程解冻是将经过冷冻保存的细胞重新恢复到正常生长状态的过程。正确的解冻方法对于维持细胞活力至关重要。 4.1 温度控制在解冻过程中，必须确保温度逐渐升高到37摄氏度。可以使用温水浴或恒温培养箱等设备来控制解冻温度。 4.2 解冻液的选择解冻液的选择也非常重要。一般来说，解冻液应包含适量的培养基和保护剂，以帮助细胞快速恢复生长状态。

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法预先配制冻存液：20%血清培养基 10%DMSO （二甲基亚砜）取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！ 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。注意事项：

细胞复苏的原理和方法

细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。细胞复苏的方法如下： 1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。如果37℃ 水浴时间延长，会提高细胞死亡率。 2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入 15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。

3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75 的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。三天可进行一次换液。当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。此外，还有一些注意事项： 1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。 2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。 3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。 4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。以上信息仅供参考，具体操作建议咨询专业人士。

细胞的冻存及复苏

细胞的冻存与复苏背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70 C冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196 C,理论上储存时间是无限的。原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砚(DMSO )作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

（一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10〜90%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm , 5min ; 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5 x 106/ml 〜1 x 107/ml; 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1〜1.5 ml ; 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1〜-2C/ min ;当温度达-25C以下时，可增至-5C〜-10C/ min ;至IJ-100C时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20 C冰箱2h，然后放入-70C冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37 C温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37C水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm , 5min ; 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37 C培养箱静置培养 5. 次日更换一次培养液，继续培养。

动物细胞冻存和复苏的原则

动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面： 1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。 2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。 3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。 4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO

等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。 5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。 6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。 7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。记录的内容包括细胞种类、代数、冻存日期、复苏日期、冻存方法、复苏步骤等信息。这些信息对于后续的研究和管理都非常重要，有助于保证细胞的来源和可追溯性。总之，动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。在进行冻存和复苏过程中，应该遵循一定的原则和方法，确保细胞的存活率和稳定性。同时，建立完整的记录管理体系也有助于保证细胞的来源和可追溯性。

实验七细胞的冻存和复苏6

实验7 细胞的冻存和复苏【实验原理】在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。【实验目的】掌握细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存与复苏操作。【仪器、材料及试剂】 1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等 2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管等。 3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。【操作步骤】 1．冻存 ①消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。 ②1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ③沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。 ④将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 ⑤将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 ⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 ⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 2．复苏 ①从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 ②打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 ③1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 ④沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。 ⑤加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。【实验报告】列出细胞冻存与复苏的详细过程，并注明各过程应注意的事项。【思考题】 1．细胞冻存与复苏的基本原则是什么？ 2．冻存液的作用是什么？

细胞冻存的原理与要求

细胞冻存的原理与要求 The document was finally revised on 2021

细胞冻存的原理与要求

细胞冻存的原理与要求 1. 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂（甘油或DMSO）,可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。储存在－130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在5～10％之间，常用10％。 2. 要求：为保护细胞最大存活率，一般采用慢冻快溶的方法。标准的冻存速度为－1～－2度/分钟，当温度达－25度时，下降率刻增至－5～－10度/分钟到－100度时则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响到细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。但各种细胞对冻存速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性大些，骨髓干细胞－1～－3度/分钟较合适，胚胎细胞耐受性较小，总之，在一开始时下降速度不能超过－10度/分钟。另外，用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮细胞储存在20~30%甘油中很好。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。冻存液是（DMSO10%+90%FBS）技术总结要点 1. 冷冻速度冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

细胞冻存与复苏技术

细胞冻存与复苏技术概述细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0— 196 o C 进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有 -20~-40℃ 冰箱保存、-60~-80℃深低温冰箱和液氮(一196℃)超低温保存等。应用方向 1.医学方面近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2.生物学方面细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。发展历史 1. 1776年．Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代 Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972年．Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降．细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损

细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项

培养细胞的冷冻保存与复苏 ⏹概述✧冻存过程 ⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果 ♦冷冻速率✧讨论 ♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏 ♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏 ♦冷冻保护剂✧主要材料 ⏹冷冻保存方法✧复苏过程 ♦非玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏 ✧冻存结果✧主要材料 ✧讨论✧复苏过程 ♦玻璃化冻存方法✧结果 ✧主要材料✧讨论 ⏹

Polge等人（1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于—790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956)、Rey(1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂.Lovelock(1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO）。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。返回页首冷冻保存与复苏原理在低于—700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰.如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤.如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因