转基因题库

名词解释

1. reverse genetics

◆Reverse genetics, 反向遗传学：由转基因小鼠体系发展而建立的,则先在体外使基因某一片段发生突变，然后导入基因组，从而研究基因结构和功能关系以及建立人类遗传病动物模型．这种从特定基因的改造到整体动物的表型分析的研究思路称为反向遗传学。

2. therapeutic cloning

◆therapeutic cloning，治疗性克隆：是指将病人体细胞核移植到去核的卵母细胞中，在核重新编程(reprogramming)后，供体体细胞核重新获得发育的全能性，并可启动胚胎发育，产生携带有病人基因组的多潜能干细胞；然后，经诱导分化成各种类型的替代细胞，来修复损伤组织或器官的过程。

3. mammary gland bioreactor

◆mammary gland bioreactor：乳腺生物反应器。是将外源基因在乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白，采用乳腺生物反应器生产药用蛋白是一种全新的生产模式，已经成为生物技术领域发展的重要方向

4. model organigms

◆model organigms 模式生物指那些遗传背景明确，生化生理特性明确特别适于基因组改造和进行相关功能研究的一些生物品系．小鼠，大鼠，线虫，果蝇，斑马鱼等。

5. gene targeting

◆Gene targeting：基因打靶技术,是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段.通过对生物活体遗传信息的定向修饰(包基因灭活,点突变引入,缺失突变,外源基因定位引入,染色体大片段删除等),并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传,表达突变性状,从而研究基因功能等生命科学的重大问题,以及提供相关的疾病治疗,新药筛选评价模型等.它的产生和发展建立在胚胎干细胞(embryonic stem cells)技术和同源重组技术（homologous recombination)成就的基础之上,并促进了相关技术的进一步发展。

◆gene targeting 基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。

6. somatic cell nuclear transfer

◆somatic cell nuclear transfer体细胞核转移，又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建新合子的生物技术。它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速家畜品种改良或生产转基因动物。

◆somatic cell nuclear transfer：核移植技术，是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。

7. positive negative selection

◆positive negative selection：正负选择（筛选）系统，是一类定位在基因片段末端，同源区以外的附加的标记基因组。通过正选择基因和负选择基因的正负筛选标记，大大提高筛选效率。（不确定）

◆positive negative selection 正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)是基因打靶的常用筛选方法之一，可以更好地筛选发生同源重组的克隆。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一个，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。

图正负双向选择法示意图

a：同源重组；

b：随机整合；

neor：新霉素抗性基因；

HSV-tkc：疱疹病毒胸苷激酶基因；

GeneX：干细胞内源基因（与导入基

因同源）；

G418：新霉素；

GANC：抗致死的核苷类似物；

核苷类似物参与合成，细胞致死。

◆Positive-negative selection 1988－Capceehi Lab Mansour等发展了一种“正负筛选”（Positive-negative selection，ＰＮＳ)策略，将胸腺嘧啶激酶基因（ＴＫ）置于打靶载体外侧，作为负筛选标记．与单一正筛选标记策略相比，ＰＮＳ策略正确克隆富集的倍数要高３－１０倍．真正使得同源重组技术可以作为修饰哺乳动物细胞基因组遗传信息的常规手段并应用于生命科学研究的各个领域

8. gene trap

◆gene trap

从基因组捕捉能够表达的基因的一种策略，是目前最具应用前景的基因克隆方法之一。常用的办法是将基因组序列片段插入到基因捕获载体（不带调控元件、但含可供筛选的抗性基因、酶基因编码序列等）中，从所构建的文库中捕捉能表达的基因。

利用该技术建立的随机插入突变的突变体文库，可用于寻找、鉴定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因，它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物学方法。基因捕获载体是带有报告基因和/或选择标记基因的不完整的基因表达载体；这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。

基因捕获的策略如图所示。典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因。neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。

◆gene trap：基因陷阱或基因捕获（gene trap）是通过在基因组中创造随机插入突变，来直接获得分子特征。基因陷阱或基因捕获载体包含一个无启动子的报告基因或选择标记，它能在插入位置（内含子）激活所在基因表达。因这系列方法酷似以报道基因为诱饵来捕获基因，故得名基因陷阱或基因捕获。

◆Gene trap:

基因捕获技术: 通过报告载体随机整合到基因组,产生插入失活突变并揭示基因表达模式及其功能，是建立高通量变大规模基因突变模型的一种便利手段

9. mosaic

◆Mosaic: 同源性嵌合体，即起源于同一合子发育成不同核型的细胞系所形成的个体。

10. Embryonic stem cell

◆Embryonic stem cell: 胚胎干细胞（ES cell），即当受精卵发育成囊胚时，内层细胞团(Inner cell mass)的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。ES细胞可被培养，操纵然后注射进囊胚中，生长出胚胎的各个组成部分。总之，ES细胞可以产生大量用于病人移植的所需的细胞。

11. reprogramming

◆reprogramming（细胞核重编程）：细胞核重编程是哺乳动物正常受精胚胎和克隆胚胎发育过程中的一个重要特性,主要是对表观遗传学特征进行重新编写,包括染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化、印记基因表达、X染色体失活等表观遗传修饰的改变。通过细胞核重编程,首先,受精卵和克隆胚胎的供体核停止其特有的基因表达程序,恢复为全能状态的基因表达程序;然后,受精胚胎和克隆胚胎的细胞再从全能状态重新进入分化状态,最终形成各种组织和器官。

12. knock in mice

◆knock in mice 基因敲入小鼠是实验室里研究者用于表达一个转基因，比如cDNA 或者通过内源基因的表达调控在目标载体中构建的一个含有报告基因。目前应用最广泛的敲入技术

是将最常见的基因置换成某一报告基因LacZ或GFP，通过在成年小鼠体内检测这些报告基因来观察本身基因的表达。

◆Knock in —is a modification in which a specific mutation(s) or rearrangement is introduced and the gene remains functional. Knock in experiment are used to place a transgene , such as a CDNA or a reporter construct contained in a targeting vector, under the transscriptional control of an endogenous gene.

As discussed above, most widely used knock-in strategy is the replacement the most widely used of a gene by a reporter gene such as LacZ or GFP, to monitor expression pattern of the gene during development and in the adult mouse, both in a spatial and mutation. However, it is important to note that such a temporal manner

基因敲入，是指只通过特定突变或者重排，而基因功能任然存在的基因修饰技术。基因敲入实验通常将一个转基因（例如cDNA或者打靶载体中的报告结构）置入内源性基因的转录调控中。最广泛使用的基因敲入策略是用一个报告基因（β- 半乳糖苷酶LacZ 或者荧光蛋白GFP）取代原来的基因，在发育期和成年鼠中观察其表现型。不过，重要的是要注意到这是一种时间上的方式。

◆Knock in —is a modification in which a specific mutation(s) or rearrangement is introduced and the gene remains functional. Knock in experiment are used to place a transgene , such as a CDNA or a reporter construct contained in a targeting vector, under the transscriptional control of an endogenous gene.

另: Generating “knock-in” mi ce. Knock-in experiments are used to place a transgene,such as a cDNA or

a reporter construct contained in a targeting vector,

under the transcriptional control of an endogenous

gene.

As discussed above, most widely used knock-in strategy is the replacement the most widely used of a gene by a reporter gene such as LacZ or GFP, to monitor expression pattern of the gene during opment and in the adult mouse, both in a spatial and mutation. However, it is important to note that such a temporal manner

13. knock out mice

◆knock-out — is a modification in which the activity of the gene is eliminated (eg: delete the gene or a key region). A knockout mouse is a laboratory mouse in which researchers have inactivated, or "knocked out," an existing gene by replacing it or disrupting it with an artificial piece of DNA. The loss of gene activity often causes changes in a mouse's phenotype, which includes appearance, behavior and other observable physical and biochemical characteristics

基因敲除，是指通过同源重组直接将靶细胞或者动物个体中基因活性完全消除（删除一个基因或者关键区域）。基因敲除小鼠，是一种实验室小鼠，研究者用人工的DNA片段替换或者打乱一个已经存在的基因，从而达到基因灭活或者基因敲除的目的。基因功能的丧失往往导致小鼠的表型的改变，包括外观，行为和其他可观察的物理和生化特性的变化。

◆knock out mice——基因敲除小鼠

“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠。

这种方法本身就是生物医学领域里一项极具开创性的方法，同时，由于人类基因与小鼠基因有90％以上的相似性，因此它在理论上具备了用于心脏病、糖尿病等人类遗传因素引发的疾病研究的可能。

◆Knock out mice

knock-out 完全基因剔除— is a modification in which the activity of the gene is eliminated (eg: delete the gene or a key region). A knockout mouse is a laboratory mouse in which researchers have inactivated, or "knocked out," an existing gene by replacing it or disrupting it with an artificial piece of DNA. The loss of gene activity often causes changes in a mouse's phenotype, which includes appearance, behavior and other observable physical and biochemical characteristics

14. knock down

◆knock down 抑制

RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)不但用途广泛，且为生物研究的有力工具。科学家表示已经创造了一种新的基因转殖鼠，特色为身上所带有的RNAi会降低或是停止目标基因的表现，达到稳定的“gene knockdown”目的。这项发现让RNAi的功用扩展到活体动物的基因研究上，未来可望应用在各种人类疾病的治疗上。

为了让RNAi能够用于老鼠的基因功能研究，纽约州立大学石溪校区(Stony Brook University)的Thomas Rosenquist以及冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)的Greg Hannon利用遗传工程，创造出让RNAi之标的为特定基因的老鼠胚胎干细胞。

接着科学家将这些干细胞注射到老鼠胚胎内，诞生了嵌合鼠。嵌合鼠的后代体内的每一个细胞，都带有人工的RNAi诱发基因。科学家检测了这些基因转殖鼠的组织，发现目标基因的表现四处受到抑制，如肺部、心脏、脾脏等。这种抑制基因的方法称为“gene knockdown”，相对于传统的基因惕除法(gene knockouts)。

◆knock down 基因干预

采用特定的方法抑制某个基因表达，或通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

15. embryo engineering

◆embryo engineering 胚胎工程

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。这些技术进一步挖掘动物的繁殖潜力，为优良牲畜的大量繁殖，稀有动物的种族延续提供有效的解决办法。

16. conditional gene targeting

◆条件性基因打靶(conditional gene targeting)，可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的基因打靶技术。它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用Cre重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

17. transgenic animal

◆Transgenic animal 转基因动物：是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的动物模型。

18. forward genetics

◆Forward genetics 传统遗传学/正向遗传学:是从具有特定异常病理表型的突变小鼠开始，通过染色体定位和分子克隆的方法，最终克隆导致特定表型的基因组突变位点，从而建立某一基因与相应生物学现象之间的关系．

19. homologous recombination

◆Homologous recombination 同源性重组是指发生在DNA 同源序列之间的重组。其显著特征是在发生交换的DNA 的2 个区域的核苷酸序列必须是相同或很相似。同源性重组主要是利用DNA 序列的同源性识别重组对象, 蛋白质(如大肠杆菌RecA 蛋白) 可以促进识别, 但提供特异性识别的是碱基序列。

◆homologous recombination同源重组同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或相似DNA序列间的重组.它通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。

20. microinjection

◆microinjection 显微注射：1指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。2用显微注射仪将外源基因注入细胞或配子的技术。

21. reproduction cloning

◆reproduction cloning以产生新个体为目的的克隆。目的是产生一个独立生存的个体。于此相对的是研究性克隆或医学性克隆，指的是产生研究所用的克隆细胞。不产生可独立生存的个体

简答题

1. 第一个超级小鼠的出现标志着转基因动物技术的成熟，简述它在科学上的意义。

◆答：①证实了“中心法则”（即DNA→ RNA→ 蛋白质的遗传信息传递过程）的概念在哺乳动物体内仍然适用；

②物种之间的生殖隔离被打破；

③找到了一条按照人们意愿定向创造哺乳动物遗传性状的有效途径；

④有了一套集分子水平、细胞水平和活体动物水平于一体的全新的综合研究体系。

◆答：1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，他们用显微注射技术，成功地将大鼠生长激素重组基因导入一个小鼠的受精卵里面去，结果使出生的小鼠变成了大鼠。这是因为小鼠获得了大鼠的重组生长激素基因，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”（supermouse)。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。这项研究获得了人类历史上第一个转基因动物，被誉为分子生物学发展的里程碑。

意义：

(一)在基础生物学中

使哺乳动物转基因技术用于研究真核细胞的基因转录、表达和调控规律以及个体发育的分子调控规律成为了可能。借助转基因动物模型人们有可能将分子、细胞、组织、器官及个体的发生发育和衰老统一起来，从时间和空间角度综合研究基因的表达调控规律。如利用神经组

织特异性或心肌组织特异性调控因子与标记基因，如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶基因构建在一起，制备出转基因动物，通过检查标记基因的表达产物可研究神经或心肌组织的发生、发育规律。基因敲除(去除动物染色体上某一段DNA)可用于研究基因的表达功能或这一基因对蛋白质合成的调控功能。

(二)在基础医学研究中

使用利用转基因技术对遗传疾病的研究成为了可能，并能建立相应的动物模型。遗传疾病的DNA被克隆后，通过转基因技术制备动物疾病模型，可用来研究遗传病的发生、发展规律和治疗方案的选择。目前，在世界范围内通过转基因技术至少已建立15种人类遗传疾病的动物模型，这里包括糖尿病、高血脂症、β-地中海或镰刀型贫血症、动脉粥样硬化症等常见的疾病。随着人类基因组计划的完成和基因定点整合技术的成熟，转基因技术有可能治愈人类的遗传疾病。

(三)在畜牧业中

转基因技术可把生长激素或促生长因子基因导入家畜基因组中，加快生长速度，提高饲料报酬。如表达牛生长激素的转基因猪生长速度比对照组快10%-15%，饲料报酬提高16%-18%，胴体中脂肪下降80%。病毒衣壳蛋白基因被导入家畜基因组后，当这些基因表达时，机体可产生抗病毒抗体，提高家畜对这些疾病的抵抗力。转基因技术在家畜中的另一重要用途是把药用蛋白或营养蛋白基因与组织特异性表达调控元件藕联，运用家畜的造血系统或泌乳系统生产药用或营养蛋白质，提高畜牧业经济效益。此外，人们还正在探索用转基因猪的器官作人类器官移植的供体，以解决器官移植过程中供体相对不足的问题。

2、简述哪些科学技术的发展促进了基因打靶小鼠的出现？

◆答：①是胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)分离的成功,并证实了这种细胞还能重新加入处于胚泡阶段发育

②是发现在哺乳动物细胞中,外源的DNA可以与内源基因组DNA中的同源区域之间发生重组(这种重组现象可称之为定点整合,也有人称之为基因打靶)

③是证实了可将存在于ES细胞中的突变基因引入活体动物,并通过生殖系向后代传递

④是正负选择系统的应用,使小鼠ES细胞中的内源基因的定点突变在技术上变得可行。

3、基因动物制备突进和方法有哪些，各自有何优缺点？

◆答：DNA显微注射Injection of DNA into pronucleus of fertilized mouse egg

胚胎干细胞技术Transfection of ES cells with DNA constructs and injection of ES cells into blastocyst embryo

逆转录病毒介导的基因转移Viral infection of fertilized egg or blastocyst embryo

精子作为载体Sperm vector

核转移技术（克隆）somatic cell nuclear mediated gene transfer.

◆

4、简述转基因小鼠鉴定方法。

答：

1) 外源基因整合检测

a) Dot blotting(无同源性时可选用）

b) PCR（快速灵敏）

c) Southern blotting(准确可靠）

2) 整合位点检测（ＦＩＳＨ／ＬＭ－ＰＣＲ）

3) 整合拷贝检测（Southern blotting）

4) 转录水平

a) Northern blotting

b) RT-PCR

c) RＮase 保护性分析

5) 翻译水平（Western/Elisa)

6) 生化分析

7) 表型分析

5、论述转基因及基因打靶小鼠的遗传修饰策略。

◆答：（1）转基因的遗传修饰策略

1.一般转基因表达载体设计

2.条件性转基因表达载体设计

3.细菌人工染色体(BAC)转基因表达载体设计

（2）基因打靶小鼠的遗传修饰策略

1.完全基因剔除(knockout)

2.条件性基因打靶(conditional gene targeting)

3.Knock in

4.Gene trap

5.大片段染色体重排和删除

6、小鼠为何成为最重要的模式生物？

◆小鼠典型哺乳动物代表之一，作为重要的模式生物有着无可替代的优势。

首先，从进化的角度上来看小鼠作为哺乳动物的代表有其不可动摇的地位。除了小鼠以外的其他模式动物都至少在2.7亿年前就在进化上与人类走到了不同的分支，而小鼠在6千万年前还和人类共同拥有一个祖先。在2002年小鼠基因组的测序工作初步完成时，研究者们分析了96% 小鼠基因组序列。在这其中有99%的基因能在人的基因组序列中找到同源序列，证实了小鼠与人类在基因水平上的高度同源。

其次，小鼠的生理生化指标及其调控机制和人类相同或相似，因此小鼠的研究成果就有很大

的可能性是可以推演到人类，所以对小鼠进行研究的有很大的应用价值。

再次，和狗、猴等大型哺乳动物相比，小鼠的繁殖能力强，生殖周期短。

◆有以下两个原因：

1.小鼠有19对常染色体和1对性染色体，比较基因组研究表明人类90%以上基因在小鼠有DNA序列高度保守的同源基因,提示小鼠基因组学研究对人类基因功能研究的重要性，生理生化特性生长发育过程及疾病发生机制和人类相似,所以小鼠的结果可能为相关的人类生理和病理现象提供重要线索。

2.小鼠的遗传学背景已研究得比较清楚，小鼠基因组已基本完成测序，种类繁多的近交系小鼠为突变基因定位及多基因性状分析提供了有效工具，目前已经建立了极为有效的小鼠基因组改造技术(转基因和基因打靶技术)。

所以小鼠成为最重要的模式生物。

◆

1.生理生化特性生长发育过程及疾病发生机制和人类相似,所以小鼠的结果可能为相关的人类生理和病理现象提供重要线索

2.比较基因组研究表明人类90%以上基因在小鼠有DNA序列高度保守的同源基因,提示小鼠基因组学研究对人类基因功能研究的重要性

3.种类繁多的近交系小鼠为突变基因定位及多基因性状分析提供了有效工具

4.小鼠基因组已基本完成测序

5.建立了极为有效的小鼠基因组改造技术(转基因和基因打靶技术)

7、论述转基因动物技术在生物医学农业上的应用

◆转基因动物技术在生物医学农业上的应用主要有以下几个方面：

研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。

建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。

改善动物生产性能，提高动物育种效率。

作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。

异种器官移植。

改良和培育动物新品种

◆在生物医学领域的应用

转基因动物在医药领域的应用目前主要有2个方面：建立人类疾病的动物模型和器官移植的动物供体。

通过精确地激活或增强某些基因的表达制作各种人类遗传疾病的动物模型，其研究结果具有较高的真实性，可用于诊断、治疗和新药筛选。同时利用转基因动物可建立敏感动物品系及与人类相同疾病的动物模型，可用于药物筛选。其具有准确、经济、方便、迅速等优点，已成为人们快速筛选新药的手段。如癌症，镰刀状细胞贫血、地中海贫血、肝炎、免疫缺陷、透纳氏症和老年痴呆等疾病均已建立相应的动物模型．这些模型的建立能帮助人们认识其发病机制和发展过程，为治疗提供试验依据。

转基因动物可以用于人体器官移植。目前最理想的供体来自转基因猪。中国科学院遗传发育所等单位合作研究了转有人类DAF和CD59基因的转基因猪。并在灵长类动物上进行异种脏器移植试验获得成功。转基因动物还可用于进行异种细胞核移植、生物反应产生药物和营养保健品等。特异种细胞尤其是猪细胞，移植到合适的位点，将使人类实现细胞治疗成为可

能。

另外．据美国商业研究所报道。运用转基因动物作为生物反应器生产营养医用蛋白具有巨大的经济价值和市场潜力，也成为近年来生物技术开发的热点。我国先后获得了能够在乳腺中表达多种药用蛋白或营养保健蛋白的转基因牛、绵羊和山羊，总体技术能力基本达到发达国家的先进水平。

在农业上的应用

转基因动物在农业领域的应用主要表现在提高动物生长率方面。1985年中国科学院水生生物所的朱作言等首次用人类生长素(hGH)构建了转基因鱼。F1代转基因鱼类的生长速度为转基因鱼的2倍。1990年中国农业大学培育的转基因猪，生长速度超出对照组40％。1998年美国培育出IGFl转基因猪群，其脂肪减少10％，瘦肉率增加6％～8％。转基因技术不仅可以培育出体积大、生长快的动物，还可以培育出微型动物。2000年，Uchidal等研制出微型猪。生长快、易处理、饲料成本低，使其更加适用于药物筛选和疾病研究。此外，转基因动物在提高动物产毛性能、提高动物不饱和脂肪酸含量、提高动物抗寒抗病能力、改变牛奶成分等方面均有重要意义。

8、为什么转基因动物乳腺生物反应器制药将成为最主要的基因工程制药技术？

◆就基因药物而言，最理想的表达场所是乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理代谢反应。从转基因动物的乳汁中获得目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。因此又称为动物乳腺生物反应器。所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量很高的动物就相当于一座大型药物工厂，细菌基因工程需要很大的发酵车间，细胞基因工程也需要很多昂贵的设备来培养细胞。而若用转基因动物，就只需要养或牛、羊等动物即可。

利用转基因动物-乳腺生物反应器来生产基因药物是一种全新的生产模式，与以往的制药技术相比，具有不可比拟的优越性。哺乳动物乳腺生物反应器好比在动物身上建“药厂”，从动物的乳汁中源源不断获得目的基因的产品，它的优越性还表现在产量高，易提纯，表达产物已经过充分修饰和加工，具有稳定的生物活性。另外，作为生物反应器的转基因动物又可无限繁殖，故具有投资成本低，药物开发周期短和经济效益高的优点。

◆(1)产出高产品活性高

乳腺组织是一种高效的产奶器官，一头奶牛一年可产奶8000～10000升，而一只绵羊和山羊也可产奶800～1000升，以最低表达量1克/升的重组蛋白计算（即转基因动物奶液中重组蛋白的含量，一般为1～20克/升），一头奶牛一年就可生产8～10公斤重组蛋白，而哺乳动物细胞培养系统重组蛋白表达量为0.1～1克/升，一头奶牛重组蛋白年产量相当于1000升的发酵罐；而且动物乳腺生物反应器可以生产结构复杂分子量大的蛋白，而且生产的重组蛋白药物生理活性好，与人同源性高，非常接近天然产品。

(2)成本低、周期短

由于动物乳腺生物反应器生产重组蛋白不需要昂贵的生产设备（如发酵罐），动物饲养和繁殖成本都比较低，国外经济学家曾算过一笔账，若用其他生产工艺（如哺乳动物细胞培养方法）来生产1克药物蛋白质，成本需800～5000美元，而利用转基因动物只需0.02～0.5美元；目前一种新药由研制开发到上市，需15～20年，转基因动物制药则可缩短到5年。(3)不耗能、无污染

该技术基本上为一畜牧业过程，虽饲养环境要求特别洁净，但仍是给牛羊草料，由牛羊奶中提取药品，因此蛋白生产过程不需昂贵设备，不消耗能源，不会产生工业废料，也不会对环境产生污染，因此动物乳腺生物反应器制药技术是一种可持续发展的新型生物制药技

术。

由于动物乳腺生物反应器制药技术具有如此巨大的优势，将成为一种产业化潜力巨大的高新技术，也是国内外政府和企业的研究和开发热点。据美国红十字会预测，到2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额将达到350亿美元，生产的药物将占整个基因工程药物种类的90%以上。

9、论述基因打靶技术目前存在的问题。

◆基因打靶(gene targeting)也称为基因定点同源重组或基因敲除。它是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的一项技术。包含基因敲除，条件性基因打靶，Knock-in, Gene trap, 大片段染色体重排和删除。目前此技术存在的问题主要有：同源重组效率低，基因敲除导致胚胎致死性的可能，如何研究在成年小鼠中的基因敲除，如何研究组织特异性基因敲除等，另外，用常规方法进行基因打靶研究需耗费大量的时间和人力，现阶段可利用的组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠还十分有限，通常一个基因敲除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。

10、论述置换型载体与插入型载体的共同点与不同点。

◆置换型载体：又称Ώ型载体，在打靶过程中，将同源臂之间的序列通过同源重组插入到目的基因序列中从而使靶基因发生突变。

插入型载体：又称O型载体，在打靶过程中，整个载体序列通过同源重组插入到基因组序列中，使靶基因发生突变。

共同点：

结构元件基本相同，同源臂（长臂与短臂），长度大约5-8kb，筛选标记，promoter, PolyA; 在转染之前均需要线性化，因此在同源臂上至少需要一个单切酶点。

另外，两种载体在构建时，都应避免将正选择标记框插入到靶基因外显子两个编码密码子之间，若靶基因太小或者外显子太大应删除整个靶基因。

不同点：

1）主要不同点在于线性化位点不同，置换型在同源臂外侧线性化，插入型在同源臂内侧线性化。

2）置换型载体与目的基因有两个十字叉点，需经两次染色体交换，而插入型载体仅一次重组；

3）置换型载体只将同源区域内部的序列插入到靶基因中，而插入型则将整个载体都插入到靶基因序列中；

4）插入型载体在打靶时除形成同源重组基因外，还会形成一段目的基因的复制序列；

5）插入型载体大于置换型载体9倍，

6）置换型的正选择标记框在靶基因上游的外显子内，插入型的正选择标记框在同源臂内部或外侧均可；

7）插入型打靶效率较置换型高5-10倍，常用于点突变（hit and run），而由于易形成拓扑构型，因而人们更倾向于置换型载体。

◆通过特定的酶切位点允许外源DNA 片段插入的载体称为插入型载体，而允许外源DNA 片段替换非必须DNA 片段的载体，称为置换型载体。置换型载体与插入型载体的结构元件基本相同，而两者的主要不同点在于线性化位点不同，置换型在同源序列外测，而插入型在外同源序列内部。插入型打靶效率比置换型高5-10倍，但前者易形成拓扑构型，因而人们更倾向于置换型。

11、论述影响中靶效率的因素。

◆影响中靶效率的因素有：双链断裂区、载体类型（其中插入型载体比置换型载体的效率高9倍）、与打靶序列的同源性程度（这是最主要的因素）、打靶位点以及ES细胞周期。

◆1.双链断裂区

2.载体类型（插入型载体大于置换型9倍）

十字叉点：插入型1个，置换型2个，需经两次染色体交换

游离端：

同源区的打断

3.与打靶序列同源性程度：最主要因素

4.打靶位点

5.ES细胞周期

◆

1.插入型载体: 又称O型载体，在打靶过程中，整个载体序列通过同源重组插入到基因组序列中，使靶基因发生突变。

2.与Ω型载体结构元件基本相同，主要不同点在于线性化位点不同，置换型在同源序列外测，而插入型在外同源序列内部

3.插入型打靶效率比置换型高5-10倍，但前者易形成拓扑构型，因而人们更倾向于置换型

12、简述如何解决基因打靶技术存在问题的策略。

◆面临的问题主要有：当被敲除的基因X是胚胎致死型时，该如何做？下面是一个具体案例。淋巴细胞抗原受体基因座位经常发生突变和基因重组以保证机体对外源抗原的免疫性。但为了保证基因组结构的稳定性，ＤＮＡ聚合酶β(Polyβ)基因的表达产物参与ＤＮＡ的修复作用，如果使Polyβ基因失活则早期胚胎出现死亡，观察不到效果，然而采用可控重组技术则可以将该问题迎刃而解。

利用同源重组技术构建含有两个ＬoxP位点的Polyβ基因的转基因动物。研究发现插入的两个LoxP位点对Polyβ基因的表达和活性无任何不良影响。选择具有LoxP-Polyβ-LoxP 和无Polyβ的杂合体，然后与含有Ｔ细胞特异性表达Cre基因的转基因动物杂交，所产生的后代仅在Ｔ细胞内产生缺失纯合体；其它组织和器官中无任何变化。

◆目前基因打靶技术存在的问题是命中率低。

提高基因打靶效率的方法：

1、尽量采用与靶细胞相同品系的基因片段作为同源片段，以避免因不同品系动物基因组中存在的遗传异质性(或部分碱基的差异)而带来的影响。

2、通过修饰打靶载体可提高基因打靶效率或降低随机整合。目前有两种方法可以使用。一种方法是在线性化DNA的3’末端加入双脱氧核苷酸。第二种提高打靶效率的方法是在载体的末端造成几百个核苷酸长的单链尾巴。

3、通过提高基因转染效率和优化培养条件来提高打靶效率。用不含标记基因的方法来筛选同源重组克隆，可大大提高同源重组的效率。

4、在同源重组附近引入双链断裂可提高同源重组效率。实验表明，染色体外重组反应中，若在一个DNA分子的同源序列附近引入双链断裂，可以提高同源重组效率约10倍。

5、设计RNA/DNA寡核苷酸进行定位打靶以提高基因打靶的效率。

13、解释什么是近交系，重组近交系，重组同类系，同源突变近交系和同源导入近交系；

并列举几个用近交系做实验的优点和缺点。

◆近交系：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配与全同胞兄妹交配有等同效果。近交系的近交系数（inbreeding coefficient）应大于99%。

重组近交系（RI）：由两个近交系杂交后，经连续20代以上兄妹交配育成的近交系。

重组同类系（RC）：由两个近交系杂交后，子代与两个亲代近交系中的一个近交系进行数次回次（通常回交2次），再经无对特殊基因选择的近亲交配而育成的近交系。

同源突变近交系：两个近交系，除了在一个指明位点等位基因不同外，其他遗传基因全部相同，简称同源突变系。同源突变系一般皆由近交系发生基因突变而形成。

同源导入近交系：通过杂交-互交（cross-intercross）或回交（backcross）等方式将一个基因导入到近交系中，由此形成的一个新的近交系与原来的近交系只是在一个很小的染色体片段上的基因不同，称为同源导入近交系（同类近交系），简称同源导入系（同类系）。

近交系做实验的优点：

1．具有相同的基因型，表现型也一致，所以其反应是一致的，实验结果正确、可靠。由于连续近交繁殖，同一近交系的各个体具有相同的基因型，在相同的环境条件下又具有相同的表现型，故其性状即其各种生物学特性比较一致，对外来刺激反应也一致。

2．各品系均有其独特的特性，根据实验目的可选用不同品系来作实验，实验重复性好，所用动物少，实验周期短，节省人力、物力和时间。

3．国际上分布广泛，不同国家的科研单位由于使用同一近交系动物所取得的结果是相似的，便于国内和国际间学术交流和实验重复。

4．可以作为有价值的病理学模型，如有致癌品系、抗癌品系、致白血病品系，嗜酒性品系、易抽搐品系等，是研究人类疾病的重要实验材料。

5．它是标准的实验材料，动物生长发育到一定时间就有一定的规格。

6．有大量的历史资料可查，每个品系均有其详细的遗传学资料，遗传背景明确，其生物学特性、生理生化特点、常见疾病（包括自发性疾病）等都有过系统的研究，便于研究者查阅和选择应用。

缺点：

在近亲繁殖的实践中，通常伴随着遗传缺陷的出现。生命早亡较多，动物体质普遍较差，并且较为容易感染疾病，生产能力减退和隐性基因暴露增多，这个现象叫“近亲衰退”。

◆

1.近交系（inbred strain）：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配与全同胞兄妹交配有等同效果。

2.重组近交系（RI）：由两个近交系杂交后，经连续20代以上兄妹交配育成的近交系。

3.重组同类系（RC）：由两个近交系杂交后，子代与两个亲代近交系中的一个近交系进行数次回次（通常回交2次），再经无对特殊基因选择的近亲交配而育成的近交系。

4.同源突变近交系（coisogenic inbred strain）：两个近交系，除了在一个指明位点等位基因不同外，其他遗传基因全部相同，简称同源突变系。同源突变系一般皆由近交系发生基因突变而形成。

5.同源导入近交系（congenic inbred strain）：通过杂交-互交（cross-intercross）或回交（backcross）等方式将一个基因导入到近交系中，由此形成的一个新的近交系与原来的近交

系只是在一个很小的染色体片段上的基因不同，称为同源导入近交系（同类近交系），简称同源导入系（同类系）。

14、简述治疗性克隆的概念和意义。

◆治疗性克隆治疗性克隆指把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种方法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体。运用克隆技术获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是为了提取全能型的胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括大脑、肌肉、血液和神经，这些器官组织将用于医疗。

意义：目前已报道，将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症，将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者. 从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞，移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应. 另一方面，每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植，由于胚胎干细胞可以无限传代，在数量上可以保证治疗的需要，从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题，为人类健康和长寿提供了新的希望.

◆治疗性克隆（therapeutic cloning）是指将病人体细胞核移植到去核的卵母细胞中，在核重新编程(reprogramming)后，供体体细胞核重新获得发育的全能性，并可启动胚胎发育，产生携带有病人基因组的多潜能干细胞；然后，经诱导分化成各种类型的替代细胞，来修复损伤组织或器官的过程.

治疗性克隆代表着解决疾病组织替代问题的一个新方法。如果这一设想能够变为现实，将是人类医学中的一项跨时代的成就，它将使器官培养工业化，解决供体器官不足的问题；器官供应专一化，提供病人特异性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现故障，将像更换损坏的汽车零件一样可随意更换和修理。相信随着人们观念的改变，逐步认识到hES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用，科学家们会攻克hES细胞的特异性分化等难题，必将会在人类医学和生物学领域产生一场革命。

15、通过本学期的学习，对于转基因动物有何认识。

◆

1.分子生物学和遗传学及基因工程技术、动物胚胎技术的发展拉开了转基因动物技术的序幕！

2.核移植技术、RNAi、位点特异重组酶系统和转座子系统则为转基因动物研究开辟了更广阔的应用前景。

3.转基因动物研究将对解释生命奥秘,改进人类健康产生重要影响.

◆

转基因动物是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代．应该谨慎有利但也有弊。胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴

藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。

◆所谓转基因动物，是用实验方法，把外源基因导入到动物体内，这种外源基因与动物本身的染色体整合，这时外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给后代。随着重组DNA技术的迅猛发展，转基因动物技术的研究取得了一系列可喜的进展与成果。从最初的细菌工程逐步发展的到转基因细胞，直至产生转基因动物。主要有5种研究方法：1、逆转录病毒感染法2、显微注射法3、胚胎干细胞法4、精子载体法5、体细胞核移植技术。广泛应用于1、构建人类疾病模型2、作为生物反应器3、生产人体的器官4、改良动物品种及其生产性能。存在问题：效率低、在宿主基因组中的行为难以控制、表达水平低、基因整合机制不清楚。安全性问题：1、具有某些优势性状的转基因动物可能会对生态平衡及五中多样性产生不良影响2、转基因动物器官移植可能会增加人兽共患病传播机会3、用转基因动物生产的十五可能发生过敏反应4、伦理问题。

16、打靶载体的构成，有几种类型，区别是什么，有何设计原则。

◆答：(1)插入型载体

•又称O型载体，在打靶过程中，整个载体序列通过同源重组插入到基因组序列中，使靶基因发生突变。

•与Ω型载体结构元件基本相同，主要不同点在于线性化位点不同，置换型在同源序列外测，而插入型在外同源序列内部

•插入型打靶效率比置换型高5-10倍，但前者易形成拓扑构型，因而人们更倾向于置换型

（2）置换型载体

部分内源DNA序列可被外源DNA序列替换的克隆载体。

设计插入型载体原则

•同源臂为5-8KB

•正选择标记框可在同源区内或外

•若载体中同源序列仅含有一个外显子应避免将正选择标记框插入到靶基因外显子上

•若靶基因太小或者外显子太大应删除整个靶基因

•打靶载体在转染细胞前要线化，因而在同源臂上至少有一个单切酶点

•不要选用基因的第一个和最后一个外显子序列作为打靶载体的插入点

置换型载体设计原则

•同源臂为5-8KB

•正选择标记框应插在靶基因上游的外显子内

•应避免将正选择标记框插入到靶基因外显子两个编码密码子之间

•若靶基因太小或者外显子太大应删除整个靶基因

•若用PCR方法筛选中靶的棵隆，打靶载体短臂应为0.5-2KB

打靶载体在转染细胞前要线化，因而在同源臂外侧至少有一个单切酶点

17、简述Cre/LoxP系统的作用原理，并举例说明其应用。

◆百度知道：Cre-loxp 是一个基于传座效应的DNA片段同源重组系统。Cre是一个酶，可以识别一段DNA序列中相邻的两个loxp片段，并将两个loxp间的DNA序列剪切，在原位点上只留下一个loxp，也可在两段都带有两个相邻loxp序列的DNA序列间介导同源重组，达到交换DNA片段的目的。

应用:

General knock-out

Inducible knock-out

Tissue-specific knock-out

Removal of selection marker gene

◆Cre/lox重组系统主要通过Cre 重组酶对lox 序列进行切割和重新连接, 介导lox 序列发生特异性重组。Cre 重组酶通过一定的途径被激活后, 即可通过诱导型启动子诱导, 专一性地识别34 bp 的lox 位点, 进而同向lox 位点之间的全部DNA 序列会由于发生重组而被剔除。例如，将Cre/lox 重组系统应用在烟草上的技术已经成熟, 利用Cre/lox 位点特异性重组系统转化烟草, 导入Cre 重组酶基因后剔除了筛选标记基因,通过植株开花后自交又使重组酶发生分离而获得无选择标记基因的植株。

18、什么是胚胎分割？胚胎分割的获得效率受哪些因素影响？

◆胚胎分割，是指利用初期胚胎的细胞具有很高的全能性，能够发育成完整个体的原理，采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术，其来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，拥有相同的优良性状。

影响胚胎分割的获得效率的因素主要有：

1）初期胚胎的质量；2）分割的方法，手术法/非手术法是否成熟，简便、快速；初期胚胎的时期，如晚期桑椹期，胚泡期；3）分割胚的培养；4）分割胚的移植效率

◆胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到，细胞的数目是有限的，分割的分数越多，技术的难度就越大，越是均等的分割细胞，越对细胞的分割效率越好。

19、转基因植物受体系统有哪些，各有何优缺点？

◆1：植物组织受体系统，该受体系统转化率高可以获得较多的转化植株，取材广泛，适用性强，但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

2：原生质体受体系统：在体外比较容易完成一系列细胞操作或者遗传操作，相互之间可以发生细胞融合，还可以高效的捕获外源基因，嵌合体少，缺点遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。

3：生殖细胞受体系统：优点，具有全能的生殖细胞，具有更强的接收外源的DNA的潜能，利用植物自身的受粉过程，具有操作方便，简单，缺点是受到季节的限制，只能在短暂的开花期进行，无性繁殖的植物不能采用。

4：叶绿体转化系统：优点：便于外源基因的定位整合，基因多为多拷贝，表达量高，导入的外源基因形状稳定性高，能直接表达原核基因。

◆

（1）植物组织受体系统：该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

（2）原生质体受体系统：在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成

完整植株的能力，具有全能性。在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。但缺点是遗传稳定性

差，培养周期长，难度大，再生频率低。

（3）生殖细胞受体系统：优点如具有全能性的生殖细胞直接为受体

细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。

（4）叶绿体转化系统:外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达，而且

还具有许多优点：1)便于外源基因定位整合2）基因为多拷贝，表达量高3）导入的外源基因性状稳定性高4）能直接表达原核基因

◆

1) 植物组织受体系统：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

2) 原生质体受体系统：是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。但缺点是遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。

3) 生殖细胞受体系统：它是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两条途径利用生殖细胞进行基因转化：

一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，诱导愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化系统；

二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点，如：具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。

4) 叶绿体转化系统：外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达，而且还具有许多优点：

a) 便于外源基因定位整合

b) 基因为多拷贝，表达量高

c) 导入的外源基因性状稳定性高

d) 能直接表达原核基因

20、外源基因导入植物的方法有哪些，各有何优缺点？

◆（一）DNA直接转移法

1.化学刺激法:此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。

2.电击法:已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。

3.显微注射法:其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，

核移植及细胞器的移植方面应用很多，植物细胞在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。

4.基因枪法：优点：(1)无宿主限制。(2)靶受体类型广泛，不受组织类型限制。(3)可控度高。

(4)操作简便、快速。缺点：(1)不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。(2)基因枪价格昂贵、运转费用高。

5.脂质体介导法：该方法具有许多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。

6.微激光束法：可在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，使细胞壁被击穿，外源DNA进入受体细胞。

7.花粉管通道法：这一方法的建立开创了整株活体转化的先例，可以应用于任何开花植物。（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化

优点：该方法稳定性、重复性好，设备简单，操作方便，故应用广泛。但缺点是转化频率低。

◆

1.化学刺激法：植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。

2.电击法：首先是将原生质体在溶液中与DNA混合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。

3.显微注射法：显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。

4.基因枪法：克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达。这一方法要使用一种防枪结构的装置——基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小孔，弹头不能通过。其具体操作是将直径4um左右的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。

5.脂质体介导法：脂质体是由磷脂组成的膜状结构，将磷脂悬浮在水中，在适当条件下，受到高能声波处理时，磷脂分子群集在一起形成密集的小囊泡状结构，称为脂质体。用脂质体包裹一些DNA、RNA分子就成了一种人工模拟的原生质体，它的外膜相当于人造的细胞质膜。然后与植物原生质体共保温，于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA导入植物的原生质体。这种方法具有许多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。

6.微激光束法：是利用激光脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。可在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，使细胞壁被击穿，外源

DNA进入受体细胞。

7.花粉管通道法：这种方法最早是由周光宇1983年建立。花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞，转化率高达10%。这一方法的建立开创了整株活体转化的先例，可以应用于任何开花植物。

21、转基因食品安全的检验的五项原则

◆根据转基因食品及同类传统食品两者的特性表现及成分进行分析比较：Substantial equivalence 实质等同性原则（即生物技术产生的食品及食品成分，如果与一种现有的食物或食物成分在实质上是相当的，则可以认为是安全的。）

包括五项原则

(1)如果两者本质是相同的，用传统的安全性评价程序对转基因食评价。

(2)如果在一定范围内有差别，用集中于对产生差别的因子进行评价。

(3)如果氨基酸序列与已知蛋白毒素的氨基酸序列是同系物，则要进行毒理学实验。

(4)如有蛋白质产生了抗营养作用，或营养成分发生改变，则要进行营养学评价。

(5)如果两者完全不同或没有可比的传统食品，则要特别设计动物模型试验证明其无毒后，还须进行人体营养学试验。

22、转基因食品的安全性问题？

◆转基因食品就是利用基因工程方法将有利于发挥某种优势的外源基因转入受体生物体内，改变其遗传组成，使其获得原先不具备的品质与特性，从而生产出的食品。无论从生物技术的角度（核酸和蛋白质水平分析）还是生态角度来看，转基因食品的安全性是受到质疑的，主要问题在以下方面：

1）食物安全性因素

（1）转基因产物的直接影响：包括营养成分、毒性或增加食物过敏性物质的可能；

（2）转基因间接影响：经遗传工程修饰的基因片段导入后，引发基因突变或改变代谢途径，致使其最终产物可能含有新的成分或改变现有成分的含量所造成的间接影响；

（3）植物里导入了具有抗除草剂或毒杀虫功能的基因后，它是否也象其他有害物质一样能通过食物链进入人体内；

（4）转基因食品经由胃肠道的吸收而将基因转移至胃肠道微生物中，从而对人体健康造成影响

2）环境安全性因素

（1）转基因生物对农业和生态环境的影响；

（2）产生超级杂草的可能；

（3）种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产生更加难以消灭的“超级害虫”；

（4）转基因向非目标生物漂移的可能性；

（5）其他生物吃了转基因食物是否会产生畸变或灭绝；

（6）转基因生物是否会破坏生物的多样性等。

目前对转基因食品的安全性检测遵循“实质等同性原则”，即生物技术产生的食品及食品成分，如果与一种现有的食物或食物成分在实质上是相当的，则可以认为是安全的，评价时注重“个案分析”，当转基因食品不能证明与对应的参照食品实质等同时，要做进一步的毒理

学试验。

◆转基因食品顾名思义，就是利用基因工程方法将有利于发挥某种优势的外源基因转入受体生物体内，改变其遗传组成，使其获得原先不具备的品质与特性。

转基因食品的特点在于改良和培育新产品，促进快速生长，缩短育种年限，提高产量和质量，增强抗逆性(抗旱、寒、涝、热、病毒和虫害等)，大大降低成本，产出口味更佳的食物。

转基因食品的安全性问题主要体现在以下两个方面：食物安全性问题和环境安全性问题。食物安全性主要包括：①转基因产物的直接影响：包括营养成分、毒性或增加食物过敏性物质的可能；②转基因间接影响：经遗传工程修饰的基因片段导入后，引发基因突变或改变代谢途径，致使其最终产物可能含有新的成分或改变现有成分的含量所造成的间接影响；③植物里导入了具有抗除草剂或毒杀虫功能的基因后，它是否也象其他有害物质一样能通过食物链进入人体内；④转基因食品经由胃肠道的吸收而将基因转移至胃肠道微生物中，从而对人体健康造成影响。

环境安全性主要包括：①转基因生物对农业和生态环境的影响；②产生超级杂草的可能；③种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产生更加难以消灭的“超级害虫”；④转基因向非目标生物漂移的可能性；⑤其他生物吃了转基因食物是否会产生畸变或灭绝；⑥转基因生物是否会破坏生物的多样性等。

而与以上安全性问题相对的，转基因食品存在的最大理由则是：转基因食品并不会比常规育种有更多的危险，恰恰相反，更大的危险是世界上60亿人口中还有12亿人仍在温饱线上挣扎。

作为消费者，不应盲目追从或者排斥转基因食品，就像人大代表、“杂交水稻之父”袁隆平讲的：“我们不能将转基因食品一棍子打死，认为转基因食品都是坏的，有部分转基因食品并没有毒性，不能一概认为都是有问题的。”我们应该在转基因食品增大透明度的前提下，理性看待转基因食品。

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（一）从生物技术的角度来分析

首先，当外源基因随机插入宿主DNA时，会对插入位点处的基因进行重新编码，重新定位高达40000个DNA碱基对，这会影响外源基因自身以及宿主基因的功能。以一个微阵列基因芯片为研究对象，研究人员发现插入一个单基因后，5%的宿主基因发生了表达水平的变化以及发生了很多无法预期的突变。在转基因食品中，这些突变可能会对健康产生负面影响。其次，目前几乎所有的转基因食品都被设计成启动子能永久性地开启插入的外源基因的表达，虽然科学家宣称这些启动子仅能开启外源基因的表达，可是并不能排除它也同时能永久性地开启一些宿主基因的表达。而这些宿主基因可能编码一些反应原、毒素和致癌物，或者是阻滞其它一些基因的表达。如果一个病毒能影响生物，它们就会插入宿主DNA中，并且，这些嵌入的病毒序列可以传递给后代，甚至遗传给后续的物种。尽管有些病毒没有被开启表达（它们被称作休眠病毒），但是当转基因食品的启动子插入到休眠病毒基因附近时，就有可能会开启它们的表达，从而导致病毒的形成和一些潜在的突变。

再次，启动子可能会产生突变，并带来遗传不稳定因素，如花椰菜花叶病毒启动子。在大多数转基因食品中使用的花椰菜花叶病毒启动子，具有一些重组热点，这可能会导致基因序列的断裂和重组，这些插入基因的不稳定因素会导致不可预期的结果。

最后，在植物DNA中，转座子具有不稳定性，能从一个位置转移到另一个位置，并可以导致突变，而转基因食品的组织培养过程能激活转座子，导致基因组范围内的突变。此外，在商品化的转基因食品中转基因都倾向于插入到转座子的附近，这些插入位点可能会改变插入基因的表达。