基因打靶技术及其应用前景

基因打靶技术及其应用前景

摘要: 基因打靶技术是一项新兴的分子生学技术,综述了基因打靶技术的原理、操作以及应用与研究进展。

关键词:基因打靶;同源重组;打靶载体;打靶效率;筛选系统

基因打靶是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用基因转移的方法,将外源DNA序列导入靶细胞后,通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组,将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点,或对某一预先确定的靶位点进行定点突变,从而改变细胞遗传特性的方法[1]。作为一项新兴的技术,基因打靶有着其无可比拟的优点:基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞,也可以是真核细胞;基因打靶能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上;在设计合理的情况下,基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造;基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制[2]。目前,基因打靶技术已应用在改造生物,培育新的生物品种,研究基因结构与功能、表达与调控,研究细胞生活周期调控机制,遗传病的基因治疗等方面。尽管还存在着一些技术问题,但随着研究的深入,基因打靶技术正在不断发展与完善。

1基因打靶技术的原理

进行基因打靶,首先要设计和合成一个靶载体。该载体不仅含有需要插入的DNA序列,其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段,即同源重组指导序列[3]。将此载体用基因转移的方法导入靶细胞。通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞特定的基因座上。同源重组的分子机制目前尚未阐明,但已相继提出了多种解释同源重组的模型,其中Meselson—Radding 模型不仅可以解释交互重组的现象,而且还可以圆满地解释基因转变现象,因此被广泛接受[4-6]。但Szostak 等提出的双链断裂修复模型(DSBR)能更好的解释双链断裂可以大大提高同源重组的效率这一现象[7]。

2基因打靶的操作

2.1基因打靶载体的构建

基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列,其中同源序列是同源重组效率的关键因素,基因打靶载体的同源重组序列一般可通过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到,也可以利用PCR 对基因组目标的DNA序列进行扩增得到[8]。

基因同源重组的发生依赖于同源序列的长度,目前认为30～40 bp的同源序列长度将是同源重组发生的保险线。实验表明,在哺乳动物细胞内,当同源序列长度在295～1 800bp之间时,重组率与同源序列长度呈正比,当同源序列长度在200bp以下时,重组效率明显降低。这对选择合适的同源重组指导序列长度具有重要的指导意义[9]。一般情况下,同源重组指导序列为基因组DNA而不用cDNA,以免造成基因组缺失或形态改变。

基因打靶载体有基因插入型载体和基因置换型载体2种类型。插入型载体与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因的外侧,线性化后,同源重组使染色体DNA序列被靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采取置换型载体进行基因打靶。

外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等[10]。目前应用最广泛的是显微注射法。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力,可用于时空特异性的基因打靶,在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。

2.2受体细胞转化

由于在同源序列附近的DNA有双链断裂能促进同源重组,因此在完成打靶载体的构建后,以限制性酶线性化载体并已去除质粒部分,用电穿孔、显微注射、DNA—磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导等方法把上述重组DNA片段转入受体细胞核内[11]。

2.3筛选

基因打靶的筛选系统多种多样,现今采用的一般有:①选择标记基因定点突变的筛选;②正向选择法;③无启动子筛选法;④正负筛选法。这里主要介绍正负筛选法[12]。

用选择培养基筛选已击中的细胞,筛选通常使用正、负选择法。构建载体时,在靶基因的同源序列中插入正选择标记,在同源序列之外的γ末端,甚至γ和ζ 2个末端接上负选择标记。转化受体细胞的过程中如果所导入的重组DNA与受体细胞基因组DNA发生非同源重组,则外源基因通常是从头至尾均整合进入受体细胞基因组中,此时正、负筛选标记基因同时表达,若为同源重组,外源目的基因及

正选择标记会整合到受体细胞基因组同源序列的基因座上,而位于同源序列外端的负选择标记基因则在重组后丢失[13,14]。因此时仅有正筛选标记基因表达。例如,实验室常以新霉素抗性记忆(neo’)为正标记基因,以单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)作为负筛选基因,以药物G418和GANC(丙氧鸟苷)作双重选择,其中neor基因的产物使细胞具有G418抗性,而HSV-tk基因的产物则使丙氧鸟苷变成毒性核苷酸,从而致死[15]。用G418筛选所有能表达neor基因的细胞,然后用GANC淘汰所有HSV-tk正常表达的细胞,剩下的细胞即为命中的细胞。

2.4鉴定

观察被击中细胞的生物学特性,并进行分子生物学检测。可以用特异PCR的方法鉴定,即:PCR引物一端以基因组DNA的特定基因座为模板,另一端以导入的外源基因为模板,这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。对经PCR 鉴定的克隆用Southern杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆[16]。

3基因打靶技术的应用与研究前景

3.1基因功能和基础理论研究方面

首先,基因打靶通过定点改造基因组中的特定基因,有可能在细胞水平上研究特定基因的功能和调控机制。从定点突变的干细胞获得突变基因型个体,为在生物体整体水平了解基因的胚胎发育和生理功能提供了可能。

3.2分子免疫方面

可用基因打靶观察某一基因对免疫细胞发生发展的影响。例如,Manjunath等(1993)用基因打靶技术破坏了CD43基因,结果提高了T淋巴细胞的粘附性,为进一步观察和探讨一些免疫机制奠定了基础。

3.3病理模型方面

自Garrd发现Alkaptonuria遗传病以来,研究者们发现,许多遗传病都是由单个基因突变引起的。用基因打靶技术对小鼠或其他哺乳类动物中此类单基因进行定点突变,就可为人类该基因缺陷或突变所致的遗传病建立精确的动物模型,为了解这些遗传病的病理生理生化特性及寻找适当的药物和治疗手段奠定基础。到目前为止,已得到Lesch-Nyh-ansyndrome、Cysticfibrosis和Gaucheris等多种病理模型。例如,构建定点突变的小鼠凝血因子IX胚胎干细胞(ES)基因打靶载体,在小鼠IX因子基因第8外显子中分别引入3个突变,构建置换型打靶载体转染ES细胞,经药物筛选后,挑取抗性细胞,这种体外定点突变系统可对大基因进行精细地修饰,

为建立更精确的模拟人类疾病的动物模型奠定基础。

3.4基因治疗方面

据统计,到1998年为止,正在进行的临床基因治疗方案有278项。但是,近年来的研究表明,外源基因的导入有可能导致一些与预想目的相悖的结果,如使正常基因失活或激活原癌基因等。因此,要利用基因打靶技术用于疾病治疗,造福人类,还需要不懈的理论研究和实践检验[17]。

3.5转基因动植物和生物反应器方面

转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动植物体内,使外源基因与动植物本身的基因整合在一起,实现体内表达,从而培养出转基因动植物的技术。其特点是可以使动植物增加某一功能或某一产物,但是,由于转基因在动植物细胞基因组中的整合是随机性的,因此,它的发展和应用受到了一定的限制。如果应用基因打靶技术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中,定点改造原有基因的功能,可使转基因动植物和生物反应器的研制更为精确。

基因打靶技术是近10余年发展起来的分子生物学技术,它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组图谱的完成、功能基因组学研究正大规模启动,基因打靶已经成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。因此,通过基因打靶将外源基因在ES细胞或体细胞中进行定点整合并高效表达、利用显微注射和核移植技术生产转基因动物等具有广阔的发展前景。

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