2016神经生物学实验讲义

徐州医科大学神经生物学实验讲义

实验一鼠脑灌注固定和取材

一、原理

固定是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持生物活性物质的活性；能使细胞内蛋白质、脂肪、糖、等各种成分沉淀而凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在生活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作用

容易染色；经过固定，使组织硬化，以利于以后切片时切薄片。

体循环：左心室→升主动脉→主动脉的各级分支→毛细血管

→各级静脉→上下腔静脉→右心房，完成体循环的整个循环。

二、实验步骤

1、正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，或昆明小鼠，20g左右，雌雄不拘；

2、动物麻醉后，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自胸骨剑突下腹部剪一小口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏，小心用镊子将心包膜打开；

3、将灌注针（大鼠12#，小鼠7#）插入左心室并送至升主动脉内，用止血钳把灌注针固定在心脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右心耳，使血液排出。先快速灌注0.9%NaCl（大鼠80-120ml，小鼠30ml），至肝脏逐渐变白色或右心耳流

出清亮液体为止，再灌注4℃预冷的固定液（大鼠200ml，小鼠50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；

4、固定液进入血管后，大鼠四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进入大鼠大脑，待抽动完全停止，全身组织器官变硬后即可停止灌注；

5、断头后，剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。

6、后固定（post-fixed）：剥出鼠脑后，切取含目的区域的脑段，放入相同固定液4～12h，4℃。

附4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛用0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容至1L，过滤后置于4℃保存。

实验二大鼠脑立体定位

一、目的和应用

脑立体定位仪是利用颅骨外面的标志或其它参考点所规定的三维坐标系

统，来确定皮层下某些神经结构的位置。它是神经解剖、神经生理、神经药理和

神经外科等领域内的重要研究设备，以便在非直视暴露下对其进行定向的刺激、破坏、注射药物、引导电位等研究。可用于帕金森氏病、癫痫、脑内肿瘤动物模

型建立，还可用于学习记忆，脑内神经干细胞移植，脑缺血等研究。

二、步骤

1、实验动物的选择：正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，雌雄不拘；

2、麻醉（anesthetized）：10%水合氯醛0.35ml/100g，i.p.；

3、定位：用耳棒和上颌固定器将大鼠头部固定在动物脑立体定位仪上（固定好

的标准：鼻对正中，头部不动，提尾不掉），调门齿杆的高度为﹣3.3mm，固定

好门齿，使前囟点（Bregma）和人字缝尖点（lambda）在同一水平面上；

4、碘伏消毒颅顶皮肤，根据所选区域切开皮肤，3%双氧水擦拭骨膜，清晰暴露

出前囟点；

5、将微量注射器夹持在固定器上，调节三维旋钮使其针头刚好接触Bregma点，此时读出三维坐标数值并记下，此为原点数值；

4、参照Paxinos and Watson（1986）的大鼠脑图谱，读出注射部位的三维坐标数值，在原点坐标三维值基础上加或减相应的数值（Bregma值为正就加，为负减；右侧加，左侧减；深度减），即得到一个最终定位的三维坐标值；

5、微量注射器吸入药液，调节前后和左右的旋钮使其针头刚好接触到颅骨，并

在此点做一标记，在此钻孔后，将注射器针头缓慢插入相应的深度；

6、缓慢注射液体，注射速度2μl/5min，注射后留针10～15min；

7、缓慢退针后，缝合皮肤，待其苏醒后放入笼中饲养；

8、根据实验需要，决定动物存活时间。

9、本实验中，若需要查验注射部位是否正确，可以在退针后取下动物，将其断头后，小心地剥离出鼠脑，顺着注射点将大脑切开，观察注射部位是否正确。

实验三冰冻切片及贴片

一、组织块浸糖

目的：冰冻时，组织中水分易形成冰晶，对组织结构有影响，故将组织浸入20%-30%的糖液中是为了置换出组织中大部分水分，使其在切片时尽量少出现冰晶。

方法：将鼠脑从后固定液移入15%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，过夜；再移入30%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，至组织块沉底。

二、冰冻切片

将组织块从蔗糖中取出，用滤纸吸干表面液体。在样品台上滴上适量的包埋剂，将组织粘于其上，然后再滴适量包埋剂于组织块上，直至将整个组织块完全包裹住。放在切片机速冻台处，按下“PE”速冻键。调节好冻台及箱体温度；将速冻完成的样品头夹在冻台上，进行鼠脑冰冻连续冠状切片，片厚20μm。按顺序收集切片于盛有0.01 mol/L PBS的培养皿内。

三、贴片

用毛笔将脑片平整贴片于粘附载玻片上，每张载玻片贴三张脑片，自然凉干后，置于切片盒中放—20℃保存。一张优质的切片要求组织完整，厚薄均匀，无刀痕、皱褶、气泡，染色时不脱片。

附：0.01mol/L PBS（pH 7.4）：Na2HPO4 3.75g

NaH2PO40.43g

NaCl 7.2g

加水定容至1000ml

0.1mol/L PB（pH 7.4）：Na2HPO428.7g

NaH2PO4 2.96g

加水定容至1000ml

15%蔗糖：蔗糖15g 加0.1mol/L PB溶解定容至100ml

30%蔗糖：蔗糖30g 加0.1mol/L PB溶解定容至100ml

实验四尼氏（Nissl）染色

一、原理

尼氏体（Nissl body）：是神经细胞的一种特殊结构，具有嗜碱性的特点，易被碱性染料，如焦油紫、亚甲蓝、甲苯胺蓝及硫堇等将其染为蓝色，呈块状(形如虎斑)或粒状，又称虎斑。尼氏体分布在神经细胞除轴突之外的细胞质中，核周围颗粒较大，近边缘处较小而细长。尼氏体可因生理状态的改变而变化，在生理情况下尼氏体大而数量多，反映出神经细胞旺盛的功能状态；在神经元受损伤时，神经元的胞体肿胀，细胞核从中央移到胞体边缘，胞质内尼氏体明显减少甚至消失，故胞质着色浅淡。电镜下可见尼氏体由发达的粗面内质网和游离的核糖核蛋白体构成。

二、冰冻切片尼氏染色实验步骤

1、浸片：切片在PBS液中浸泡2min；

2、染色：切片入0.1%焦油紫水溶液，37℃，30～60分钟；

3、漂洗：蒸馏水10sec，洗去浮色，

4、分色、脱水、透明：依次移入70%、80%、95%（两次），每道10sec；移入100%乙醇两次，每次1min；移入二甲苯两次，每次5-10min；

5、封片：中性树胶封片。

结果：胞浆着色，高倍镜下可见尼氏小体紫红色，核仁呈深蓝色，背景无色。

三、注意事项

1、在70%、80%乙醇内分色作用明显，所需时间应根据切片性质（冰冻切片或石蜡切片等）、切片厚度、染色深浅等灵活变动，必要时随时在显微镜下检测分色程度。如分色不够，可退回70%、80%乙醇；分色过度，可退回水中再移入染液重染。

2、应用酒精分色，要迅速，防止过度分色，将组织切片上的颜色全部脱掉。

3、透明剂能使材料清净透明，增加组织折光系数，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜下检查。常用的透明剂为二甲苯，它折射率是1.494，与载玻片的折射率1.515较为匹配。此外，它能与乙醇、石蜡以及封片用的中性树胶互溶。但切片浸入前必须脱干净水分，否则会发生乳状混浊。如果二甲苯溶液变得浑浊，一定要更换新液。

实验五、神经髓鞘染色

一、原理

髓鞘是包裹在神经轴突外面的管状鞘，由髓磷脂所构成，其主要成分是类脂质和蛋白质，类脂质含有脂肪、卵磷脂、脑苷酯及胆固醇。在正常髓鞘中，由于磷脂极性基团和亲水基团的存在，对水具有亲和力，因此水溶性氧化剂可渗入髓鞘，有利于磷脂对染料的摄入。髓鞘染色方法有多种，基于不同的原理，可利用媒染剂、油溶性染料或锇酸等与类脂质的特殊反应而进行。Luxol Fast Blue（LFB，罗克沙尔坚牢蓝）属于铜-酞箐染料（copper-phthalocyanine dye），具有在乙醇溶液内能与髓鞘磷脂结合的染色特性。LFB染色后髓鞘着色鲜明，是鉴定神经髓鞘比较好的特异性标记物。根据正常和不同病变时期髓鞘的组织结构特点，通过髓鞘染色来观察正常和病理情况下髓鞘是否完整，有无变性、坏死及修复情况，对神经组织的病理诊断和研究有实用意义。

二、冰冻切片髓鞘染色实验步骤

1、提前1h把LFB染液放在60度烘箱里预热；

2、切片在PBS液中浸泡2min；

3、洗好的切片依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇，每个浓度2min；

4、将切片放入预热好的LFB染液，60度烘箱中孵育1.5～2h；

5、将染色缸取出冷却到室温后，切片依次浸入95%乙醇1min、双蒸水10sec，饱和Li2CO3、70%乙醇、双蒸水10sec。（饱和Li2CO3和70%乙醇起分色作用，时间根据分化的程度而定，这两步之间可以反复，同时用显微镜观察分色情况）；

6、待切片自然晾干后入100%乙醇5min，二甲苯两道，每道10min，中性树胶封片，晾干后在显微镜下观察拍照。

参考结果：

(2012级神经生物郭瑞供图)

实验六&七免疫荧光（双标）染色技术

一、原理

免疫荧光技术是最早建立的一种免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广，但是标本不易保存，因为荧光素易降解。

抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法：用带有标记物的抗体与标本中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；②间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体（第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物）与特异性的第一抗体结合，通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。

二、冰冻切片免疫荧光双标步骤

1、切片入0.01 mol/L PBS（pH 7.4）5 min，室温；

2、封闭：滴加10%正常山羊血清（0.01 mol/L PBS配），室温，30 min；

3、滴加混合一抗（兔抗GFAP，1：500，Sigma，小鼠源MCT1，1：200，abcam，用含0.3% TritonX-100的0.01 mol/L PBS稀释），4℃，过夜或37℃，2h；

4、0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次，室温；

5、滴加混合的荧光素标记的二抗（Cy-2标记的山羊抗小鼠1：200，Sigma，Cy-3标记的山羊抗兔1：200，Sigma ，0.01 mol/L PBS配），37℃，1h或4℃过夜；

6、0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次，室温；

7、DAPI复染，室温10min后0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次；

8、荧光封片剂封片后在荧光显微镜下观察拍照。

三、注意事项1、封闭后勿洗，甩去多余的血清，滴加抗体前擦干脑片周围的液体；2、荧光二抗操作需在避光条下进行，封片后如不进行观察玻片需放入避光的切片盒中4℃保存；3、若37℃孵育抗体时确保湿盒水平放置。