Western-blot常见问题解答
Western Blot详解－常见的问题指南
实验常见的问题指南
《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆">克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。
3. 抗体
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？解答：一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你
4. 滤纸、胶和膜的问题
X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？
解答：就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF 膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。
II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V ，3－5hrs 就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page，48V 10hrs－16hrs。
KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。
5. Marker的相关疑问
用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析
6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？
解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析
7. 参照的疑问
SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？
解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。
8. 缓冲液配方的常见问题
UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。
VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？
解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。
AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?
解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。
BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鲜加入：65mM DTT
是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl，50 mmol/L，pH 7.5; NaCl，150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠，0.5%; SDS，0.1%; EDTA，1 mmol/L; PMSF，1 mmol/L; Leupeptin，2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？
解答：做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D 裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。
2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。
5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
6、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原因。
EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min 后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。
GGG. 我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？
解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进
JJJ. 怎样设计实验来确定最佳的条件？
解答：
1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1 个大well，不插梳子，多上样，）SDS-page；
NNN. Western Blot中block的最短时间?
解答：每一步1小时足够了，中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，洗3次只要半小时。跑胶1小时，转移1小时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色10分钟。一般跑两块胶，一块染色，一块western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。
PPP. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？
解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。
RRR. 做Western Blot实验时，发现转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA
SSS. 我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20
微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？
解答：1、建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90-100V，再跑3小时左右。2、转膜可用恒流，但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行，你就可以60mA的电流进行。3、我觉得你的抗体应该没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。
TTT. 目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估计将培养上清冻干浓缩后采用Western Blot还可能检测不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE 电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分离胶用40％T丙稀酰胺（2.6％C）浓度为16.5％，另外两层都用30％丙稀酰胺，中间一层浓度为10％，积层胶浓度为4％，凝胶厚度1mm，转膜的条件试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，上样量为60μg细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样合适？
解答：一定要用0.2μm的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根据你的实验器材来定，一般你要是有prestained marker就可以参照一下，如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。
UUU. 怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，罐胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，
解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，
WWW. 上次转染了1.6*106细胞，收集，收集到了400微升体积，加6*loading buffer，95度煮5分钟，-20度，交替3次，离心，上样，7%分离胶，先80v跑进分离胶，在100v电泳至溴酚兰出胶，biorad半干转PDVF 膜，15v转30分钟，预染marker全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，可见残留的蛋白带，大分子量多些.blot 时，封闭用5%奶粉TTBS 1小时，抗体稀释液TTBS，一抗(1:10，单抗上清，2000年制备)1小时，二抗(1:2000)1小时，均在室温.结果，50kd的小分子显色，160kd大分子未显色。
1、一抗用TBST稀释。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相一致，这样可以降低背景。
2、“biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟”，你是这么做的吗？因为我大部分时间是做的恒流转移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法，我不是很肯定你转30分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去。我建议你最好能将时间延长，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒压，可摸索一下，适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你，因为marker的量比较大，是很容易转上去的，实际上目标蛋白的量远远少于marker量。
化工泵产品分类及型号意义
化工泵产品分类及型号意义 化工泵行业趋势研究报告是通过对影响化工泵行业市场运行的诸多因素所进行的调查 分析，掌握化工泵行业市场运行规律，从而对化工泵行业的未来的发展趋势特点、市场容量、竞争趋势、细分下游市场需求趋势等进行预测。 化工泵行业趋势研究主要分析要点包括： 1)化工泵行业发展趋势特点分析。通过对化工泵行业发展影响因素分析，总结出未来化工泵行业总体运行趋势特点; 2)预测化工泵行业生产发展及其变化趋势。对生产发展及其变化趋势的预测，这是对市场中商品供给量及其变化趋势的预测; 3)预测化工泵行业市场容量及变化。综合分析预测期内化工泵行业生产技术、产品结构的调整，预测化工泵行业的需求结构、数量及其变化趋势。 4)预测化工泵行业市场价格的变化。企业生产中投入品的价格和产品的销售价格直接关系到企业盈利水平。在商品价格的预测中，要充分研究劳动生产率、生产成本、利润的变化，市场供求关系的发展趋势，货币价值和货币流通量变化以及国家经济政策对商品价格的影响。 化工泵行业趋势研究报告主要依据了国家统计局、国家海关总署、国家发改委、国家商务部、国家工业和信息化部、行业协会、国内外相关刊物杂志等的基础信息，结合化工泵行业历年供需关系变化规律，对化工泵行业内的企业群体进行了深入的调查与研究，对化工泵行业环境、化工泵市场供需、化工泵行业经济运行、化工泵市场格局、化工泵生产企业等的详尽分析。在对以上分析的基础上，对化工泵行业未来发展趋势和市场前景进行科学、严谨的分析与预测。
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电网营业厅无纸化解决方案
电网营业厅无纸化解决方案 2017年3月 1背景 随着信息化社会的到来，电子政务和电子商务得到了快速发展，并形成了大量电子文件。在开放的网络信息空间，电子文件是通过计算机网络、服务器或通信线路等进行传输的。电子文件在传送过程中是否已遭窃读、篡改、增删或系冒名传送，传送后是否会出现有人否认收到文件等情况？由此引出了网络办公或网上交易中电子文件的安全性问题。出于确认使用人的身份，确保电子文件的安全保密及完整无缺，保障已进行的各项工作或交易不被推翻的需要，电子签名便应运而生了。 电子签名，是指数据电文中以电子形式所含、所附用于识别签名人身份并表明签名人认可其中内容的数据。它是基于数字证书的电子认证技术，通过智通卡、密码或生物测试等多种手段来解决身份认定、信息来源认定、信息完整性和安全性确认等诸多问题，以保证网上办公、电子支付、网上交易、电子合同、网上知识产权等的安全问题的。目前，大规模应用的电子签名技术有两类：一类是数字签章技术，需通过第三方认证机构来确认；另一类是电子化印章技术，通过印章图像电子化、加密等方式实现文件正文与印章的一体化传输。电子签名并非是书面签名的简单数字图像化，它其实是一种电子代码，利用
它收件人便能在网上轻松验证发件人的身份和签名以及文件在传输过程中有无被改变等情况。 目前电子签名主要是用于银行的信息交易。而在电力信息化工作流平台中，在流程确认环节也需要签名，本方案试图通过把电子签名信息技术融入到电力行业的信息化中，并在电力行业得到具体的应用。2现状分析 2.1电子化签名在其他公用事业的应用 2.1.1医疗行业 近几年医院的信息化建设后来居上，已基本实现数字化建设。各医院建成使用的系统包括EMR、HIS、LIS、PACS、OA、CIS、绩效分析系统、体检系统、病案扫描系统、医保系统等。医院信息化网络管理已由以经济管理为中心向医疗管理、以病人为中心过渡，逐渐建立以病人信息为中心的集医、教、研、管功能于一体的完整医院信息系统。电子签章的应用，在一定程度上可以促进医院管理模式的变革。就诊医生在其日常工作平台上，如门诊、住院医生站，电子病历系统，医技系统中，实现完整的一套病历记录，安排医嘱，开具处方，申请检验检查，给出报告单等各项工作后，自动、安全、准确地加盖当时负责医生的电子签章，优化了工作流程，节约人力，节省时间，提高了工作效率，方便了医生诊疗，有利于提高诊疗效率，减轻医生的作业强度。另一方面，各业务系统中加入电子签章后，一些原来需要纸
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 （一）蛋白样品制备 培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 （二）SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样 （3）电泳 （三）转膜 （四）免疫反应 （五）化学发光，显影，定影 （六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
立式管道离心泵型号定义及结构图
立式管道离心泵型号定义及结构图 上海阳光泵业作为国内一家著名的集研制、开发、生产、销售、服务于一体的大型多元化企业，上海阳光泵业制造有限公司一直坚持“以质量求生存、以品质求发展”的宗旨为广大客户提供优质服务!同时，上海阳光泵业一直专注于自身实力的提升以及对产品质量的严格把关，为此，目前不但拥有国内最高水准的水泵性能测试中心、完善的一体化服务体系、经验丰富的水泵专家，同时经过多年的发展，产品以优越的性能、精良的品质、良好的服务口碑获得各项专业认证证书和客户认可。经过团队的不懈努力，上海阳光泵业在国内水泵行业已经取得了很大成就。这样一家诚信为本、责任重于天的水泵行业佼佼者，对于水泵的维修、保养等各大方面都有自己独特的方法，下面就一起来看看吧! 一、ISG立式管道离心泵产品概述: ISG立式管道离心泵，是本单位科技人员联合国内水泵专家选用优秀水力模型，采用IS型离心泵之性能参数，在一般立式泵的基础上进行巧妙组合设计而成。同时根据使用温度、介质等不同在ISG型基础上派出适用热水、 高温、腐蚀性化工泵、油泵。该系列产品具有高效节能、噪音低、性能可靠等优点。 二、ISG立式管道离心泵产品特点: 1、泵为立式结构，进出口口径相同，且位于同一中心线上，可象阀门一样安装于管路之中，外形紧凑美观，占 地面积小，建筑投入低，如加上防护罩则可置于户外使用。 2、叶轮直接安装在电机的加长轴上，轴向尺寸短，结构紧凑，泵与电机轴承配置合理，能有效地平衡泵运转产 生的径向和轴向负荷，从而保证了泵的运行平稳，振动小、噪音低。 3、轴封采用机械密封或机械密封组合，采用进口钛合金密封环、中型耐高温机械密封和采用硬质合金材质，耐 磨密封，能有效地延长机械密封的使用寿命。 4、安装检修方便，无需拆动管道路系统，只要卸下泵联体座螺母即可抽出全部转子部件。 5、可根据使用要求即流量和扬程的需要采用泵的串、并联运行方式。 6、可根据管路布置的要求采用泵的竖式和横式安装单级离心泵。 三、ISG立式管道离心泵工作条件：
无纸化办公系统解决方案
武装部打印室集中打印解决方案 武装部打印室集中打印解决 方案 2014年5月
第一部分前言 1.1概述 本方案是根据渭南建设局实际要求来进行阐述的，包括了FORP基础平台、个人办公平台、公共信息平台、行政办公、公文收发、文档管理等多个方面的功能需求，总体构成渭南建设局无纸化OA办公系统。 1.2范围及文档组织形式 本方案是对渭南建设局实际要求的技术响应，共分六部分：第一部分前言；第二部分为解决方案综述；第三部分针对渭南建设局机关办公自动化系统提出系统解决方案和流程的详细描述；第四部分对系统运行环境进行介绍；第五部分对售后服务及技术支持体系进行介绍；第六部分对本建议做总结。 第二部分综述 FORP柔性运营资源管理平台（英文名Flexible Operation Resource Platform），是面向管理层的集成管理软件平台，以目标管理为核心，以人为本，以业务流程为驱动，以知识和关系管理为重点的新一代管理软件。FORP通过一个基础平台、三大引擎和若干管理应用套件，构建了一个线上生存必须的运行支撑环境。
图1.1FORP管理平台结构示意图 2.1FORP协同管理平台特点 ?以流程为基础，驱动业务协同。做为FORP三大引擎之一的流程引擎，支持公文 流转、报销、借款、请假、出差、用车、采购、考核、培训、物资领用等各种流程的审批、管理，规范企业中各项工作执行，驱动团队协同工作，提升总体工作效率。 ?基于PDCA循环的计划任务管理，真正的协同工作平台。围绕企业目标，进行工 作目标任务的分解、分配、指导、检查、催办、汇报、验收、总结及模板化，充分体现PDCA循环思想，强化执行，真正协同。 ?广泛应用门户技术，使用操作更方便、直观。应用门户技术，为每一位用户提供 个性化的“工作平台”，图表等多种方式展示，让使用操作更方便、直观。 ?平台化设计、自定义报表与业务表单工具，扩展更加灵活。符合SOA设计原则、 多层体系结构、灵活的流程与表单工具，节省信息化建设总体成本。 2.2技术特性 该解决方案基于西点成熟的柔性运营资源管理平台FORP产品，采用成熟的开发语言(MS .Net )和架构(B/S)进行，保证XX机关无纸化OA办公系统的稳定和安全，其系统技术特性如下：
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
(完整版)各种离心泵型号大全全详细介绍
排污泵系列型号管道离心泵型号意义 Q:潜水 W:排污 G:管道 Y:液下 N:泥浆 Z:自吸 L:立式AS:撕裂 JY:搅匀 P:不锈钢 B:防爆 QW（WQ）无堵塞潜水式排污泵 例：80WQ（QW）P40-15-4 80 WQ(QW) P 40 - 15 - 4 │││││└─-泵的电机（KW） ││││└───-泵的扬程（m） │││└─────--泵的流量（m3/h） ││└───────-不锈钢材质 │└─────────-潜水排污泵 └───────────--泵的口径即代表泵排出公称直径（mm） JYWQ、JPWQ自动搅匀排污泵 例：80JY（P）WQ50-10-1600-3 80 JY (P) WQ 50 - 10 - 1600 - 3 │││││││└─泵的电机（KW） ││││││└─-──泵的搅匀范围（mm） │││││└────-──泵的扬程（m） ││││└─────────泵的流量（m3/h） │││└────────── W：排污 Q：潜水 P：不锈钢 ││└─────────-─-─P：不锈钢材质 │└─────────-────-JY：搅匀ISG系列立式管道离心泵 例：ISG50-160(I)A ISG 50 - 160 (I) A(B) ││││└─叶轮经第一次切割 │││└─-──流量分类、(I)为大流量、 ││└─────叶轮名义外径(mm) │└────────泵的口径(mm) │┌ ISG型立式离心泵 └────────┼ IRG型立式热水泵 ├ IHG型立式不锈钢化工泵 └ YG型立式防爆油泵 ISGD系列低转速立式管道离心泵 例：ISGD80-160(I)A ISGD 80 - 160 (I) A(B) ││││└─叶轮经第一次切割 │││└─-──流量分类、(I)为大流量、 ││└─────叶轮名义外径(mm) │└────────泵的口径(mm) │┌ ISGD型低转速立式离心泵 └────────┼ IRGD型低转速立式热水泵 ├ IHGD型低转速立式不锈钢化工泵 └ YGD型低转速立式防爆油泵
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 Western blot基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2 有机溶剂提取法； 3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题：
1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
化工泵参数及型号定义
化工泵参数及型号定义 上海阳光泵业作为国内一家著名的集研制、开发、生产、销售、服务于一体的大型多元化企业，上海阳光泵业制造有限公司一直坚持“以质量求生存、以品质求发展”的宗旨为广大客户提供优质服务!同时，上海阳光泵业一直专注于自身实力的提升以及对产品质量的严格把关，为此，目前不但拥有国内最高水准的水泵性能测试中心、完善的一体化服务体系、经验丰富的水泵专家，同时经过多年的发展，产品以优越的性能、精良的品质、良好的服务口碑获得各项专业认证证书和客户认可。经过团队的不懈努力，上海阳光泵业在国内水泵行业已经取得了很大成就。这样一家诚信为本、责任重于天的水泵行业佼佼者，对于水泵的维修、保养等各大方面都有自己独特的方法，下面就一起来看看吧! 一、ZX系列卧式自吸化工泵产品概述： ZX系列型泵是卧式自吸离心泵。耐腐蚀化工泵该型式泵与其它型式的自吸离心泵比较，因为泵本身没有逆止阀，结构最为简单；工作最为可靠；无故障工作时间长，维护、使用方便、体积小、重量轻、效率高、在设计上做了特别的考虑与相同口径的泵比较，排量大、性能高。 ZX型自吸泵在工农业生产、抢险救助，如排涝、救火中作为应急泵使用效能更为突出。氟塑料化工泵 ZX型泵广泛适用石油、化工、冶金、机械、化纤、食品、能源、交通等工业部门城市给水、亦可用于农业排灌、喷灌。供输送清水或粘度小于5°E，温度低于80℃物理及化学性质类似清水的其它液体。二、ZX系列卧式自吸化工泵技术参数： 流量：6.3～400m3/h； 扬程：5～132m； 转速：2900、1450r/min； 功率：0.55～110KW； 进口直径：50～200mm； 最高工作压力：1.6Mpa。 三、ZX系列卧式自吸化工泵维护和拆装：
无纸化办税签章使用常见问题汇总
无纸化办税电子签章使用常用信息及常见问题汇总（最后更新时间2017-8-22）
目录 1常用信息汇总 (3) 1.1纳税人电子印章注册及审核 (3) 1.2税务人员电子签章注册及审核 (3) 2常见问题汇 (3) 2.1首先确认电脑基本环境 (3) 2.2客户端安装失败 (3) 2.3纳税人注册，下载协议报错 (3) 2.4客户端无法读取印章数据或印章信息 (3) 2.5金税盘部分用户，安装驱动后，无法读取金税盘证书信息 (3) 2.6登录/申报时，点击登录/签章按钮，页面没有反应。 (3) 2.7提示设备证书与系统登录纳税人不符，无法执行签章。 (3) 2.8申报页面，无签章按钮，只有确认申报按钮 (3) 2.9签章时提示“证书未注册”，签章注册提示“证书号有变更”。 (3) 2.10纳税人三证合一问题 (3) 2.11关于证书注册，未知状态的错误 (3) 2.12网上办税平台内电子签章注册,注册时点击完成注册没有反应 (3) 2.13电子签章客户端读取签章提示无法连接服务器或证书没有注册 (3) 2.14企业在税局修改了企业名称，但是在电子印章里还是旧的企业名称 3 2.15签章时提示“文件不存在或者已经损坏！” (3)
1 常用信息汇总 1.1 纳税人电子印章注册及审核 注册：网上办税平台：https://www.360docs.net/doc/3e19136674.html,:8080/ 注册备用地址：电子签章外网注册： https://www.360docs.net/doc/3e19136674.html,:9000/WEB/ 审核：税务电子签章管理系统：http://76.12.97.162:8080/Manage/ 1.2 税务人员电子签章注册及审核 注册：http://76.12.97.43:8080/WEB/ 审核：http://76.12.97.43:8080/Manage/ 2 常见问题汇 2.1 首先确认电脑基本环境 客户端版本号V8.8； 是否将山东国税站点加入可信任站点及兼容性视图； WIN10及IE11情况下，如果读取不到设备或者签章缓慢，试一下管理员身份运行IE，然后登录网报平台；或更新金税盘或税控盘驱动，可联系96005656。 电脑上只插一个USB密钥设备，同时插两个usb设备可能会导致未注
蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
化工泵技术资料
化工泵 化工泵是全国联合设计的节能泵，泵的性能，技术要求，根据国际 标准ISO2858所规定的性能和尺寸设计的，其优点：全系列水利性能 布局合理，用户选择范围宽，“后开式”结构，检修方便、效率和吸程达 到国际先进水平。 化工泵用途及特点 挠性泵（不锈钢材质）广泛用于石油、化工、冶金、合成纤维、制药、食品、合成纤维等部门用于输送碱性腐蚀介质；滑片泵使用于输送任何酸性、碱性腐蚀性介质；IS型化工泵（铸铁材质）用于工业、城市给水、排水、亦可用于农田、果园排灌，供输送清水或物理及化学性质类似清水的其他液体之用。 化工泵广泛的应用于化工行业的各个领域，目前国内厂家生产的化工泵主要有：IH型不锈钢化工泵、IHF型氟塑料化工泵、FSB型氟塑料化工泵、CQB化工磁力泵、CQ化工磁力泵、FZB 化工自吸泵等。这些化工泵被广泛应用于化工、冶金、制药、化成箔等行业，均有着重要的用途。分类 依据化工泵材料的不同，对其应用领域做如下分类： 1）化工泵（不锈钢材质）广泛用于石油、化工、冶金、合成纤维、制药、食品、合成纤维等部门用于输送碱性腐蚀介质； 2）化工泵（氟塑料材质）使用于输送任何酸性、碱性腐蚀性介质； 3）化工泵（铸铁材质）用于工业、城市给水、排水、亦可用于农田、果园排灌，供输送清水或物理及化学性质类似清水的其他液体之用。 型号及意义 目前国内厂家生产的化工泵主要有： dkzb型不锈钢挠性泵、dby型电动隔膜泵、hkzb滑片泵、IH型不锈钢化工泵、IHF型氟塑料化工泵、FSB型氟塑料化工泵、CQB化工磁力泵、IMD化工磁力泵、FZB化工自吸泵等。这些化工泵被广泛应用于化工、冶金、制药、化成箔等行业，均有着重要的用途。 例如：IH50-32-160 IH-国际标准单级单吸化工离心泵 50-吸入口直径（mm） 32-排出口直径（mm） 160-叶轮名义直径（mm） 化工泵所需满足的要求 (1)必须满足流量、扬程、压力、温度、汽蚀余量等工艺参数的要求。 (2)必须满足介质特性的要求： 1对输送易燃、易爆、有毒或贵重介质的泵，要求轴封可靠或采用无泄漏泵，如屏蔽泵、磁力驱动泵、隔膜泵等。 2对输送腐蚀性介质的泵，要求过流部件采用耐腐蚀材料。
关于柜面无纸化的疑问的相关解释说明
关于柜面无纸化的疑问的相关解释说明 1、电子凭证的认证： 电子凭证的认证主要依据2005年4月1日实施的《中华人民共和国电子签名法》。其中第十四条：“可靠的电子签名与手写签名或者盖章具有同等的法律效力。” 电子签名同时符合下列条件的，视为可靠的电子签名： 1)、电子签名制作数据用于电子签名时，属于电子签名人专有； 2)、签署时电子签名制作数据仅由电子签名人控制； 3)、签署后对电子签名的任何改动能够被发现； 4)、签署后对数据电文内容和形式的任何改动能够被发现。 基于上述4个条件的要求，通过第三方CA数字证书对电子凭证进行数字签名可以满足其条件，实现可靠的电子签名；依据CA数字证书的数字签名确保电子凭证的真实性、安全性、合法性、权威性。 2、电子签名： 电子签名用来识别签名人身份，并表明签名人认可其中内容，充分考虑客户签名的制作安全和使用安全。 1)我公司提供的手写屏支持个性化电子手写签名（带压感笔锋），手写支 持压感，笔迹平滑，使电子签名达到纸质签名感受和效果，采用A4纸打 印的用户签名轨迹，没有明显的锯齿。 2)电子手写签名仅能从手写输入设备采集，不得从图像文件获取。 3)电子签名以矢量方式保存，在电子受理单合并后，电子签名在不同时间、 不同环境下显示一致，保证在打印和缩放显示时清晰呈现。 4)一次签名仅限一次使用，手写签名数据不得单独保存，采集时仅在缓存 管理中存在。 5)手写签名结束的同时电子业务受理单提供内容保护功能。 关于签字效果和安全，具体如下解释： 1)签字效果：电子签名的笔迹粗细可调节，在不同粗细配置下，手写签字效 果均能够实现复杂笔画文字快速连笔书写的准确获取和显示，真实体现书写笔迹，笔画不丢失不更改。电子签名需采用弹出框的方式进行签字，具
westernblot详细图解详细版.docx
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
泵的常识及其型号
水泵的分类 1、按泵轴方向可分为卧式、立式、斜式 2、按壳体剖分型式分为径向剖分式和轴向剖分式 3、按级数分为单级和复级 4、按吸入形式分为单吸和双吸 5、按水泵形式分各中心支承式，管道式、共座式、分座式、可移式 6、按驱动方式分为直接连接、齿轮传动式、液力偶合传动式、皮常传多式和共轴式 7、按特殊结构分为液下式、筒式、双壁壳式、地坑筒式、抽出式、自吸式、潜液式和屏蔽式 8、按轴向力平衡方式分为平衡鼓式、平衡盘式、自身平衡式和平衡孔式 9、按用途不同主要分为锅炉给水泵、循环水泵、排污泵、杂质泵、砂泵、渣浆泵、泥浆泵、污水泵、清水泵、消防泵、流程泵、增压泵、耐腐蚀泵 10、按材质不同分为：铸铁泵、不锈钢泵、塑料泵、氟塑料泵、工程塑料泵 11、按结构形式分为离心泵，隔膜泵，齿轮泵，柱塞泵，往复泵，真空泵，喷射泵 离心泵型号 离心泵及离心泵的型号 离心泵型号、品种规格及其变型产品在农用泵中是最多的。根据水流入叶轮的方式、叶轮多少、泵本身能否自吸以及配套动力大小和动力品种等，离心泵有单级单吸离心泵、单级双吸离心泵、多级离心泵、自吸离心泵、电动机泵和柴油机泵等。 1、单级单吸离心泵老的泵型号有BA、B型单级单吸离心泵，80年代，我国根据国际标准和排灌机械实际情况，对离心泵产品进行更新换代研制工作，并生产IB型、IQ型单级离心泵系列产品，已列为国家专业标准和行业标准。 单级单吸离心泵，水由轴向单面进入叶轮，叶轮只有一个，因此称为单级单吸离心泵。其特点是，与混流泵、轴流泵相比，扬程较高，流量较小，结构简单，使用方便。 IQ型单级单吸离心泵（又称轻小型离心泵）是针对我国国情并满足用户提出结构简单、重量轻、价格低、性能好和配套方便的要求而设计的，共有84种产品，分3个派生系列，413个规格型号。 （1）性能范围泵口径50～200毫米，流量12.5～400立方米/时，扬程8～125米，配套动力有柴油机直联、皮带传动，电动机直联，功率1.1～110千瓦，转速1450～2900转/分。 （2）结构型式轻小型离心泵为轴向吸入单级单吸悬架式离心泵，泵体后开门，出口位于中心向上，后盖为压嵌式，轴承体与泵体直接联结，泵脚位于泵体下方，轴承用黄油润滑，轴封分为软填料、机械密封、橡胶油封三种。叶轮均为闭式，传动分为联轴器传动和皮带传动两种。泵叶轮转向：从泵进口方向看，叶轮转向为顺时针，当泵与柴油机直联传动时，为逆时针。泵出口可装置手动泵，可去掉底阀，减少水力损失，并能使泵自吸。 2、双吸离心泵 它是从叶轮两面进水的双吸离心泵，因泵盖和泵体是采用水平接缝进行装配的，又称为水平中开式离心泵。与单级单吸离心泵相比，效率高、流量大、扬程较高。但体积大，比较笨重，一般用于固定作业。适用于丘陵、高原中等面积的灌区，也适用于工厂、矿山、城市给排水等方面。 双吸离心泵有S型、Sh型、SA型、SLA型几种型号，S型与Sh型的区别是，从驱动端看，S型泵为顺时针方向旋转，Sh型为逆时针方向旋转。SLB型为立式便拆式双吸泵。 S型泵性能范围流量160～18000立方米/时，扬程12～125米，进水口直径150～1400毫米，转速2950、1450、970、730、585、485、360转/分。 3、多级离心泵 与单级泵相比，其区别在于多级泵有两个以上的叶轮，能分段地多级次地吸水和压水，从而将水扬到很高的位置，扬程可根据需要而增减水泵叶轮的级数。多级泵主要用于矿山排水、
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生