真核细胞表达系统(干货分享)
真核细胞表达系统
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:
①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异
性激活或抑制；...文档交流仅供参考...
②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...
1、酵母表达系统
最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Ｃandiｄa Bodｉni，Pichia Pasｔris3种。以Pichia Ｐastoriｓ应用最多。...文档交流仅供参考...
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中ＡOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/Piｃhia Pastoris的穿梭载体，
其中含有E.cｏlｉ复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E。ｃoli细胞大量扩增．目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等.甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化....文档交流仅供参考...
利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEＸ8、YＰTI 等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡP）启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导.培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间. ...文档交流仅供参考...
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。...文档交流仅供参考...
2、昆虫细胞表达系统
杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒（AcNPＶ)作为表达载体。在ＡcNPＶ感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋
白,该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体.核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒.克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNＰＶ共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏,因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低,且载体构建时间长，一般需要4~6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。...文档交流仅供参考...
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化工作变得很困难,另外水解酶的释放会降解重组蛋白.为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒iｅ－１基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Ｆarrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：...文档交流仅供参考...（１）Bｏmbyx moｒi的肌动蛋白基因启动子；
（2)Bombｙx mori的核型多角体病毒（BｍNＰＶ)的立早基因ｉe—1(编码俄IE-1蛋白,该蛋白是种转录激活因子,可在体外激活肌动蛋白基因启动子);...文档交流仅供参考...
(３）BmNＰV的同源重复序列3（ＨＲ3）可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。
三者协同作用,可使转录活性提高1０00倍以上,从而大大地提高
外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由ＡcNPV及Bnｉ'qP发展而来。...文档交流仅供参考...一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp7０(热休克蛋白７0)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外.如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚,这对最终的表达水平有很大影响。而Hｓｐ70是一种分子伴侣,能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工,从而提高蛋白的分泌水平。...文档交流仅供参考...
最近，人们又构建了杆状病毒－S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞（如sｆ9、sf21）中复制,不能在其他昆虫细胞（如果蝇细胞)中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中,杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Ｈsｐ70启动子、肌动蛋白5Ｃ启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中,Hsｐ70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒—Ｓ2系统是一个很有应用前景
的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全,表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。...文档交流仅供参考...
３、哺乳动物细胞表达系统
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等....文档交流仅供参考...
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法:一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及ＤEAＥ一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中.外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体,如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统,而利用ＣOS 细胞可建立瞬时表达系统。目前,病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具,在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大（约1８7kb)，利用它作为载体可同时插入几种外源基因,从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因,但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性. ...文档交流仅供参考...
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建
的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高,即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌.另一种方法是通过CｒelaxＰ系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点，然后将两个质粒共转染表达Ｃrｅ重组酶的哺乳动物细胞，通过Ｃｒe介导两个lａxP位点之间的ＤNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径. ...文档交流仅供参考...
利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响.哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子.但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。...文档交流仅供参考...
为此,Ｇoｓseｎ等构建了受四环素负调节的Ｔet－oｎ基因表达系统,该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA）的序列,在没有四环素或强力毒素存在的情况下ｔTA可引起下游目的基因表达。随后Ｇossｅn等又对ｔＴA 的氨基酸序列进行了改造,构建了受四环素正调节的Tet—ｏｎ基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效可控制性强的优点。...文档交流仅供参考...外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielkｅ等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统,在这个系统中，编码抗体重链和轻链的c ＤＮA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子ｍRNA.内部的顺反子通过内核糖体进入位点(ＩRＥs）介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。...文档交流仅供参考...
哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CＨO、ＣＯＳ、BHK、SP２／０、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。...文档交流仅供参考...
利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规
模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟,有待进一步研究。...文档交流仅供参考...
4、结语
目前已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足，这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求。...文档交流仅供参考...
①特异性:该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化.
②非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。
③可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。
④诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。
⑤可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。
⑥剂量依赖性:该系统的反应与诱导剂的浓度成正比,以便进行定性定量分析.
总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物
细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。Van der GｅId等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶(ＰR3０)，并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的ＰR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PＲ３具有大部分表位,而在甲醇酵母中表达的PＲ3只具有少数几个表位.因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素,如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、安全性等,权衡利弊后再选择相应的表达系统。...文档交流仅供参考...
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段,但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。转基因技术的发展使我们可以在体内更有效地研究基因的功能，由于大部分基因在体内都是在特定组织或特定发育阶段表达的,要想有效研究这些特定基因的作用,就需要在特定的时间以适当的表达水平实现目的基因的表达....文档交流仅供参考...
诱导表达系统可以在时空上控制目的基因的表达,这对认识基因
在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用具有重要意义。较早的诱导表达系统通常采用哺乳动物本身的基因表达调控元件,虽然用诱导剂可以控制目的基因的表达，但由于诱导剂在细胞内还控制其他的靶基因,这可能会严重干扰对目的基因的研究,产生假阳性或假阴性实验结果.为了解决这一问题，一些生物学家利用非哺乳动物的基因表达调控元件或不再对响应内源诱导剂的突变型内源表达调控元件建立了一些可诱导表达系统。目前比较成熟的诱导表达系统主要有4种：四环素诱导表达系统,蜕皮激素（ecdysone)诱导表达系统,他克莫司（tacｒｏｌimus，FK５0６）/雷帕霉素（rapamyｃｉn)诱导系统和ＲU48６诱导系统....文档交流仅供参考...
1、四环素诱导系统
四环素诱导系统（tｅtｒａcｙｃline iｎdｕｃｉｂle sｙstem)是由Ｇｏsｓen及Bujarｄ首先建立的，该系统采用细菌的四环素抗性操纵子,因为它完全是来源于原核细胞，因此有较好的特异性。此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA）和反式作用因子依赖的启动子两个成分。四环素反式激活蛋白(tT Ａ）是一个包含大肠杆菌ＴＮ10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒ｐ１6蛋白(ＶP16)Ｃ端部分的融合蛋白，tTＡ依赖启动子由融合有RＮA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(ｔetＯ)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的ｔet阻遏物成为很强的翻译激活物。在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与ｔｅｔO序
列结合,使tＴA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tＴA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行；tet系统中ｔTA的作用称为teｔ-OFF。后来Goｓ—sｅn等又构建了反式tＴA(rtTA），它是一种突变形式的tTA,包含突变形式的蛋白ｔetR.与tTA作用相反,这种rt－TA只有在四环素及其衍生物的作用下才能与DNＡ结合并激活转录。如果没有药物刺激，就不表达目的基因,因此ｒt-ＴA的作用称ｔeｔ—ON。这两种蛋白在组织培养、果蝇及转基因小鼠中都被证明能有效调控外源基因的表达。Ｐａrrado等成功的应用tｅt－OFF 系统证实ＰLZF（早幼粒细胞白血病锌指）基因在淋巴细胞中表达具有抗凋亡作用。Ｒhｏadeｓ等应用四环素可诱导系统成功建立了转基因小鼠模型，为研究ＡML１-EＴO在白血病发生中的作用奠定了坚实的基础。...文档交流仅供参考...
四环素诱导系统在细胞水平和转基因动物中被广泛用来研究基因的功能,但它有一个显著的缺点，即只有筛选大量的克隆或动物才能得到有较低表达背景而目的基因能显著激活的理想克隆或转基因品系。解决这一问题的一个策略是把此系统的各元件构建到同一个载体上，这样只需一次转染就可以使基因的转录得到调控。逆转录病毒把基因转移到细胞内的能力比质粒转染有效得多,Bohl等［７］就通过使用简化的逆转录病毒载体取得了理想的结果。...文档交流仅供参考...
针对rtＴA有本底表达的缺陷又产生了几种改进的系统。tＴR是
一种改进的ｔetO的抑制物，当它与rtTA共同表达时，若无四环素及其衍生物就与tetO结合从而抑制rt-TA的本底表达，而在四环素等的作用下,tTR不能与ＤNA结合而由rtTA占据tetO位点,因此目的基因的表达被高效激活。...文档交流仅供参考...
２、蜕皮激素诱导表达系统
蜕皮激素诱导表达系统是基于昆虫蜕皮激素通过蜕皮激素受体激活基因表达的能力而设计的。该系统使用蜕皮激素受体与果蝇超螺旋蛋白（ultraspｉracｌepｒoｔein，USP)的异源二聚体，加入蜕皮激素[或合成的类似物幕黎甾酮A（ｍuristerｏnｅＡ）]后,蜕皮激素与其受体结合,蜕皮激素受体就与USP发生相互作用，进而与DＮA上的反应元件结合，最终启动下游目的基因的转录。由于哺乳动物细胞对蜕皮激素（或幕黎甾酮Ａ）没有反应性,也不含蜕皮激素受体,所以本底转录水平非常低。这种诱导系统在幕黎甾酮A作用下可得到100～1５0倍的高表达。后来又发展为一种改进的蜕皮激素系统,这一系统把蜕皮激素受体突变体[含依托泊苷(ＶＰ16）的反式激活结构域］与USP的哺乳动物类似物——－类视黄醇Ｘ（RXR）融合在一起。由于蜕皮激素受体的D ＮA结合位点也可以被人类受体（类法尼醇X受体）识别，上述系统改变了DNＡ结合位点的序列,使它只能被突变的蜕皮激素受体识别，这就避免了内在激素的影响，极大地降低了本底表达，在培养的细胞系中甚至可得到比本底高10００0倍的诱导水平。在小鼠腹膜内注射幕黎甾酮Ａ1６h后，也检测到基因得到相当
高水平的表达。幕黎甾酮A没有毒性也没有致畸性,而且和蜕皮激素一样可在注射后2０h以内完全排泄,因此这一系统是进行转基因动物实验的一个理想工具，在基因治疗方面也很有前景.若在这一系统上用一个组织特异的启动子代替CＭＶ启动子，就可使目的基因只能在特定的组织或细胞中诱导表达，这对在转基因动物的特定组织中研究靶基因的功能非常有用。Xiao等就用骨骼肌的α—肌动蛋白启动子代替了CMV启动子，他们用改造的可诱导系统建立稳定细胞株,研究发现在分化成熟的肌细胞中可诱导报导基因的表达,而在未分化的肌细胞中则没有表达。Stolaｒov 等[13］通过蜕皮激素可诱导系统证实PＴEN可抑制PＩ3K通路，从而阐明了PTEN抑制肿瘤的机制。...文档交流仅供参考...３、他克莫司(ＦＫ506）／雷帕霉素（rapａmycｉn)诱导系统
环孢素A受体和亲免素（FKＢP１２—rapamycｉn相关蛋白，FRAP)蛋白家族以及他克莫司（tａcrolimus,FK５06)-结合蛋白（FKBPs)都含有化学结合结构域，此结构能与DNA结合结构域和反式激活结构域相融合。而免疫抑制剂FK5０6、雷帕霉素和环孢素A（CsＡ)等小分子化学诱导物可以诱导这些嵌合转录因子的二聚化，从而强烈刺激报告基因的表达。因此在不影响正常细胞生理过程的情况下，就可以通过诱导二聚体的小分子药物的浓度以剂量应答的方式调控靶基因的表达水平。...文档交流仅供参考...
为了能用于基因治疗,又对这一系统进行了一系列人源化的改进,
如转录激活因子的非人源部分用一般认为无免疫性的成分取代,GAＬ４部分则由嵌合的DNA结合结构域ZFHＤ替代，ＶＰ16激活结构域可以用NF－kBp65的激活结构域代替，最后亲环蛋白由FＫBP１２-雷帕霉素结合结构域（ＦＲB）取代,而不用人源的FKBＰ12—雷帕霉素结合蛋白激酶(FRAP）。ＦRB－ＦKBP12的异源二聚体可以被雷帕霉素（比FKＣsA更有效）高效诱导，从而形成有功能的完整转录因子，最终启动转录。这一系统在体外和体内实验中背景表达都比较低，而在雷帕霉素的刺激下有高水平的表达.雷帕霉素可以与FRAP激酶结合，而FRAＰ可以介导免疫抑制效应,因此雷帕霉素有一定的增殖和免疫抑制活性，这成为该系统应用的一个潜在限制。这一问题通过选用雷帕霉素的类似物得到了解决,此类似物与野生型ＦＲＡP激酶的结合能力较差，因此不会产生免疫抑制，在体外实验中也发现此类似物也不抑制细胞的增殖。...文档交流仅供参考...
最近，利用雷帕霉素诱导的人源化系统(rａpａmycin-ｉn-duciblehumaｎizedsyｓtem,ＲＩHS)，通过腺相关病毒(aｄeno－a ｓsociaｔedviｒｕs,ＡAV）转染小鼠和非人灵长类动物来表达鼠红细胞生成素，实验表明可以通过控制雷帕霉素的剂量调控体内转基因的表达。...文档交流仅供参考...
４、RU48６诱导系统
这一系统采用截短的黄体酮受体的突变体,这种突变体不能和黄体酮或其他内源类固醇激素结合，但却能被黄体酮的拮抗剂RU
４86激活。这种突变的类固醇结合结构域融合到酵母GAL4DNA 结合结构域和疱疹病毒VP1６激活结构域上后（这种复合物称为ＧLＶP），在药物诱导下,就可以形成嵌合的转录激活因子,并与GAL4结合位点结合，从而激活下游基因转录。...文档交流仅供参考...
这一系统在瞬时和稳定转染的细胞中有较高的本底表达,在ＲＵ48６的诱导作用下，表达水平很少超过2０倍。但它在鼠体内有较好的表现.有研究用这一系统产生转基因小鼠，使它可以在肝脏特异表达人生长激素。用RU4８6作用8～12h后循环系统中的人生长激素水平显著升高,在约12ｈ达到最高水平，并在约100h后降低到本底水平。而且研究发现，产生的人生长激素有生理活性.每4８ｈ以2５０μｇ/kｇRU4８６处理转基因小鼠，其体重在48d后是未处理或非转基因小鼠的两倍.这一系统的优势是ＲU48６在体内可以被较快地代谢,半衰期较短,而且进入组织细胞的能力较强。...文档交流仅供参考...
研究发现有许多化学物质可以诱导基因的表达,甚至光、热等物理因素也可以用来诱导基因的表达。最近Shimi-ｚu—Sato等利用植物的光敏素构建了一个可用光来诱导基因表达的系统,这一系统在可见光的作用下可以诱导报告基因的转录。Bajｏghli等则构建了包含多个热激反应元件(ＨSE）的双向热激诱导启动子，并用此系统在鱼的胚胎中成功地诱导了目的基因的表达，它的本底表达比以往的热激诱导系统明显降低。实际上可诱导系统不仅
可用来诱导基因的表达,还可作为反式基因工具用来构建可诱导的RＮA干扰系统。Neｇｅri等用ＵＡＳ/ＧAＬ4系统在果蝇的发育过程中诱导了RNＡ干扰作用;Mａsclaux等则成功构建了一个热激诱导的RNA干扰系统。...文档交流仅供参考...
目前已经建立了多种诱导表达系统,但它们都有其优点和不足，这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求.①特异性:该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。②非干扰性:该系统成分不能对细胞通路有干扰。③可诱导性:该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。④诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透入各组织,能通过胎盘屏障及血脑屏障。⑤可逆性:诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。
⑥剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。...文档交流仅供参考...
CHO细胞表达系统
CHO细胞表达系统原理 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。 针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。 但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物
真核表达载体
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
真核细胞表达系统(干货分享)
真核细胞表达系统 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段. 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异
性激活或抑制；...文档交流仅供参考... ②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及； ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考... 1、酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Ｃandiｄa Bodｉni，Pichia Pasｔris3种。以Pichia Ｐastoriｓ应用最多。...文档交流仅供参考... 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中ＡOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/Piｃhia Pastoris的穿梭载体，
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做 真核细胞, 表黑载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株. 拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留. 2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗
性基果正在大肠杆菌中的表黑. 用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位. 亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构. 4、pSV2表黑载体
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统 常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。 1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。 2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。 3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。 哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。常用质粒表达载体如pcMVp-NEO-BAN、pEGFP 等，都以pCMV启动子驱动外源真核蛋白高水平地稳定表达，由于载体有Neo 抗性基因，转染细胞后用G418筛选，可建立稳定高效表达的细胞系。哺乳动物细胞表达常用的宿主细胞有COS、CHO、BHK、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质糖基化有不同的影响，因此选择宿主细胞时应根据具体情况而定。根据不同实验目的，蛋白质可以进行瞬时表达、稳定表达或者一定条件下诱导表达。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞，表达载体 1、pCMVp—NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍 真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。在生 物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。 真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转 化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。 在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白 质药物。植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。 在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。 转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。 一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因 子和调控序列等元件。一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。
实验六 真核基因在原核细胞中的表达
实验六真核基因在原核细胞中的表达 一．目的 了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。 二．原理 外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代- -D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting 检测。 三．器材 微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环 四．试剂 1.5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的 SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2.30%凝胶母液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶 解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g，加重蒸水80ml使其溶解，加1mol/L HCl 14ml，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g，加重蒸水80ml使其溶解，加1mol/L HCl调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液，4℃保存。 6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制），4℃保存。 7.10X Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS10g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝R250染色液：称1g考马斯亮蓝R250，甲醇500ml，冰醋酸100ml，定容1L。 9.脱色液：10 ml 冰乙酸；45 ml甲醇；45 ml蒸馏水 10.IPTG: 1M 五．实验步骤 （一）诱导表达 1.将含有pET32和pET32重组子的BL21菌落分别接种于5ml含氨卞青霉素（50μg/ml）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。（第一天） 2. 然后分别取100μl培养液（2%的接种量）于5ml氨卞青霉素（50μg/ml）的LB培养基中，震荡培养2-3h。 3. 测OD600达1.2左右，取出1ml样品作为IPTG诱导前的样品1。 4.在剩余样品中添加IPTG，终浓度为1mM，继续震荡培养。 5在4小时后取出1.0ml样品作为IPTG诱导后的样品。 6. 所有样品5000rpm 离心5min，分别回收它们的上清与沉淀，做好标记，-20 ℃保存。（第二天） （二）SDS-PAGE（第二或三天）建议：可以先配置分离胶，利用其凝固的时间处理样品，以便节省时间。 1. 上清样品各30μl，添加10μl的4×SDS loading buffer，混匀。 2.沉淀中加入200μl pH7.4的PBS缓冲液洗涤，5000rpm离心5min。重复两次。
真核表达系统
真核表达系统 原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。 一、优势 1.具转录后加工系统； 2.具翻译后修饰系统； 3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。 二、真核基因结构及表达调控特点： (一)、基因结构特点： 1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)
克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。 2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生 物转录、翻译不可能持续进行。 3.不持续性：内含子、外显子。 内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。 4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。 因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。 5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真 核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。
CHO细胞表达体系及其特点
CHO细胞表达体系及其特点 来源：易生物实验浏览次数：250 网友评论0 条 CHO细胞表达体系 关键词：细胞特点体系CHO细胞表达 子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。 针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。 但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往
真核基因不同水平上的表达调控
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真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次（图真核生物基因表达中可能的调控环节）。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。 （一）DNA水平的调控 DNA水平上的调控是通过改变基因组中有关基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。这一类的调控机制包括基因的扩增、重排或化学修饰。其中有些改变是可逆的。 1、基因剂量与基因扩增 细胞中有些基因产物的需要量比另一些大得多，细胞保持这种特定比例的方式之一是基因组中不同基因的剂量不同。例如，有A、B两个基因，假如他们的转录、翻译效率相同，若A基因拷贝数比B基因多20 倍，则A基因产物也多20倍。组蛋白基因是基因剂量效应的一个典型实例。为了合成大量组蛋白用于形成染色质，多数物种的基因组含有数百个组蛋白基因拷贝。 基因剂量也可经基因扩增临时增加。两栖动物如蟾蜍的卵母细胞很大，是正常体细胞的一百倍，需要合成大量核糖体。核糖体含有rRNA分子，基因组中的rRNA基因数目远远不能满足卵母细胞合成核糖体的需要。所以在卵母细胞发育过程中，rRNA基因数目临时增加了4000倍。卵母细胞的前体同其他体细胞一样，含有约500个rRNA基因（rDNA）。在基因扩增后，rRNA基因拷贝数高达2×106。这个数目可使得卵母细胞形成1012个核糖体，以满足胚胎发育早期蛋白质大量合成的需要。 在基因扩增之前，这500个rRNA基因以串联方式排列。在发生扩增的3周时间里，rDNA不再是一个单一连续DNA片段，而是形成大量小环即复制环，以增加基因拷贝数目。这种rRNA基因扩增发生在许多生物的卵母细胞发育过程中，包括鱼、昆虫和两栖类动物。目前对这种基因扩增的机制并不清楚。 在某些情况下，基因扩增发生在异常的细胞中。例如，人类癌细胞中的许多致癌基因，经大量扩增后高效表达，导致细胞繁殖和生长失控。有些致癌基因扩增的速度与病症的发展及癌细胞扩散程度高度相关。 2．基因丢失 在一些低等真核生物的细胞分化过程中，有些体细胞可以通过丢失某些基因，从而达到调控基因表达的目的，这是一种极端形式的不可逆的基因调控方式。 如某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育到一定阶段后，许多体细胞常常丢失整条染色体或部分染色体，而只有在将来分化生殖细胞的那些细胞中保留着整套的染色体。在马蛔虫中，个体发育到一定阶段后，体细胞中的染色体破碎，形成许多小的染色体，其中有些小染色体没有着丝粒，它们因不能在细胞分裂中正常分配而丢失，在将来形成生殖细胞的细胞中不存在染色体破碎现象。 但是，基因丢失现象在高等真核生物中还未发现。 3．DNA重排（基因重排） 基因重排(gene rearrangement)是指DNA分子中核苷酸序列的重新排列。这些序列的重排可以形成新的基因，也可以调节基因的表达。这种重排是由基
真核细胞常见表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，要紧由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因和pBR322骨架组成，在大多数真核细胞内都能高水平稳固地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418挑选，可成立稳固的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1 位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent ProteinVector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40初期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因和HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418挑选稳固转染的真核细胞株。另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确信外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40初期启动子、Tn5的neomycin/kanamyc in抗性基因和HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418挑选稳固转染的真核细胞株。另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因此在活细胞和固定细胞中观看到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体
第六章 真核生物基因表达调控教案
教案首页 课程名称分子生物学任课教师李市场 第6 章原核生物的表达调控计划学时 4 教学目的和要求： a)真核生物的基因结构与转录活性 b)真核基因的转录 c)反式作用因子* d)真核基因转录调控的主要模式 e)其他水平上的基因调控 重点： 真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。 难点： 真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。 思考题： 1真核基因转录调控的主要模式有哪些？
第六章真核基因表达调控 原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。 真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有3×109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！ 真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现"预定"的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。 真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类： 第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。 第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。 转录水平调控（transcriptional regulation）； 转录后水平调控（post transcriptional regulation）； 翻译水平调控（translational regulation）； 蛋白质加工水平的调控（regulation of protein maturation）等。 研究基因调控主要应回答3个问题： ① 什么是诱发基因转录的信号？ ② 基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成） 实现的？ ③ 不同水平基因调控的分子机制是什么？ 一、真核基因组的一般构造特点 ① 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核 生物中常见的多基因操纵子形式。 ② 真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是 裸露的。 ③ 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间