真核细胞常见表达载体
真核细胞罕见表达载体之马矢奏春创作
真核细胞, 表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN载体
特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对, 主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是, 由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在, 转染细胞后, 用G418筛选, 可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株.
拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.
2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点, 将外源基因扦入这些位点, 将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体
特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白, 该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白, 因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构.
4、pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的, 克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因, 故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.
5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动, 多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的是, 该表达载体不含有neo基因, 转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株. 其他经常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点, 当外源DNA片段扦入, 转化lacZ基因缺乏细胞, 并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时, 含有外源DNA 载体的细胞将为白色菌落, 而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落, 由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.另外, 这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序. 保管液: TE Buffer
TE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA
用途:
克隆外源DNA片断. 进行基因表达. 使用M13、T7和T3引物进行测序. 存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程, 有些生命活动的机理还不完全清晰, 由于插人的目的基因分歧, 载体构建栗用的顺式组件分歧, 组装的空间位置分歧, 采纳的表达系统分歧, 目的基因表达水平和阳性克隆筛选率城市有很年夜不同.另外, 由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性, 所构建的高效表达载体纷歧定在所有细胞株中均高效表达.再者, 细胞生长状态的不同, 转染方法的分歧培养时阉的长短, 筛选药物浓度的高低, 对表达量都有很年夜影响.所以, 需要综合评价一个表达载体和表达系统, 排除一些不定因素, 筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建.许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中, 年夜年夜提高了目的基因的表达量, 另外一些强的组成型启动子, 如 SV40早期启动子+PHTLv, 已应用于年夜规模生产的细胞系中. 应用以GS为筛选标识表记标帜的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能, 是目前研究的重点.以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体.在同一启动子操纵下, 筛选基因或陈说基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用, 表达
出两种卵白, 因而在理论上可认为, 通过了筛选或表达了陈说基因的克隆必为阳性克隆, 即表达目的基因的克隆, 有报道说这种双顺反子的共表达率为90％.这就年夜年夜提高了筛选率, 简化了实验过程. 将强启动子、增强子和可扩增的筛选标识表记标帜组装在同一载体上, 构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中, 是现今真核表达载体构建研究发展方向.
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域： Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1 3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子和多克隆位点区域：
各种表达载体
表达载体 一、原核细胞表达载体 1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。 请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N- 末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。 2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。 本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 SD P BAD….TACCCGTTTTTTT CC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 Pst1 P BAD GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111 下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果: pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞 Origami(DE3)内高效表达 2. pCAl-n & pCAl-pelB载体 特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体， 含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。 因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水 平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血 酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。 此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇
真核表达载体
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
真核表达载体
常用的哺乳动物细胞表达载体和组成成分 有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。 (1)原核DNA序列：为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。当具备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。 (2)启动子：真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bp到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。启动子的转录效率因细胞而异。因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。 (3)增强子：增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远时仍有活性。许多增强子只能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。 (4)剪接信号：真核基因由许多内含子和外显子组成。被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。一般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能会影响邻近拼接位点的使用效率，在替换外显子时应注意。 (5)终止信号和多聚腺苷化的信号：转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。为了保证目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表达载体上必须包括多聚腺苷化下游的一段序列。最常用的方法是用SV40的一段237bp长的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信号。另一种的方法是将全长cDNA与已组装在表达载体上一个顺式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信号。 （6）遗传标记：从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做 真核细胞, 表黑载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株. 拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留. 2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗
性基果正在大肠杆菌中的表黑. 用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位. 亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构. 4、pSV2表黑载体
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕有表达载体 真核细胞, 表达载体 1.pCMVp-NEO-BAN载体 特色:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,重要由CMVp启动子.兔β-球蛋白基因内含子.聚腺嘌呤.氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多半真核细胞内都能高水安稳固地表达外源目标基因.更重要的是,因为该真核细胞表达载体中抗neo基因消失,转染细胞后,用G418筛选,可树立稳固的.高表达目标基因的细胞株. 拔出外源基因的克隆位点包含Sal1.BamH1和EcoR1位点.留意在此载体中有二个EcoR1位点消失. 2.pEGFP, 加强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特色: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高程度表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子.Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤旌旗灯号构成,能应用G418筛选稳固转染的真核细胞株.此外, 载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用处: 该表达载体EGFP上游有Nde1.Eco47111和Age1克隆位点,
将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融会基因. 借此可肯定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性(代替CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3.pEGFT-Actin, 加强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特色:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高程度表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子.Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤旌旗灯号构成,能应用G418筛选稳固转染的真核细胞株.此外, 载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用处: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融会蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中不雅察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞构造. 4.pSV2表达载体 特色：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目标基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因,故不克不及用来筛选.树立稳固的表达细胞株. 5.CMV4 表达载体
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕见表达载体之马矢奏春创作 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对, 主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是, 由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在, 转染细胞后, 用G418筛选, 可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株. 拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点, 将外源基因扦入这些位点, 将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白, 该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白, 因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构. 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的, 克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因, 故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞，表达载体 1、pCMVp—NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕有表达载体之五兆芳芳创作 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体份子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架组成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可成立稳定的、高表达目的基因的细胞株. 拔出外源基因的克隆位点包含Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.此外，载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基
因在大肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将分解外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.此外，载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中不雅察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构. 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目
几种表达载体
PAcrcii-i on. mH I 表达载体 一、原核细胞表达载体 1. pBAD 载体： 特点； 该表达质粒含有araBAD (arabinose)操纵子的PBAD 启动子和编码该 启动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋口质的原 核细胞表达载体。 请注意： 1.当要杆入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Ndel EcoRl BamHl Kpnl 和Pstl 位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上 均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sacl 和Hindlll 位点。同时记住， 如在不含任何信号肽的PBAD 表达质粒抒入信号肽，其非编码「末端要包含核糖体 结合位点(RBS)核昔酸序列。 2在使用含Omp A 分泌信号肽的PBAD 表达质粒时，请应用Omp A 分泌信号肽 上的Sacl 以及载体Hindlll 酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司LI前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种PBAD表达质粒, 其多克隆位点区域图谱如下： (a).含Omp A分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域 SD PBAD-. TACCCGTTTTTTTCC-. GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT AMA E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Ncol Sacl Kpnl Small BamHl Pstl Hindlll