cho细胞表达系统及筛选原理

Cho细胞表达系统及筛选原理

一、引言

Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。

二、Cho细胞表达系统的原理

Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。

1. 转染

将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。

2. 选择性筛选

为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。

3. 扩增和表达

经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模

蛋白质表达。通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。

4. 蛋白质纯化

经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。

三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用

Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。

1. 高表达水平

Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。

2. 真核细胞表达

与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。

3. 可选择性筛选

通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。

4. 灵活性

Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。它还可以适应多种表达策略，如稳定细胞线和临时表达。

5. 成本效益

相对于其他哺乳动物细胞表达系统，Cho细胞表达系统具有较低的成本。这使得它成为许多研究实验室和生物制药公司的首选。

四、结论

Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，具有高表达水平、真核细胞表达、选择性筛选、灵活性和成本效益等优势。在蛋白质筛选中，Cho细胞表达系统可以快速高效地产生目标蛋白，为研究和应用提供了重要工具。未来，随着技术的不断发展，Cho 细胞表达系统将在蛋白质研究和生物制药领域发挥更大的作用。

cho细胞表达系统及筛选原理

cho细胞表达系统及筛选原理 Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言 Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。二、Cho细胞表达系统的原理 Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。 1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。 2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。 3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模

蛋白质表达。通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。 4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用 Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。 1. 高表达水平 Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。 2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。 3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。 4. 灵活性

CHO细胞表达系统常见问题及解析

C H O细胞表达系统常见问题及解析标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]

1、问：请问有人养过CHO细胞吗文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞cho细胞转染效率高吗参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：（1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。（2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。（3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长

CHO细胞表达系统常见问题及解析

1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：（1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。（2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。（3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA 测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长

参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO 细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。 4、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3. 1，没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪种？这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。（1）野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１（2）CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．

cho细胞的应用场景

cho细胞的应用场景 cho细胞（Chinese hamster ovary cell）是一种常用的哺乳动物细胞系，由中国仓鼠卵巢细胞培养而成。由于其良好的生长特性和高产生物分子的能力，cho细胞已经成为生物制药领域中广泛应用的细胞系。本文将从药物生产、疫苗研发、疾病模型以及基因工程等方面介绍cho细胞的应用场景。一、药物生产 cho细胞广泛应用于药物生产领域。由于其稳定的遗传特性和高产物表达能力，cho细胞成为了大规模生产重组蛋白药物的理想细胞工厂。cho细胞可通过基因工程技术，将需要表达的外源基因导入细胞中，使其产生目标蛋白。这些目标蛋白包括抗体、生长因子、酶和激素等。cho细胞的高产能和稳定性使得药物生产过程更加可靠和高效。二、疫苗研发 cho细胞在疫苗研发中也发挥着重要作用。疫苗是预防疾病的有效手段，而cho细胞可以作为疫苗生产的重要工具。利用基因工程技术，将病原体的抗原基因导入cho细胞中，使其表达目标抗原。这些目标抗原可以激发人体免疫系统产生特异性抗体，从而提供对疾病的保护。cho细胞在疫苗研发中的应用，可以加速疫苗的生产和推广，为人类健康做出贡献。

三、疾病模型 cho细胞也被广泛应用于疾病模型研究中。疾病模型是研究疾病发生机制和药物治疗效果的重要工具。利用基因编辑技术，可以在cho细胞中模拟多种疾病的相关基因突变。通过对这些突变cho细胞的研究，可以深入了解疾病的发生和发展过程，为疾病的诊断和治疗提供理论依据。四、基因工程 cho细胞在基因工程中也有着广泛的应用。基因工程是一种通过改变生物体的遗传信息来获得新的性状或功能的技术。利用基因编辑技术，可以在cho细胞中精确修改特定基因，实现对基因功能的研究和调控。这些基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN 等。通过基因工程技术，可以将cho细胞转化为细胞工厂，产生更多有价值的生物产品。 cho细胞在药物生产、疫苗研发、疾病模型和基因工程等领域都有着广泛的应用。其高产能和稳定性使其成为生物制药领域的重要工具。随着基因编辑技术的不断发展，cho细胞的应用前景将更加广阔。相信在不久的将来，cho细胞将在更多领域发挥其独特的作用，为人类带来更多的福祉。

cho细胞表达

cho细胞表达 Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。 Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。 Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。 Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。首先，选择合

适的载体和表达系统是关键。常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。 Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。 Cho细胞表达系统是一种常用且有效的表达外源蛋白质的系统。其优势在于高效、稳定地表达蛋白质，并能够正确折叠和修饰蛋白质。Cho细胞表达系统在生物医学研究和制药工业中有着广泛的应用前景。但在应用过程中，需要综合考虑多个因素，并在实验中进行优化和验证，以获得最佳的表达效果。

昆虫细胞表达

昆虫细胞表达昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： 1、具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； 2、正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； 3、具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等； 4、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%； 5、可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的

增殖； 6、具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力； 7、通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因； 8、对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。

CHO细胞基本知识

CHO细胞基本知识引言 CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。CHO 细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。本文将介绍CHO细胞的基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。来源 CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用的细胞系之一。现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药行业，特别是重组蛋白的生产。特点 CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。

1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的培养基中生长。其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。 2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的培养条件下，细胞数量可以迅速增加。这对于大规模的生物药物生产非常有利。 3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗传和表达稳定性。这对于生物药物的一致性和稳定性非常重要。 4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗体、生长因子、酶等。这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。培养条件 CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具有重要影响。以下是一些常用的培养条件： 1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或

MSX加压筛选与MTX加压筛选

蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力；氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。 1. CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO 细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO 细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR 启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。

cho细胞培养基础知识

cho细胞培养基础知识 Cho细胞（Chinese hamster ovary cells）是一种常用的哺乳动物细胞系，广泛应用于生物技术和生物制药领域。Cho细胞培养基础知识包括Cho细胞的来源、培养基组成和培养条件等方面的内容。 Cho细胞最早来源于中国仓鼠的卵巢组织，经过多年的传代培养和筛选，形成了具有较高生长速度和稳定生物特性的细胞系。由于Cho细胞具有较好的生长性能和遗传稳定性，已经成为工业生产中最常用的细胞基质之一。 Cho细胞的培养基是维持细胞生长和增殖所必需的营养物质和环境因素的混合物。典型的Cho细胞培养基包括以下组分：基础培养基、补充物和添加物。基础培养基主要由盐类、氨基酸、维生素和能量源等组成，为细胞提供基本的营养物质；补充物包括胎牛血清、人工合成的生长因子和调节因子等，可促进细胞生长和增殖；添加物则在特定的研究和生产需求下加入，如抗生素、抗氧化剂和缓冲剂等。 Cho细胞的培养条件对于细胞生长和表达外源蛋白的效率具有重要影响。常见的培养条件包括温度、pH值、气氛和搅拌等。一般来说，Cho细胞在37摄氏度下培养，pH值维持在7.0-7.4之间，培养箱内保持5%二氧化碳和95%湿度的气氛，同时需要适当的搅拌来保持培养基的均匀性和供氧。

Cho细胞培养的过程中还要注意细胞的传代和冻存。传代是指将细胞从一个培养瓶转移到新的培养瓶中，以保持细胞的生长和增殖。传代的时间间隔和方法取决于细胞的生长速度和特性。在传代过程中，需要使用胰蛋白酶等酶解剂来剥离细胞，并在新的培养瓶中加入适当的培养基。冻存是为了保存细胞的活性和遗传稳定性，一般将细胞悬浮液与冻存液混合后分装成小管，通过冷冻和低温保存来延长细胞的寿命。 Cho细胞培养基础知识的掌握对于Cho细胞的研究和应用具有重要意义。通过了解细胞的来源、培养基组成和培养条件，可以更好地设计和优化Cho细胞的培养和表达系统，提高细胞的生长速度和表达效率，为生物技术和生物制药领域的研究和生产提供基础支持。同时，对于细胞培养的过程和要点的了解，也有助于避免细胞的受污染和突变，确保实验结果的准确性和可重复性。 Cho细胞培养基础知识是研究和应用Cho细胞的基础，包括细胞的来源、培养基组成和培养条件等方面的内容。掌握这些知识可以更好地进行Cho细胞的培养和表达系统的设计和优化，为生物技术和生物制药领域的研究和生产提供基础支持。同时，对于细胞培养过程中的传代和冻存等关键步骤的了解，也有助于确保实验结果的准确性和可重复性。

一文搞定CHO稳转细胞株构建

一文搞定CHO稳转细胞株构建随着生物技术的迅猛发展,全球化资源整合为生物制药行业提供了越来越全面的技术支撑,抗体药物的发展也获得越来越多的重视。抗体药物开发是一个非常繁杂的过程,而稳定细胞株适用于抗体药开发的各个阶段,如重组蛋白和抗体生产、检测分析、功能性研究等等。构建适用于工业生产的高表达细胞株是第一步也是关键步骤之一。普健生物在重组蛋白表达、抗体生产及稳转细胞株构建等方面有着10余年经验。今天小普与大家分享一种基于CHO细胞株构建的高效抗体药开发策略,能显著提高细胞株开发效率,实现高效、稳定的细胞株开发。 CHO表达系统哺乳动物细胞是用于生产单抗在内的商业化治疗性蛋白产品的主要宿主细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞,因为与其他系统相比,CHO细胞具有以下优点： ①CHO 细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能,因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白； ②CHO 细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强,可根据培养要求选择贴壁培养或悬浮培养的方式； ③整合外源基因后的细胞稳定,重组基因能高效扩增和表达； ④表达目的蛋白可由细胞内运输到细胞外,并且CHO 细胞只表达少量的内源蛋白,有利于目的蛋白的提取。 GS筛选系统原理

哺乳动物细胞的培养生长过程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺，哺乳动物细胞通过这一酶促反应获得谷氨酰胺。 CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低,需要在培养基中额外添加外源谷氨酰胺才能促进细胞生长。利用GS抑制剂,L-氨基亚砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体,转染宿主CHO细胞,通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增,只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培养基中生长,从而筛选获得重组表达细胞株。筛选策略 01 宿主细胞选择工业上主要使用两大类CHO细胞： ①G S野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza); ②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。 02 细胞株筛选细胞转染是将外源分子(如DNA,RNA)导入真核细胞，细胞株筛选方案包括一系列步骤： 01重组载体构建选择适合的信号肽，对抗体重轻链基因进行密码子优化。将目的基因构建到普健专有的GS载体上。转染及Minipools筛选02 使用普健生物专利的CHO细胞转染方法进行转染。转染48h后,加压筛选Minipools。利用ELISA或Octet进行初筛，选取最优的30

单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）

单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）作者 l Frank Tao 编辑 l 细胞房间摘要：随着单克隆抗体技术发展，单克隆CHO细胞株筛选技术也日异月新，越来越高效，越来越智能化。本文主要结合自身CHO细胞株开发和细胞培养经验，将目前国内外单克隆抗体CHO细胞株筛选技术进行总结，供行业内参考，促进行业健康发展；问题：如何4-6个月内，筛选到稳定的单克隆细胞株表达在3-5 g/L或以上？关键词：单克隆抗体；CHO细胞；ClonePix；单克隆影像学拍照；Beacon； 1.宿主细胞抗体药物生产的宿主细胞主要NS0、HEK293、Hybridoma、SP2/0、CHO等，但CHO细胞是生产抗体药物应用最广的宿主细胞，CHO细胞类型也比较多，例如：DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S 等。上世纪八九十年代开始，工业上使用较早的是DHFR体系（二氢叶酸还原酶缺陷型）DG44细胞。当细胞培养基内还有MTX（甲氨蝶呤）时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带齐上下100-1000kb的基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可以提高目的蛋白的表达量。现在很多单抗生产的体系依然是DG44。 GS体系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1是近些年发展的一种基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的

氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源的谷氨酰胺培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX），可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要在：该系统不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株做为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养，更强壮；在培养基中无需加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。当然，目前也有商业化的GS缺陷性CHO细胞，主要有lonza公司的CHOK1SV（2002年）和CHOK1SVGS-KO（2012年），Merk 公司（原SAFC）的CHOZN CHO K1（2006年），采用缺陷的GS体系筛选可以缩短单克隆筛选周期，但由于供应商收费昂贵，国内外很多公司依然选择ATCC原始的CHO K1宿主细胞。 2.筛选标记以及表达载体选择表-1 哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记 Table-1 Selectable markers often used in mammalian expression 筛选标记筛选试剂代谢型筛选标记（扩增型基因筛选标记）二氢叶酸还原酶（DHFR）甲氨蝶呤（MTX）谷氨酰胺合成酶（GS）氨基亚砜蛋氨酸（MSX）抗生素筛选标记（非扩增型基因筛选标记）嘌呤霉素抗性（Puromycin acetyltransferase）嘌呤霉素（Puromycin）杀稻瘟霉素脱氨酶（Blasticidin deaminase ）杀稻瘟霉素（Blasticidin ）组氨醇脱氢酶（Histidinol dehydrogenase）组氨醇（Histidinol）潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase）潮霉素（Hygromycin）

CHO细胞表达系统常见问题及解析

CHO细胞表达系统

CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物