菌种的选育

第一章菌种选育

第一节工业常用微生物及要求

一、常见微生物

（一）细菌（bacteria）

发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：

Acetobacter）醋杆菌属（

Lactobacillus）乳杆菌属（

Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌杆菌属（Bacillus subtilis）（

（Brevibacterium）：谷氨酸短杆菌属

Corynebacterium）：谷氨酸棒杆菌属（（二）放线菌（actinomyces）

属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。

Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素链霉菌（Micromonospora）：庆大霉素小单孢菌属（（三）霉菌（mould）

亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。）

Aspergillus）曲霉属（1.

A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬黑曲霉（

酸

A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲米曲霉（

A. flavus）产黄曲霉毒素黄曲霉（

米曲霉和黄曲霉均为半知菌。

Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点青霉属（ 2.

P. citrinum）：产生5'－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为桔青霉（四个单核苷酸。

Rhizopus 3.）接合菌根霉属（

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R. oryzae）米根霉（

R. chinensis）华根霉（

酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。

Monascus） 4.红曲霉属（

淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。

（四）酵母（yeast）

单细胞真核微生物，低等真菌。

Saccharomyces）①酵母属（Saccharomyces cerevisiae）啤酒酵母（Candida）②假丝酵母属（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都产朊假丝酵母（

比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。

Pichia）③毕赤酵母属（

产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。

（五）其它微生物

basidiomycetes） 1.担子菌（即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。

2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。

（六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是：

①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。

②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。

③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。

烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。

温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。. 2

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噬菌体危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。

二、微生物工业对菌种的要求

1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。

2.易控制培养条件，发酵周期较短。

3.抗杂菌和噬菌体的能力强。

4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

第二节工业微生物菌种的选育

在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但发酵工业需要培养微生物使其积累大量的代谢产物。所以要采取种种措施打破菌的正常代谢，积累所需要的代谢产物。如青霉素的原始菌种产黄色素，经菌种选育，可使产生菌不再分泌黄色素。土霉素产生菌产生大量泡沫，经诱变处理改变遗传特性可使泡沫减少，节省大量消泡剂。菌种经诱变获得抗phage的特性。

菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

一、自然选育：从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种

㈠从自然界分离获得菌种

1.采样：取地面5～15 cm的土壤。

2.增殖培养：(富集培养enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。

方法：

（1）控制培养基的营养成分：如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。

（2）控制培养条件：

细菌，放线菌：pH7.0～7.5 35～37℃

霉菌，酵母菌：pH 4.5～6.0 20～28℃

（3）抑制不需要的菌类

分离细菌：加入丙酸钠以抑制霉菌，酵母

分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧

3.纯种分离

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（1）划线法：简单、快速。

（2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，适合分离具有蔓延性的微生物。

固体培养基四区划法接种法

步骤一

接种针先以火焰灭菌法灭菌

步骤二

轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却

步骤三

以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。

步骤四

更换一个新的无菌营养平板

步骤五

将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。

步骤六

重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。

步骤七

由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。

步骤八

重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。

步骤九

重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。

步骤十

在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。

固体培养基的稀释涂抹接种法

【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。

需要使用的仪器——震荡机

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吸取准备好欲稀释的菌液

吸取充分均匀后的菌液

取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记

号为第一次稀释。

将试管于震荡机上，使菌液混合均匀

取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。

将三角玻璃棒浸于酒精中

将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

4.生产性能的测定：纯种分离后得到菌株数量大，不可能一一进行性能测试。一般采用两步法：初筛，复筛。从而获得较好菌株（野生型菌株）（区别于变异菌株）。

初筛：以量为主

复筛：以质为主

㈡从自发突变体中获得菌株

微生物可遗传的特性发生变化称变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。但自发突变的频率较低，往往不能符合工业生产的要求。因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。

二、诱变育种

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。是当前菌种选育的一种主要方法。因为人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，速度快，方法简便。但诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合。所以诱变育种的主要环节是：

（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液——诱变

（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株——筛选

诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。

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诱变剂：

物理：紫外线，快中子

化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍

1.诱变育种的程序

选择出发菌株(parent strain)→制备菌悬液→前培养(添加嘌呤，嘧啶或酵母膏提高变异率)→诱变(物理诱变，化学诱变)→变异菌株的分离和筛选

2.突变株的筛选：

摇瓶筛选法：挑单菌落接斜面→接摇瓶→测生产能力

琼脂块筛选法：打孔器取出培养，置鉴定平板测发酵产量。

①随机筛选：传统方法，但要耗费大量的人力物力。近年来，随着遗传学，生物化学知识的积累，人们对于代谢途径，代谢调控机制了解得更多，所以筛选方法逐渐转向理化性筛选。

②理化性筛选：介绍初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控机理，氨基酸、核苷酸合成途径中普遍存在反馈阻遏和反馈抑制。这对于生产菌本身是有意义的，

可以避免合成过多的代谢物而造成的浪费。但在工业中，需要生产菌产生大量的氨基酸，核苷酸等产物。所以要打破微生物原有的反馈调节系统。

方法㈠降低终产物浓度

a.筛选终产物营养缺陷型

获得缺少第三个酶的突变株，需供给E才生长。限量供给E，可打破反馈调节，产生大量C。

b.筛选细胞膜透性改变的突变株

使终产物排出细胞，以降低细胞内终产物浓度，避免终产物反馈调节。Corynebacterium glutamicum）的生物素营养缺陷型如：用谷氨酸棒杆菌（（biotin deficiency）进行谷氨酸发酵。

生物素：是B族维生素的一种。又称维生素H或辅酶R。生物素是合成脂肪酸所必需的。因为脂肪酸的生物合成是：

利用糖代谢中间产物乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（多酶复合体，辅基为生物素）催化下合成。

因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。

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该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的渗透性发生变化，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外的发酵液中。

如果使用油酸缺陷型菌株或甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在体外大量积累。

㈡筛选抗反馈突变菌株

a.筛选结构类似物抗性突变株

用代谢产物的结构类似物处理微生物细胞，可抑制或阻遏自身的合成酶类。因此细胞由于缺少这种氨基酸不能生长或者死亡。而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍可生长，从而可以筛选出该代谢物的抗反馈突变株。

b.利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

出发菌株经诱变处理，获得对产物敏感的营养缺陷型。再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到恢复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变所得的回复突变株不受产物的反馈抑制。如：谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。

第三节生产菌种的改良

上述诱变育种可以获得高产菌株，缺点是工作量大，且带有相当的盲目性，不能达到定向育种的目的。

随着现代生物技术的发展，原生质体融合，DNA重组可以达到改良菌种的目的。

一、原生质体融合（protoplast fusion）

原生质体：脱去细胞壁，只有细胞膜包裹的球状体。

1.标记菌株的筛选：要求两个亲株性能稳定，并带有遗传标记（营养缺陷型和抗药性）

2.原生质体的制备：用适当的溶壁酶除去细胞壁，得到两种不同的原生质体

3.原生质体的融合与再生：两个亲株的原生质体在高渗条件混合，在助融剂（融合剂）作用下融合，这是原生质体融合的先决条件。然后是细胞壁再生，即恢复完整细胞并能生长分裂(必要条件)。

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4.融合子的选择：

融合后产生两种情况:

真正的融合——产生杂合二倍体或单倍重组体

暂时的融合——形成异核体

所以要获得真正融合子，必须在融合子再生后，进行几代自然分离选择，才能确定。

该方法仍属于一种半理化性筛选，因为尽管采用的两亲株的特性是已知的，但它们基因组的交换和重组是非定向的。

二、DNA重组技术（DNA recombination technology）

又称基因工程，遗传工程。是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门技术。是按人的意志，将某一生物（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体( 受体)细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。

1．目标DNA片断的获得

2．与载体DNA分子的连接

3．重组DNA分子引入宿主细胞

4．从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞

作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。第四节菌种的衰退、复壮与保藏

一、菌种的衰退

衰退的原因：

1.菌种保藏不当

2.菌种生长条件没有得到满足

二、菌种的复壮

1. 纯种分离

2. 通过寄主体进行复壮

3. 淘汰已衰退的个体

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三、菌种保藏

1.原理人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

低温、干燥、缺氧、缺营养物质

2. 方法

（1）斜面保藏法：用螺旋口试管防失水，尽量减少碳源含量

（2）干燥保藏法：沙土管，固体曲

（3）悬液保藏法：将微生物悬浮在不含养分的溶液中(水、生理盐水、buffer) （4）冷冻干燥保藏法：冷冻，减压蒸发除去水分，使生命活动停止

（5）低温保藏法：大多数微生物可在-20℃以下的低温中保藏，比冷冻干燥更为常用。

（6）液氮保藏法

第五节种子的扩大培养

一、微生物的培养方法

1.表面培养：是一种好氧静置培养法。如固体斜面，固体平板，液体培养表面形成的膜状物。

2.固体培养：工业上常用大米，麸皮，米糠，谷壳等，再加一些其它营养成分灭菌后制成。特点: 疏松，培养基内部充满了空气。既可静置培养，又可通风培养，是介于表面培养和深层培养之间的一种培养方式。

3.液体深层培养：又叫液体通风培养。

菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部。在专门的发酵罐中进行。

二、菌种的扩大培养P252

由于工业生产规模的增大，每次发酵所需的种子（纯种培养物）就增多，要使小小的微生物在几十小时内完成如此巨大的发酵转化任务，必须具备数量巨大的微生物细胞才行。

菌种扩大培养的目的：

为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

（一）种子制备的工艺流程

摇瓶

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保藏菌种→试管斜面活化→茄瓶面→种子罐固体培养（一级种子）（二级种子）→摇瓶→种子培养→发酵培养

（二）斜面菌种的培养P247

1.不宜多次移种。一般只移接三次，防自然变异。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。

培养基特点：原料较精细。

（三）一级种子培养（摇瓶）

用三角瓶进行，液体恒温振荡，即摇瓶。

有些发酵产品(如谷氨酸)，一级种子培养不用摇瓶，而是用大型斜面（茄瓶），优点是可一次制备一批大型斜面，置于冰箱中，比液体斜面培养物易于保存，不必每天制备液体一级种子。

培养基特点：使用的原料基本接近于发酵培养基。

（四）二级种子培养（种子罐）

种子罐大小根据发酵罐大小和接种量确定。培养基组成与发酵罐培养基基本一致，但所含的配比量可有差异。

培养基的特点：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于发酵培养基。

大量地接入培养成熟菌种的优点：

1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率。

2.节约了发酵培养的动力消耗。

3.并有利于减少染菌机会。

（五）种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。

①对于生长快的细菌（如谷氨酸），种子罐→发酵罐——二级培养（一级种子罐扩大培养）

②对于生长较慢的菌种（如青霉素生产菌），利用：种子罐→种子罐→发酵罐——三级培养（二级种子罐扩大培养）

（六）接种龄与接种量P253

①种龄：种子培养时间称种龄。

生产中，一般选在生命力极为旺盛的对数生长期。

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种龄过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长

种龄过于年老：导致生产能力衰退

最适种龄通过实验确定。

②接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

发酵罐的接种量大小与菌种特性，种子质量和发酵条件等有关。

一般细菌接种量在1%左右，霉菌接种量在10%左右（7%-15%）

接种量过大：菌种生长快，培养基过稠，溶氧不足。

接种量过小：发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长。

近年来，谷氨酸生产中，以大接种量和丰富培养基作为高产措施。如：高生物素，大接种量，添加青霉素的工艺。

为了加大接种量，有些品种的生产利用双种法，即两个种子罐的种子接入一个发酵罐。

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