植物生理测定方法

1 叶圆片放氧活性的测定

原理：同光合速率一样，叶片光合放氧速率是反应光合能力的一项重要指标，其大小本质上取决于PSII活性的大小。

称取2～3 cm2 叶片约0.2g，用打孔器2-3 mm2的小圆片后放入含有200mmol Trincine-NaOH，100 mmol NaHCO3，pH7.0 的缓冲液中，并用注射器抽真空1min 左右，使缓冲液充分渗入到叶肉细胞里，最后将叶圆片连同缓冲液转移至极谱氧电极(Hansatech，英国)的反应杯里测定放氧活性，测定在20℃及800μmol.m-2.s-1光强下进行，每个样品测定3个重复。

2 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBPCase）活性测定

原理：Rubiscase是光合作用中最重要的关键酶，它既催化RuBP羧化反应，又催化RuBP加氧反应，对植物的光合作用具有重要的调控作用。

参照李合生等[57]的方法，称取0.5g叶片加入匀浆液6ml（100mmol/L Tris-HCl 缓冲液pH7.8，10 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L EDTA，20 mmol/L 2-巯基乙醇，2%聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨匀浆，14000g、4℃离心20min，上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200μL，内含反应介质100mmol/L Tris- HCI 缓冲液(pH7.8)、0.4mmol/L EDTA、12 mmol/L MgCl2）93.3μL、50 mmol/L ATP、50mmol/L 磷酸肌酸，200mmol/L NaHCO3各13.3μL，160 u/ml 磷酸肌酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油醛脱氢酶各6.7μL，5mM/L NADH，蒸馏水各13.3μL，RuBPCase提取液6.7μL 30℃恒温水浴10 min, 最后加入9 mmol/L RuBP 6.7μL反应开始，用Theymo1500型酶标仪96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U，每个样品测定3个重复。

3 磷酸烯醇式丙酮酸（PEPCase）活性测定

原理：PEPCase通过催化CO2和HCO3-之间的快速结合，促进CO2在细胞中扩散并提供羧化底物[。

参照郑炳松[58]的方法，称取0.5g左右叶片加入匀浆液6ml（0.1mol/L Tris-H2SO4，10 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L EDTA ,7 mmol/L 2-巯基乙醇，1%聚乙烯吡咯烷酮，5%甘油pH8.2）冰浴研磨成匀浆，15000g下冷冻离心20min，上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200μL，内含反应介质（0.1mol/L Tris-H2SO4 pH9.2）66.7μL、10 mmol/L MgSO4、10mmol/L NaHCO3各6.7μL，1 mg/mL NADH，50 u/ml 苹果酸脱氢酶各20μL ，蒸馏水，PEPCase提取液各33.3μL，28℃恒温水浴10 min, 最后加40mmol/L PEP 13.3μl反应开始，用Theymo 酶标仪1500型96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U。每个样品测定3个重复。

4 类囊体膜的制备

选用新鲜的植物叶片，4℃冰箱中放置过夜使其消耗一部分淀粉，在预冷的匀浆液（含0.4mol/L 蔗糖，20m mol /L Tris-Hcl，15m mol /L NaCl，2 m mol /L EDTA- Na2 pH 7.8）中快速匀浆，8层纱布过滤，4℃，2000g下离心10min，沉淀为叶绿体，用低渗涨破液（含20mmol/L Tris-Hcl，15mmol/L NaCl，5 mmol/LMgCl2 pH 7.8）悬浮沉淀，匀浆后4℃，500g低速离心去除未破碎的叶绿体和其他大的残渣，上清液在4℃，5000g离心10min得到初提的类囊体膜，涨破液洗涤去除淀粉得到纯化的类囊体膜，保存液（含0.4mmol/L蔗糖，20mmol/L Tris-Hcl，

35mM/L NaCl pH 7.0）悬浮保存在-80℃冰箱备用。

5 类囊体膜PSI、PSII电子传递活性测定

用Clark—氧电极参照Leong 和Anderson的方法[59]并略做修改。PSⅡ电子传递速率（H2O→DCBQ）反应液组成为：蔗糖400mmol/L，DCBQ0.2mmol/L，Ferricya 1mmol/L，Tricine-NaOH(pH 6.5) 50 mmol/L；PSⅠ光合电子传递速率（DCPIP/AsA→MV) 反应液组成为：Sucrose 400mmol/L，MgCl2 5mmol/L，NaCl 10mmol/L，DCPIP 200μmol/L，sodium azide 1mmol/L，MV 0.5mmol/L，DCMU 10umol/L，sodium ascorbate 1mmol/L，Tricine-NaOH (pH 7.5) 50 mmol/L。测定温度为20℃，光强为600μmol photons m-2s-1，叶绿素浓度为20μg/mL，每个样品测定3－5个重复。

6 类囊体膜室温吸收光谱的测定和Gaussian解析

用日本岛津UV一3100型分光光度计测定样品在360——720nm处OD值，每隔0.5nm测定1次，叶绿素浓度为l0μg/mL。吸收光谱用Origin6.1进行Gaussian 解析，解析的具体方法和各个组分的定义参考French[60]，Brown[61]以及Ginkel[62]。

7 SDS-PAGE电泳

参照Laemmli方法。

（1）凝胶配制：15％分离胶（pH8.8，3.75 mM/mL Tris-HCl，15％Arc-Bis(15:0.4)，60mM/mL尿素）；5.4％浓缩胶（pH6.8，3.125 mM/mL Tris-HCl，5.4％

Arc-Bis(2.16:0.058)），聚合时分离胶和浓缩胶各加10％过硫酸铵30μl/10ml，TEMED 10μl/10ml。

（2）样品处理：取等体积和等叶绿素含量的样品增溶液进行增溶，样品增溶液含4% SDS，10% β-巯基乙醇，0.002% 溴酚蓝,1mM/mL Tris-HCl, 5%甘油。混合后沸水浴温育3min，10000g下离心5分钟。

（3）上样和电泳：每电泳槽加2μg叶绿素含量的样品。电极缓冲液含0.1%SDS, 50mM Tris, 384mM 甘氨酸, pH 8.3。采用Bio-Rad Mini-protein II 型电泳槽0.75mm凝胶板，恒压条件下，浓缩胶中60V, 分离胶中110V 电泳约150min，直到溴酚蓝接近凝胶板下沿停止电泳。第一泳道上样4μl 低分子量标准蛋白（上海宝生物）(99kD, 66kD, 45kD, 30kD, 20kD, 14.4kD)。

（4）固定，染色和脱色：凝胶板在固定液（50％乙醇，10％乙酸）中固定4h, 在染色液（1.16％考马斯亮蓝R-250, 25%乙醇，8％乙酸）中染色4h，在脱色液中（25%乙醇，8％乙酸）脱色至背景很浅, 照相保存。

8 细胞色素氧化酶活性测定

参照Terry M等[63]方法。

（1）凝胶配制：15％分离胶（pH8.8，3.75 mmol/mL Tris-HCl，15％Arc-Bis(15:0.4)）；

5.4％浓缩胶（pH

6.8，3.125 mmol/mL Tris-HCl，5.4％Arc-Bis(2.16:0.058)），聚合时分离胶和浓缩胶各加10％过硫酸铵30μl/10ml，TEMED 10μl/10ml。

（2）样品处理：取等体积和等叶绿素含量的样品增溶液进行增溶，样品增溶液含2% LDS，10% β-巯基乙醇，1mM/mL Tris-HCl, 5%甘油。冰浴混合后增溶

10min，4℃，15000g下离心5分钟。

（3）上样和电泳：每电泳槽加10μg叶绿素含量的样品。电极缓冲液含0.1%SDS, 50mM/L Tris, 384mM/L 甘氨酸, pH 8.3。采用Bio-Rad Mini-protein II 型电泳槽0.75mm凝胶板，恒流条件下，3mA/板，0-4℃避光条件下电泳约11h，直到样品接近凝胶板下沿停止电泳。

（4）固定、染色：凝胶板在固定液（50％甲醇，0.5mg/mlTMBZ，1M/L醋酸钠—醋酸，pH4.7 ）中固定30min, 加入0.5% H2O2，立即照相保存。

9 植物组织中游离氨基酸总量的测定

氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。

试剂：

（1）水合茚三酮试剂：正丙醇0.6g再结晶的茚三酮→15ml正丙醇→30ml正丁醇+60ml乙二醇→9ml pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲液。（棕色瓶，4℃有效期10d）

（2）乙酸乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取乙酸钠54.4g→100ml蒸馏水→加热至沸腾，使体积蒸发至60ml左右→冷却→转入100ml容量瓶→加30ml冰醋酸→稀释至100ml。

（3）标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml，取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为5ug/ml 氨基氮之标准液。

（4）0.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸，溶于50ml蒸馏水中，即随配随用。（5）10%乙酸。

实验步骤：

（一）样品制备：

取新鲜样品0.5g→5ml 10%乙酸（研磨）→用蒸馏水稀释至100ml→过滤在三角瓶中。

（二）制作标准曲线

试剂管号

1 2 3 4 5 6

标准氨基酸/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

无氨蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0

水合茚三酮/ml 3 3 3 3 3 3

抗坏血酸/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

每管含氮量/ug 0 1 2 3 4 5

加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，是加热形成的红色被空气逐渐氧化而退去，进而呈现蓝紫色时，用60%乙醇定容至20ml，570nm测吸光度。

（三）样品测定

吸取样品滤液1.0ml，放入20ml干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。

四、结果计算

按下式计算样品中氨基态氮含量。

100g样品中氨基态氮含量=（C×Vt）/（Vs×W）×100

式中：C为从标准曲线上查得的氨基态氮含量，ug；Vt为样品稀释总体积，ml；Vs为测定时样品体积，ml；W为样品鲜重，g。

10可溶性糖和可溶性淀粉：

Soluble sugar was determined by the anthrone method (Li, 2000) using sucrose as the standard. Half a gram of fresh samples was placed in a 25mL cuvette added with 10 mL distilled water, allowed to stand at 100℃for 1 h, and filtered into 25 mL volumetric flasks. Reaction mixture of 7.5 mL contained 0.5 mL extracts, 0.5 mL mixed reagent (1 g anthrone+50 mL ethyl acetate), 5mL H2SO4 (98%), 1.5 mL distilled water. The mixture was heated at 100℃for 1 min and absorbance read at 630nm. Soluble starch was determined by the anthrone method (Li, 2000) with sucrose as the standard. The remainder of measured soluble sugar was transferred to a 25 mL cuvette containing 10 mL distilled water and 1.0 mL HClO4 (9.2 mol L-1). The cuvette was placed in a boiling water bath for 30 min, cooled to 30 ℃, and filtered into 25 mL volumetric flasks. Reaction mixture of 7.5 mL contained 0.5 mL extracts, 0.5 mL mixed reagent (1 g anthrone+50 mL ethyl acetate), 5mL H2SO4 (98%), 1.5 mL distilled water. The mixture was heated at 100℃for 1 min and absorbance read

at 630nm. Total non-structural carbohydrates (NSC) were the sum of soluble sugar and soluble starch.

11 Extraction and analysis of carbohydrate

Carbohydrates were analyzed essentially as described by Pharr et al. (1985) and

Modore et al. (1988). Briefly, 0.5 g (FW) of cucumber seedling leaves were frozen in liquid nitrogen and grounded to fine powder, then extracted three times by 5 ml 80% ethanol at 80℃each. The extracts were pooled and evaporated to dryness at 50℃in vacuum. The residues were dissolved in 1 ml distilled water and were filtered through 0.22 lm filter. Agilent 1200HPLC system was used to analyze carbohydrate. Carbohydrate compounds were separated on a Waters Sugar Pak column (6.5 9 300 mm) at 50_C, using water as the mobile phase with the flow rate of 0.5 ml min-1. Stachyose, raffinose, sucrose, glucose, galactose and fructose were identified by comparison of retention times of known standards (Sigma) and quantified by a refractive index detector (G1362A RID). Total amount of the sugars was sum of the contents of stachyose, raffinose, sucrose, glucose, galactose and fructose. Starch in the extracted tissues was digested with 10 ml 30% HClO4 (v/v) for 24 h at 25℃. The reaction was terminated by incubating at 80℃for 10 min. After centrifugation, the supernatant was transferred to a 25 ml vitreous bottle and filled to regulated volume with distilled water. Starch was determined spectrophotometrically by reference to a glucose standard curve.