α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测课件

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• 机理:
将固定化酶装柱,当底物经过该柱时,在酶的 作用下转变为产物。
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(一)、吸附法
吸附法是将酶与吸附剂接触,再经洗涤除去未 吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技 术,在经济上也最具有吸引力。
1、根据吸附剂的特点分为两种:
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用力
将酶吸附于固体吸附剂的
实验6
α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用的检测
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酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性.现 在被大量使用在食品、化工、医药等领域。然 而,在应用酶的过程中,人们也发现了一些实 际问题: (1)不稳定:酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感,容易失活; (2)不利于工业化使用:溶液中的酶很难回 收,提高了生产成本,也可能影响产品质量。
在医药上的应用:
将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶,注射到患 者体内,可有效治疗苯丙酮尿症。
缺少乳糖酶,不能水解牛乳中的乳糖,引起腹痛腹
泻,可用乳糖酶固相酶在学习交体流P内PT 或体外水解乳糖。
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讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体 后再接收流出液用于鉴定?
答案:因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉 反应需要一定的时间,刚开始流出的液体中由于 反应时间过短,糊精未生成或生成的量太少,所 以不利于后面的颜色鉴定。
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3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途?
答案:在实际生产中,总希望反应的时间越短越 好,这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是 一次性使用的,加温虽在短时间内会使酶变性失 活,但只要使淀粉在短时间内水解即可。
寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉 水解快,而且酶不会因高温而在短时间内变性。 在发酵生产中使用的往往是植物淀粉,如青霉素 发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉,所以耐高温淀 粉酶用途广泛。
• 淀粉溶液+指示剂:
呈蓝色
• 亲和层析洗脱液+指示 剂:
• 贮于呈冰红箱色几天后重复实
验:
呈红色
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固定化酶的用途
在工业上的应用: 柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦; 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清; 葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖,提高甜度。
在化学分析和临床诊断上的应用: 用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。
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2.影响酶在载体(吸附剂)上吸附程度
的因素:
1、pH:影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
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(四)、交联法
是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋白的氨 基相连得到三维的交联网状结构
氨基相连处
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酶的固定化方法
酶 物理吸附法
交联法
包埋法
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固定化酶的性质
• 稳定性增加: 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化: 可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定
怎样解决这些问题呢?
——固定化酶技术
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一、酶与固定化酶
• 酶 活细胞产生的具有生物催化作用的 生物大分子。
• 固定化酶 (固相酶)
将水溶性的酶用物理或化学的 方法固定在某种介质上,使之 成为不溶于水而又有酶活性的 制剂。
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固定化酶的优点
• (1)使酶固定化后有一定的机械强度,催化反应的过 程可管道化、连续化和自动化;
30min
→装入层析柱→10倍体积的蒸馏水洗
涤此注射器,流速为1ml/min(约20滴) (2)可溶性淀粉溶液:
50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中,搅拌均匀。
(3)5mmol/L KI-I2溶液
0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶 解后装入滴瓶中。
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5、实验步骤:
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2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀 粉酶?
答案:可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液,再加 入几滴淀粉酶柱的流出液,混合后用手握住试管 增加温度,几分钟后加入1~2滴KI-I2指示剂,如 仍显蓝色,即流出液中没有淀粉酶了。
用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液, 使其自柱中流出,作用的结果才能表明是淀粉酶 的固相酶作用的结果。
方法.如有机硅胶、活性炭 和石英砂等
离子结合法
利用酶的两性基团和离子 交换剂的相互作用(离子
学习键交流P)PT 。吸附量大
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(二)、包埋法
将酶包埋在多孔的载体中,包埋成格子型 或包埋成微胶囊型
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(三)共价偶联法
是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白 的一些基团,在温和的条件下与载体共价结合,形 成共价键,从而被固定化。
• (2)酶不溶解在催化反应的溶液中,产物更易纯化;
• (3)固定化酶可反复使用,更经济,更利于工厂化生 产;
• (4)固定化酶提高了酶的稳定性,可较长时间贮存和 使用;
固定化酶的不足之处
不能催化一系列反应
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二、酶的固定化
• 方法: 吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
•目的:
水溶性酶 物理、化学方法 不溶于水且有酶活性
淀粉
α-淀粉酶
糊精β-淀粉酶
糖化淀粉酶
麦芽糖
葡萄糖
遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色
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3、设备及用品:
5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气 门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支
4、实验材料及其制备
(1) α-淀粉酶的固定化: 5mgα-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂,搅拌,
• 底物的专一性变化:
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三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
1、实验目的:
(1)制备固定化α-枯淀草粉杆酶菌;的α-淀粉酶:
(2)进行淀粉水解的最测适定p。H5.5~7.5
2、实验原理:
最适温度55~75℃
用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓 度的淀粉溶液经过固定化酶柱后,可使淀粉水解成 糊精。用淀粉指示剂溶液(KI-I2)测试,流出物呈 红色,表明水解产物糊精生成。
将注射器固定在注射器架上
用滴管滴加淀粉溶液,流速0.3ml/min,(尽量慢)
流出5ml后接收0.5ml(约10滴)流出液
加入1~2滴KI-I2溶液,观察颜色
用水稀释1倍后再观察颜色(与对照组比较)
实验后,10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱,放置在4℃冰箱中
几天后重复实验,观察结果
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6、实验结果:
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