α-淀粉酶的固定化以及淀粉水解作用的检测

《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》

实

验

方

案

第二实验班一组

组长：张金昌

组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天

2013．10.15

α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测

一、实验背景资料：

1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、

专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白

质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。

2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；

3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。

广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。此酶既作用于直

链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，

最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分

解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶

制剂。酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。吸附法是酶分子吸附于水不溶性

的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易

得，可以反复使用。

5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优

良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由

物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、

氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。由于六环炭的不规则排列，造成了活

性炭多微孔体积及高表面积的特性。

硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。具

有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很

好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。硅胶的吸附作用主要是物理吸附，可以再生和反

复使用。在碱金属硅酸盐（如硅酸钠）溶液中加酸，使之酸化，再加入一定量的电解

质进行搅拌，即生成硅酸凝胶；或者在较浓的硅酸钠溶液中加酸或铵盐也能生成硅酸

凝胶。将硅酸凝胶静置几小时使之老化，然后用热水洗去可溶性盐类,在60～70℃下烘

干并在约300℃时活化，即可得硅胶。

氧化铝：影响活性氧化铝吸附性能的主要因素包括以下几方面：（1）颗粒粒径：粒径越小，吸附容量越高，但粒径越小，颗粒强度越低，影响其使用寿命。（2）原水PH值：当PH值大于5时，PH值越低，活性氧化铝吸附容量越高。⑶原水初始氟浓度：初始氟浓度越高，吸附容量较大。（3）原水碱度：原水中重碳酸根浓度高，吸附容量将降低。

（4）氯离子和硫酸根离子。（5）砷的影响：活性氧化铝对水中的砷有吸附作用，砷在活性氧化铝上的积聚造成对氟离子吸附容量的下降，且使再生时洗脱砷离子比较困难。

6、石英砂：是石英石经破碎加工而成的石英颗粒，石英石是一种非金属矿物质，是一种

坚硬、耐磨、化学性能稳定的硅酸盐矿物，其主要矿物成分是SiO2，石英砂的颜色为乳白色、或无色半透明状，硬度7，石英砂是重要的工业矿物原料，非化学危险品，广泛用于玻璃、铸造、陶瓷及耐火材料、冶炼硅铁、冶金熔剂、冶金、建筑、化工、塑料、橡胶、磨料等工业。因为其性质稳定、能耐酸、耐碱、耐磨，腐蚀性小，不易燃烧，廉价，所以选择石英砂作为酶的吸附剂。

7、为何选用石英砂？石英砂作为酶的吸附剂的优缺点：

固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。吸附法有物理交换法和离子交换法两种。其中本实验采用的又是物理交换法。该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。

自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

优点：石英砂表面带正电荷，蛋白质为两性物质，在大于其等电点的条件下，蛋白质带负电荷，由此能吸附在石英砂表面，α-淀粉酶被石英砂吸附属于物理吸附法，将蛋白质分子吸附在惰性载体（石英砂）上，酶不会引起变性，且能保持一定酶活力，对蛋白质有高度吸附能力。

缺点：是非金属矿物质，不具有多孔结构，在吸附性上稍差，同时，石英砂质脆，坚硬，易磨细，不利于过滤。吸附剂一般有孔结构，对吸附质有强烈吸附能力，一般不与吸附质和介质发生化学反应，有良好机械强度等，如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

8、固定化酶与游离酶的比较：

9、淀粉遇碘变蓝：直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、

橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度。

10、碘遇淀粉和糊精显不同的颜色：以前认为，淀粉能吸附碘，使碘吸收的可见光的

波长向短的波长方向移动，棕色的碘液就变成蓝色。同理，支链淀粉和糊精也能吸附碘，不过吸附的程度不同，因此呈现的颜色不同。这种解释的有力根据是碘的淀粉液在加热时蓝色消失。这就被认为是加热后分子动能增大，引起解吸的缘故。

近年来用先进的分析技术(如X射线、红外光谱等)研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。

直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。

在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径

0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。

淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。

11、对比中学课本上的这个实验步骤，和我们实验指导上的有何不同？

中学课本在该实验的第六步添加了

与样品2 做对比，课本没有这一步。

注意：加入“稀释1倍的流出液”这一步，目的是防止所取的流出液，由于流速没有控制好的原因，会导致所取的溶液中掺有淀粉，稀释一倍后，加入KI-I2，使更加偏红色，使其与对照组的颜色差异更明显。

二、实验目的

1、中学中，在必修一中学习了“酶的作用和本质、酶的特性”，而此实验在选修一《生物

技术实践》中出现，为了让同学通过实验来具体的了解酶的作用，化抽象为具象，对酶的作用加深理解；

2、了解制备固定化酶的方法—吸附法，让中学生理解固定化酶对淀粉水解的作用；

3、理解并掌握实验室中淀粉水解的测定方法；

4、进一步掌握运用对照来观察实验结果。

三、实验原理

1、淀粉（遇碘显蓝色）→【α-淀粉酶】→糊精（遇碘显红色）→【?-淀粉酶】→麦芽糖

（遇碘不显色）→【糖化淀粉酶】→葡萄糖（遇碘不显色）

2、运用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化的α-淀粉

酶催化后，生成糊精，使流出液加入KI-I2指示液后呈红色，表明水解产物糊精生成。

3、固定化装置—层析柱

四、实验器具和试剂

1、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测试剂盒（α-淀粉酶、石英砂、可溶性淀粉、

5mmol/L KI-I2溶液），固定化酶装柱（层析柱），滤布，电炉，水浴锅，50ml烧杯，5ml 试管4支，5ml量筒，胶头滴管，玻璃棒，电子天平，支架。

2、5mol/L KI-I2溶液的配置方法：碘化钾0.83g；蒸馏水100ml；碘0.127g。先将碘化

钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解。（注：将此液保存在棕色玻璃瓶内。）【注意：配置时KI的作用：在三种可溶于水中的卤素单质中碘的溶解度是最小的，不过由于在第四层有空的七个f轨道，这些轨道可以用来容纳其它能够为碘提供电子的原子、离子或原子团，而恰好，碘原子就是那个可以为碘提供电子的供体，每个碘原子可以为一个碘的阴离子提供一个电子，而每个碘的阴离子可以接受两个碘原子的两个电子，形成了一种I3-的原子团，而这种原子团和很多阴离子或酸根一样是可溶于水的，所以间接增加了碘单质在水中的溶解度。

稳定的碘化物（只要能电离出碘离子就可以和碘形成配合物——I3-离子）可以作为碘在水中的助溶剂，而且碘与碘离子不会因为形成I3-离子而使碘失去原有性质与功能是因为碘与碘离子的反应是可逆的（当碘在消耗过程中减少时，I3-离子就会逆过来变成碘离子和碘单质了，碘又变回来，并且随着碘的不断消耗，I3-离子会不断逆向进行直至接近完全分解成碘单质和碘离子，这样碘就不怕因反应而消耗掉了）所以增加碘化钾这类可以提供碘离子的可溶于水的溶质可以增大碘单质在水中的溶解度，否则试验配置的碘溶液浓度即便很小，但对于碘来说可能早就过饱和了，所以增加适量的像碘化钾这样的助溶剂才可得到试验要求的浓度的。】

五、实验步骤

【配置→固定→洗→吸附→装柱→洗柱→溶解淀粉过柱→检测】

1、配置可溶性淀粉溶液。（已完成）

取可溶性淀粉溶于沸水。（可溶性淀粉先用冷水调成糊状，再加入沸水中。这样溶解才会形成澄清的溶液）将配置好的淀粉溶液放置在60℃（酶的最适温度50℃~70℃，使后期淀粉酶经过时能达到酶的最高催化活性）的水浴锅（水浴锅中添加去离子水）中备用。【此处淀粉浓度配置过低，有待预实验期间调试。】

调试方法：设置淀粉浓度梯度

2、α-淀粉酶的固定化。（材料已称量好，固定15min ）

在50ml 烧杯中将5mg α-淀粉酶溶于4ml 蒸馏水中。（注意：由于酶不纯，可能有些不溶物。）再加入5g 石英砂，不时搅拌（搅拌切忌太用力），固定15min 。（使酶能吸附到石英砂表面）

3、检验未吸附的游离淀粉酶。（5min ）

小心倒掉上清液后（未吸附的游离淀粉酶应该在上清液中），用10~15ml 的蒸馏水小心清洗石英砂2~3次，每次取其上清液0.5ml 于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。再加入1滴KI-I2溶液，若溶液变为蓝色，说明上清液中已无游离α-淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直至淀粉溶液变为蓝色为止。

（检验未吸附的游离淀粉酶是否洗涤干净，每次蒸馏水洗涤都可以使未吸附的游离淀粉酶溶于上清液，而游离淀粉酶可以与加入的淀粉溶液反应，产生的糊精遇碘变红。单纯的淀粉溶液与碘反应会变蓝色。）

4、先把滤布（可以考虑滤纸片，使石英砂不从注射器中漏出）放于

固定化酶柱中，再装入有α-淀粉酶的石英砂约4ml ，装柱过程中可

在装有石英砂的烧杯中加入少量蒸馏水（便于石英砂流入层析柱），

同时适当打开层析柱的调节装置（使多余的液体流出）。（3min ）

5、把灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加淀粉溶液，使淀粉溶液约以0.3ml/min （6滴/min ）的流速过柱，在流出1~2ml 反应液后（让塑料管中的水流出），转动关闭层析柱的调节装置，放置5min 。（充分的反应时间，使后面检测效果明显。）（10min ）

6、打开调节装置，以0.3ml/min （6

滴/min ）的流速过柱，流出1~2ml 反应液后（让塑料管中的溶液流出），用两支试管分别接收0.5ml 流出液，其中一支加入蒸馏水稀释1倍，按以下表格在试管中加入相应试剂，观察结果。（10min ）

7、固定后的α-淀粉酶可以重复利用，实验后用10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化酶柱，

然后放置在4℃冰箱中保存。（不做）

六、实验结果预测：

1、对照组：0.5ml水+1~2滴KI-I2溶液（淡黄色）

2、样品1：0.5ml淀粉液+1~2滴KI-I2溶液（蓝色）

3、样品2：0.5ml淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液（红色）

4、样品3：0.5ml淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液+稀释1倍（浅红色）

七、实验注意事项

1、在α-淀粉酶固定化的过程中，搅拌石英砂时，用力过猛或搅拌时间过长，石英砂会磨细，容易穿过滤布，带入到流出液中；

2、控制滴灌流速。0.3ml/min的流速，我们就可以控制每分钟滴管流出量为每分钟6滴。这样做的目的是控制流速让淀粉和淀粉酶充分接触，反应；

3、在层析柱中加入溶液不要过快，避免由于水的冲力，使石英砂表面不平整；

4、显色。在流出1~2ml后接取1ml过滤液，然后向试管中加入1~2滴KI-I2溶液。切记，KI-I2溶液不要加入太多，以免碘液颜色覆盖糊精淀粉反应后的颜色；

5、保证洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶。

八、思考

1、如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？（见实验步骤第三步）

2、为什么石英砂可以作为酶的吸附剂？作为吸附剂它具有哪些优缺点？（见实验背景资料7）

3、固定化酶与游离酶相比催化效率会发生变化么？为什么？

固定化酶与游离酶相比催化效率会增高。固定化酶由于与底物的接触存在空间位阻，再加上酶被固定化后其流动性降低，所以与底物的接触就受到了限制，活性降低。但是酶的活性降低，不完全以为这酶的催化效率降低，因为一般固定化的酶在温度和酸碱度方面更加区域稳定，

而酶的催化效率又跟温度和酸碱度有极大关系。酶特定法固定后，将酶活性位点展示到同一个方向，那么这些酶的效率大大提高，如果处于游离状态，活性位点处于不同的方向，去和底物反应的效率就降低。

4、还有哪些制备固定化酶的方法？

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。

物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。

（1）吸附法：利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。

物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，

这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。

离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。（2）载体结合法

最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、

酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。

共价键结合法:共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。此法研究较为成熟，其优点是酶与载体问连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。

（3）交联法

依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

（4）包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。