2019_2020学年高中生物第2部分酶的应用第4课时α_淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测学案浙科版

第4课时α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

[学习目标] 1.尝试用吸附法制作固定化α-淀粉酶。2.运用固定化α-淀粉酶进行淀粉水解的测定。3.说明酶固定化的方法及制作原理。4.通过此实验探讨固定化酶的应用价值。

一、固定化技术的基础知识

1.酶

(1)作用：酶是生物体内各种化学反应的催化剂。

(2)特点：它有高度的专一性和高效性。

2.固定化酶

(1)概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

(2)方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。教材实验中用的是吸附法。

特别提醒图示解读：酶固定化的方法

①是吸附法：是将酶吸附到载体表面。

②是共价偶联法：是将酶通过共价键结合到载体的表面。

③是交联法：通过把酶交互连接、相互结合而将酶固定。

④是包埋法：是将酶或者细胞包埋在细微的网格里。

3.将酶改造成固定化酶的原因：酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。

4.固定化酶作用的机理：将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。归纳总结直接使用酶和固定化酶的比较

例1 (2019·嘉兴一中月考)下列不属于固定化酶在使用时的特点的是( )

A.有利于酶与产物分离

B.可以被反复利用

C.能自由出入依附的载体

D.一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应

答案 C

解析 固定化酶由于酶被固定在不溶性的载体上，很容易与产物分离，同时酶也能反复使用，这是固定化酶的主要优点；通常固定化酶的种类单一，所以不能催化一系列酶促反应。 例2 下列与固定化酶相关的叙述中正确的是( )

A.固定化酶是将水不溶性酶固定于某种介质上，使之成为易溶于水，而又具酶活性的制剂

B.将固定化酶装柱，当酶流过该柱时，可催化柱内底物转变为产物

C.酶固定的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等

D.固定化酶的缺点是酶在水溶液中很不稳定，且易与产物混在一起不易分离

答案 C

解析 固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂；与普通酶相比，固定化酶易与产物分离，且固定化酶反应柱中酶已被固定，不能从柱内流出；酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

二、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验

1.枯草杆菌的α-淀粉酶的固定化

(1)枯草杆菌的α-淀粉酶作用的条件：最适pH 为5.5～7.5；最适温度为50～75_℃。

(2)固定化方法——用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。

在烧杯中将5mg α-淀粉酶溶于4mL 蒸馏水中，再加入5g 石英砂，不时搅拌，30min 后，装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4mL)。用10倍体积的蒸馏水洗涤注射器以除去未吸附的游离淀粉酶。

(3)淀粉水解作用的检测原理

淀粉――――→α-――――β-――→糖化葡萄糖

遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色

2.α-淀粉酶固定化实验步骤

↓

↓

流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液

↓

↓

3.实验结果

归纳总结

1.图示解读：α-淀粉酶的固定化反应柱示意图(如图所示)

(1)α-淀粉酶的固定化的介质是石英砂，方法是吸附法。

(2)过程和原理：将α-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。

(3)用淀粉指示剂测试，若流出物呈红色，表明有糊精生成。

2.两次洗涤的作用

(1)α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验过程中，涉及两次对固定化酶柱的洗涤，第一次是α-淀粉酶的固定化时，目的是洗去未吸附的游离的α-淀粉酶。

(2)第二次洗涤是在实验结束时，目的是清除未反应的淀粉和产物以便于下次固定化酶柱的继

续使用。两次洗涤都使用10倍柱体积的蒸馏水对固定化酶柱进行洗涤。

例3(2018·嘉兴高二检测)下列有关淀粉水解作用检测的叙述，错误的是( )

A.实验后，反应柱可常温保存

B.正常情况下，向流出液中滴加KI－I2溶液呈红色

C.实验后，用蒸馏水洗涤反应柱，可洗去未反应的淀粉和产物糊精

D.实验中，向反应柱中滴加淀粉溶液宜慢，使淀粉溶液以0.3mL/min的流速过柱

答案 A

解析实验后反应柱应低温(4℃)保存，以延长酶的寿命。

例4如图为固定化酶反应柱的示意图，请回答下列问题：

(1)将α-淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样α-淀粉酶就可以固定在石英砂上。这种固定化的方法称为________________。30min后，装入如图所示的反应器中，构成固定化酶反应柱，并用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是______________。洗涤时，蒸馏水流速______________(填“能”或“不能”)过快。

(2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以0.3mL/min的流速过柱，控制流速的目的是__________________________________。在流出5mL后接收0.5mL 流出液，加入1～2滴___________________________________________________________，观察颜色。为了使观察到的颜色变化明显，可________后再观察。如果溶液呈红色，说明淀粉水解成为________。

(3)实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是_______________________。洗涤后，放置在4℃冰箱中保存。几天后，可重复使用。

(4)一段时间后，某同学从冰箱中取出此反应柱，重复上述实验，却没有得到相同的结果，试分析可能的原因：_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

答案(1)吸附法除去未吸附的游离的酶不能

(2)保证酶与底物充分反应KI－I2溶液稀释1倍糊精(3)除去反应物及产物(4)酶已经失活或再次操作时相应的反应条件(如温度)不合适等

解析(1)酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等，本题中为吸附法。构成固定化酶反应柱后，用蒸馏水洗涤是为了除去未吸附的一些游离的酶，在洗涤时蒸馏水流速不能过快，流速为1mL/min。(2)以相对较慢的速度使淀粉溶液流过反应柱，可以让吸附着

的酶与底物充分反应。根据KI－I2溶液与淀粉反应呈蓝色，与糊精反应呈红色的原理来鉴定反应情况。(3)实验完成后还需要对反应柱进行洗涤，以除去参与反应的反应物及生成的产物，以便重复使用。(4)一段时间后重复使用得不到相同的结果，排除反应物本身的问题，肯定是酶出了问题，可能这些酶已经失活或再次操作时相应的反应条件(如温度)不合适等。

1.判断正误：

(1)固定化酶可反复永久使用( )

(2)固定化酶技术所用的固定载体一般为液相的( )

(3)反应物对固定化酶的活性没有影响( )

(4)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，提高了产物品质( )

(5)不管是固定化酶柱还是固定化悬浮体，回收后，在一定条件下贮存，还可以利用( )

(6)固定化酶可反复多次利用，节约了经济成本( )

(7)向亲和层析洗脱液中加KI－I2溶液呈红色( )

(8)实验使用的α-淀粉酶的最适pH为5.5～7.5，最适温度为50～75℃()

(9)糊精遇碘显蓝色，淀粉遇碘显红色( )

答案(1)×(2)×(3)√(4)√(5)√(6)√(7)√(8)√(9)×

2.(2018·浙江吴越联盟联考)在合适条件下，将果胶酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球。该过程是对酶进行( )

A.吸附

B.包埋

C.装柱

D.洗涤

答案 B

解析分析题意可知，果胶酶在一定浓度的钙离子溶液中形成凝胶固体小球，说明凝胶固体小球对果胶酶进行了包埋，B项符合题意。

3.下列关于固定化酶和一般酶制剂应用效果的说法，错误的是( )

A.固定化酶生物活性强，可永久使用

B.一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高

C.一般酶制剂参加反应后不能重复利用

D.固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量

答案 A

解析固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离。同时，固定在载体上的酶还可以反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度；固定化酶虽可以多次利用，但不可永久使用。

4.淀粉在各种酶的作用下会依次水解，不同阶段的水解产物遇到指示剂会出现不同的显色反应，下列选项中属于α-淀粉酶的固定化实验中的反应产物和显色现象的是( )

A.淀粉遇碘显蓝色

B.糊精遇KI－I2溶液显红色

C.麦芽糖遇碘不显色

D.葡萄糖遇本尼迪特试剂显红黄色

答案 B

解析该过程所依据的原理是淀粉流经α-淀粉酶固定化酶柱时，淀粉被酶水解成了糊精，而糊精遇到KI－I2溶液显红色。所以A、C、D选项中的反应产物都是错误的，不是淀粉、麦芽糖、葡萄糖，而是糊精。只有选项B正确。

5.在20世纪50年代，酶已经大规模地应用于各个生产领域，到了70年代又发明了固定化酶技术。请回答下列相关问题：

(1)固定化酶技术将酶固定在________________上，使酶既能与__________接触，又能与__________分离，同时固定在载体上的酶还能__________。常用的固定方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

(2)“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验中：

①α-淀粉酶固定在____________上，使用了上图中的方法__________(填号码及名称)。

②实验中，用滴管滴加淀粉溶液时，使淀粉溶液以________的流速过固定化酶柱，目的是________________________________________________________________________。

③灌注了固定化酶的注射器在使用完后要__________________洗涤固定化柱，并放置在______________中保存。

答案(1)不溶于水的载体反应物产物反复利用

(2)①石英砂乙、吸附法②0.3mL/min使淀粉充分与酶接触③用10倍柱体积的蒸馏水4℃冰箱

解析(1)固定化酶技术将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时固定在载体上的酶还能反复利用。

(2)①α-淀粉酶固定在石英砂上，使用了图乙——吸附法；②用滴管滴加淀粉溶液时，使淀粉溶液以0.3mL/min的流速通过固定化酶柱，目的是使淀粉充分与酶接触；③灌注了固定化酶的注射器在使用完后要用10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化柱，并放置在4℃冰箱中保存。

6.(2018·金华十校期末调研)回答与“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测”有关的问题：

(1)在酶的固定化时，共价偶联法比吸附法对α-淀粉酶活性的影响更________(填“大”或“小”)。

(2)实验室常用枯草芽孢杆菌来制备α-淀粉酶，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶的最适pH范围是______________。

(3)在固定化α-淀粉酶水解淀粉作用的检测实验中，固相淀粉酶水解淀粉的鉴定实验结果为：①淀粉溶液加指示剂呈蓝色；②____________________加指示剂呈红色。

(4)枯草芽孢杆菌也是制备蛋白酶的良好原料，为筛选枯草芽孢杆菌的蛋白酶高产菌株，将分别浸过不同菌株(a～e)的分泌物提取液及无菌水(f)的无菌圆纸片置于含某种高浓度蛋白质的平板培养基表面；在37℃恒温箱中放置2～3天，结果如下图。若需要保存a菌株，可将其接种至斜面上，培养后置于________中保存。菌株b提取物周围没有形成明显清晰区的原因：

①________________________________________________________________________；

②________________________________________________________________________。

答案(1)大(2)5.5～7.5 (3)亲和层析洗脱液

(4)4℃冰箱①不能合成蛋白酶或合成的蛋白酶量不足

②合成的蛋白酶不分泌或分泌量不足③分泌的蛋白酶活性低(任意答出两点)

题组一固定化酶

1.(2018·学军中学期中)下列不属于酶的固定化方法的是( )

A.将酶包埋在细微网格中

B.将酶相互连接起来

C.将酶吸附在载体表面

D.将酶加上糖衣做成胶囊

答案 D

2.关于固定化酶技术的说法，正确的是( )

A.固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术

B.固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应

C.固定化酶中的酶无法重复利用

D.固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术

答案 D

解析固定化酶技术就是将水溶性的酶利用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂，其优点是酶被固定在一定装置内可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应；在固定过程中，固定的是酶而不是反应物，因此A、B、C项均错误。

3.下列关于固定化酶的叙述，错误的是( )

A.既能与反应物接触，又能与产物分离

B.可催化一系列反应

C.固定在载体上的酶可被反复利用

D.酶的活性和稳定性受到限制

答案 B

解析固定化酶能催化一种或一类化学反应，不能催化一系列的化学反应。

4.下图所示的酶固定化技术中，属于包埋法的一组是( )

A.①②

B.①③④

C.①④

D.③④

答案 D

题组二α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验

5.某校学生尝试用琼脂作载体，用包埋法固定α-淀粉酶来探究固定化酶的催化效果。实验结果见下表(假设加入试管中的固定化淀粉酶量与普通α-淀粉酶量相同)。实验表明1号试管中淀粉未被水解，最可能的原因是( )

注：“√”表示加入，“－”表示未加入。

A.实验中的温度过高，导致固定化淀粉酶失去活性

B.淀粉是大分子物质，难以通过琼脂与淀粉酶接触

C.水浴保温时间过短，固定化淀粉酶未将淀粉水解

D.实验程序出现错误，试管中应先加入KI－I2溶液后保温

答案 B

解析由于固定化酶是用包埋法固定的，而淀粉是大分子物质，它不能通过琼脂与淀粉酶充分接触，导致淀粉不能被水解而遇KI－I2溶液呈现蓝色。

6.下列有关教材中α-淀粉酶固定化实验的叙述，错误的是( )

A.酶的固定方法为吸附法

B.固定化酶既不溶于水又有酶活性

C.将石英砂加入α-淀粉酶溶液中后，需要充分地不时地搅拌

D.将α-淀粉酶和石英砂混合物装入注射器后，即可滴加淀粉溶液

答案 D

解析将α-淀粉酶和石英砂混合物装入注射器后，需用10倍体积的蒸馏水洗涤注射器，以除去未吸附的游离淀粉酶。

7.下列关于固定化酶实验的叙述，错误的是( )

A.固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量

B.淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉

C.各组实验所用的α-淀粉溶液浓度应相同

D.淀粉溶液的pH对实验结果有影响

答案 A

解析固定化酶柱的长度决定了酶的含量，反应是否充分与淀粉溶液的流速有关，从而决定了产物的浓度；如果淀粉溶液的流速过快，则淀粉与酶接触不充分，从而使淀粉不能被充分水解；各组淀粉溶液的浓度是实验的无关变量，故各组实验所用的淀粉溶液浓度应该相同；温度、pH会影响酶的活性，从而对实验结果造成影响。

8.下列关于固定化酶中用到的反应柱的理解，正确的是( )

A.反应物和酶都可以自由通过反应柱

B.反应物能通过，固定化酶的颗粒不能通过

C.反应物和酶都不能通过反应柱

D.反应物不能通过，酶能通过

答案 B

解析固定化酶的颗粒不能通过反应柱，否则就起不到对酶固定和反复利用的作用。反应物能通过反应柱，在反应物通过反应柱的过程中不断地被酶催化。

9.在果汁生产中使用固定化果胶酶具有很多优点，以下说法中不属于其优点的是( )

A.固定化果胶酶可以重复回收，多次利用

B.固定化果胶酶可以提高酶的稳定性和果汁的质量

C.便于果汁加工工艺操作的连续化、自动化

D.用于处理溃碎果实，可以提高出汁率，促进澄清

答案 D

解析固定化酶主要是让水溶性的酶固定在相应的介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂，达到重复使用、反应物和产物容易分离等目的，可以提高产品的质量等，游离的果胶酶也可以提高出汁率和澄清度，不是固定化果胶酶的优点，故A、B、C项正确，D项错误。

10.下列关于酶和固定化酶的研究与应用的叙述，正确的是( )

A.酶的固定化技术因改变了酶的空间结构而提高了酶的催化效率

B.作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药

C.尿糖试纸含有固定化的葡萄糖和过氧化氢酶而可以反复使用

D.通过包埋法固定的酶的活性不再受温度和pH等因素的影响

答案 B

解析酶的固定化技术没有改变酶的空间结构，A项错误；消化酶在消化道内起作用，则蛋白酶制剂以口服的方式给药，B项正确；尿糖试纸由于使用后不能将反应物和酶分开，所以不能再次使用，C项错误；通过包埋法固定的酶的活性也要受到温度和pH等因素的影响，D 项错误。

11.回答下列有关酶的问题：

(1)酶是生物体中生化反应的催化剂，在工业生产和食品加工中的应用日益广泛。为提高酶的利用率以及产品的纯度，一般需要对酶进行固定化处理，具体方法有吸附法、共价偶联法、________法和________法。

(2)如图为装有固定化酶a的实验装置。其中b是反应柱，c是催化底物。

①若装置中的固定化酶为α-淀粉酶，则通常是利用________法进行固定的，介质一般为石英砂。利用装置进行淀粉水解实验时，在漏斗中加入反应液后的操作是____________________ ___________________________________________________________，

以保证反应充分。对流出的液体用________溶液检测，若呈现________色反应，则说明淀粉被水解成糊精。

②若a是固定化酵母，要想得到较多的乙醇，加入反应液后的操作是________________。

答案(1)交联包埋

(2)①吸附打开活塞1和2，并控制流速KI－I2红

②关闭活塞1和2

解析(1)固定化酶常用的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。(2)①固定化α-淀粉酶通常用吸附法，开始实验后只需打开图示活塞1和2，并使淀粉溶液以0.3mL/min的流速过柱，不能过快，以保证反应充分。在流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液，加入1～2滴KI－I2溶液检测，若溶液呈现红色，说明有糊精生成。②要利用固定化酵母产生较多乙醇，需要创造无氧环境，所以要把活塞1和2关闭。

12.固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量)，分析回答：

(1)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(2)乙图曲线表明浓度为______________的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力也较低的原因是___________________________________________________________。

(3)固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酶一般可重复使用

________次，以后酶活力明显下降。

(4)固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，同时用戊二醛作交联剂，这是因为

________________________________________________________________________。

答案(1)固定化酶比游离酶对温度变化适应性更强且应用范围较广(2)3% 海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足(3)3 (4)直接包埋不紧密，酶分子容易漏出

解析由题图甲可知，固定化酶比游离酶对温度变化适应性更强且应用范围较广。读题图乙

可知，海藻酸钠浓度为3%时，酶活力最好，说明该浓度时海藻酸钠包埋效果最好。观察题图丙可知，固定化酶一般可重复使用3次，使用了3次以后，曲线下降明显，说明酶活力下降很多。包埋不紧密，酶分子容易漏出，所以一般要用戊二醛作交联剂。

13.(2019·台州检测)酶经过固定化后，不仅能提高酶的稳定性，而且容易与产物分开，具有可反复使用等优点。下图为利用枯草杆菌生产α-淀粉酶及固定化实验流程图，回答下列有关问题：

(1)筛选高表达菌株的最简便方法之一是____________。一般通过____________、____________两种手段实现。筛选出的菌株在发酵生产前还需利用________培养基进行扩大培养。

(2)利用物理或化学的方法将α-淀粉酶固定在__________的介质上成为固定化酶。

(3)如图是实验室中α-淀粉酶的固定化装置示意图。实验过程涉及两次蒸馏水体积为装填体积的__________，第二次洗涤的目的是除去________________________________________。

(4)若图中的液体X为淀粉溶液，从反应柱下端接取少量流出液进行KI－I2颜色测试，结果未呈现红色。下列有关此现象的解释错误的是________。

A.反应柱中没有α-淀粉酶被固定

B.流速过快淀粉未被水解

C.接取的流出液是蒸馏水

D.流速过慢淀粉被水解成葡萄糖

答案(1)单菌落分离划线分离涂布分离LB液体

(2)非水溶性(3)10倍残留的淀粉溶液(4)D

解析(1)筛选高表达菌株的最简便方法之一是单菌落分离。一般通过划线分离和涂布分离两种手段实现。对筛选的菌种进行扩大培养，采用LB液体培养基。(2)固定化酶技术是指通过物理或化学的方法将水溶性的酶固定在某种介质上，使其具有酶活性而又不溶于水，因此利

用物理或化学的方法将α-淀粉酶固定在不溶于水(非水溶性)的介质上成为固定化酶。(3)固定化酶柱制作及催化淀粉水解过程中，涉及两次用10倍柱体积蒸馏水洗涤固定化酶柱，第一次洗涤是除去未吸附的α-淀粉酶，第二次洗涤是洗去未反应残留的淀粉溶液。(4)淀粉水解时，

淀粉溶液低速通过固定化酶柱，若流速过快可能导致淀粉未发生反应，检测流出液未呈红色，也可能是酶未被固定化；由于在淀粉溶液流经酶柱之前，用蒸馏水洗涤过酶柱，因此，可能刚开始时收集到的是蒸馏水，因此，A、B、C项均为可能的原因；淀粉被α-淀粉酶水解产生糊精，不可能产生葡萄糖，D项错误。