植物细胞组织培养技术
植物细胞组织培养技术实验指导书
生物实验教学中心
主编：杨卫民
2009-06-01
目录
实验一、植物组织培养培养基母液的配制 (1)
实验二、植物组织培养的培养基配制 (5)
实验三、康乃馨的离体快繁 (9)
实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 (14)
实验五、组织培养物的继代培养 (18)
实验一组织培养基母液的配制
一、仪器及药品
冰箱、天平（0.0001g）
容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml
广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml
烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml
数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺
标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/L NaOH
几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品
蒸馏水
二、方法和步骤：
按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类
中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：
大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。
微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L N6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。
铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。
有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。
植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲
哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含0.1-2mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1mg/ml的母液。
在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。
表1N6朱至清(1975)培养基配方
药品名配方量(mg/L)母液倍数称取量(g/L)
(NH4)2SO4
大量元素463
10×
4.63
KNO3283028.3 CaCl2·2H2O166 1.66 MgSO4·7H2O185 1.85 KH2PO4400 4.0 Na2-EDTA铁盐37.3100× 3.73 FeSO4·7H2O27.8 2.78
MnSO4·4H2O
微量元素4.0
1000×
4.0
ZnSO4·7H2O 3.8 3.8 H3BO3 1.6 1.6 KI0.80.8
盐酸硫胺素
(VB1)
有机物质1
1000×
1.0
烟酸0.50.5
盐酸吡哆醇
(VB6)
0.50.5
甘氨酸 2.0 2.0各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
三、注意事项
1.如药品所带结晶水不同，应进行换算。
2.因常用的MS培养基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验
采用N6培养基替代MS培养基。
实验二培养基的配制
一、仪器设备及试剂
电炉
天平（0.0001g）
高压灭菌锅
量筒：l0ml、20ml、100ml、500ml
烧杯：1000ml、500ml、250ml
移液管：1ml、2ml、5ml
吸管若干、记号笔
三角瓶或试管、试管架
锡铂纸、玻璃棒
配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。
蒸馏水、pH试纸
蔗糖、琼脂等
1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液。
二、方法和步骤
1量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基,先量取约700ml体积的水。
2根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。
物质加入体积或重量
大量元素母液(10×)100ml
微量元素母液(1000×)1ml
有机物质母液(1000×)1ml
铁盐母液(1000×)10ml
蔗糖30g
琼脂8g
吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成
分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如本实验中培养康乃馨侧
芽或茎段时就加入1ml的1mg/ml的6-BA；而另一个实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入
2ml的1mg/ml的2,4-D。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高
而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或
蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯
内溶液是否透明。
3调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定
培养基的pH按照培养材料的要求分别用1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液来
调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基
的pH值要求也不同。
4分装将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。
5培养基的灭菌一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。
6培养基的保存消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。
三、注意事项
激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。
在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。
实验三康乃馨的离体快繁
一、仪器设备和试剂
超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水
培养基N6+1mg/L6-BA
剪刀、枪型镊子
量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子
95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔
纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶
植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等
二、实验材料康乃馨枝条
三、方法和步骤
1外植体灭菌取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间。用0.2%的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。
2接种先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。
超净工作台消毒开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70%的酒精棉球擦净工作台。
接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。
3培养条件：25℃光照13小时/天光强1000Lux
4继代培养（见下一个实验）
5诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6培养基诱导生根
6试管苗移栽〈参见有关其它实验〉
实验四胡萝卜愈伤组织的建立
一、材料和设备
超净工作台或者无菌接种室
培养基N6+2mg/L2,4-D
带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水
解剖刀、枪型镊子、刀片
无病虫的胡萝卜直根数十个
消毒剂0.2%的升汞溶液
70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球
l000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子（可用一次性牙刷）
二、实验材料新鲜胡萝卜、胡萝卜愈伤组织
三、实验步骤'
1选择无伤、无病、形状较规则的胡萝卜，用小刷子在流动的自来水下洗刷胡萝卜，除净表面所有的泥屑。可以根据实验的时期，选用其它的实验材料。
2将胡萝卜切成大约40mm厚的片段,放入100或500ml的烧杯中，倒入消毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30min。在灭菌过程中，在每个材料上做好标记，并对应地放在预接种的培养基边上。接种后在培养瓶上标明培养物名称和培养日期。
3在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5次，以便去除残留的消毒液。
4取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的培养皿中，用无菌解剖刀从两端各切去10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片。取其中的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的培养皿中，再将每一片切成小块，使其每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量一致。
5接种取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口2cm处，手持培养瓶呈45o角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂培养基的表面，注意把靠近根尖的一面接触培养基。然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。每两次转移之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。
6培养接种好的外植体在25℃的培养箱中，黑暗条件下培养四周左右就会形成一块较大的愈伤组织。
实验五组织培养物的继代培养
一、材料和设备
材料从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体
超净工作台
培养基N6+0.5mg/L2,4-D N6+2mg/L6-BA（也可以自已设计）
三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀
70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球
酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶
二、方法步骤
1取材在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、三个不小于5mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状,不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。
2继代转接将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织会产生大块愈伤组织。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。
3实验记录将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化,培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。
思考题及作业：
1愈伤组织是从刚分离的外植体的哪些区域起源的？
2所有的外植体的生长速率都相同吗？
3根据每组的实验结果撰写一份完整的实验论文形式的实验报告，实验报告将作为平时成绩记入总成绩。
植物组织培养复习资料.doc
1.植物组织培养按培养对象分为______ 、 _______ 、________ 、 ________ 、________ 等几种类型。 2.一个己停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成耒分化的愈伤组织的现象称为 n tv 3.不同的灭菌剂其灭菌的机理一般不一样，次氯酸钙和次氯酸钠都是利用分解产生 _________ 来杀菌的；升汞是靠 ________ 来达到灭菌日的。 4.去除植物病毒的主耍方法是 _____ 和_______ 两种方法，当把二者结合起來脱毒效 果最好 5.在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以 __________ mm、带 ________ 个叶原基为好。 6.White培养基________ 浓度低，适合生根培养。 7.一个已停止分裂的成熟细胞转变为_________ 状态，并形成_________ 的现象称为“ 脱分化”。 8.BA/NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值低时促进 ________ 的生长，这时 _________ 占主导地位；比值高促进_________ 的生长，这时 _________ 占主导地位。 9.进行植物组织培养最基本的前提条件是 _____ 。 1、植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2、组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、空调机、夭平、显微镜、蒸饱水发生器等。 3、糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源，而且还能维持培养菇渗透压 4、培养基灭菌一般在-108 kPa的压力下,锅内温度达121 °C ,维持20-30 min o 5、在离体叶培养中，6?BA和KT利于芽的形成:24D利于愈伤纟FI织的形成 6、在离体叶组织脱分化和再分化培养屮，茎和芽的分化主要有4个途径：方?接产生不泄芽、由愈伤组织产工不定芽、胚状体形成、形成球状体或小鳞茎等途径。 7、目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径是茎尖培养脱毒。 8、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。 1、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和丿、'、/「用阶段。 2、培养基最常用的碳源是蔗糖,使用浓度在1%?5%常用 _3_%o 3、培养基的种类按其态相不同分为固体培养基与液体培养基，其火菌方法一般采用壷热消毒灭菌方法。 4、 pll的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pll大于6.0时，，培养基将会 ___________ ,低于5.0时，琼脂不能很好地凝同。 5、一般情况下，生长索/细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成:比值低有利于芽的形成。
植物细胞培养
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
1plant实验1 植物细胞组织培养
实验1 植物细胞组织培养 1.1 相关基础知识 细胞分化(cell diferentiation)指细胞后代在形态、结构和功能等发生变化的过程，归根结底是某些功能基因的开启或者关闭。一般说来，终端分化细胞已经失去分化潜能，只具有单能性；而大部分细胞只保留了部分分化潜能，称为多能性。对于动物而言，只有部分干细胞仍保留了分化的全能性。而植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物细胞的全能性(totipotency)。 植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养最原始的意义是指愈伤组织培养，但发展至今，其范围已经扩展至植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养： 1)植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养。 2)胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 3)器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段， 茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。 4)组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层， 胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织 ．．．．． 培养 ．．。 5)细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为 接种体的离体无菌培养。 6)原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。 植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。习惯上我们经常使用化学药剂处理，例如氯化汞、次氯酸盐或者抗生素等。将从母株上取下的组织进行一定的剥离和分割，经过流水冲洗数分钟，再浸入适宜浓度的化学药剂中一段时间，最后经无菌水冲洗并适当分割即成外植体。制备外植体的原则是无菌和有活
植物组织培养名词解释
主要概念名词解释 细胞全能性：指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。 分化：指做工作使之瓦解；非特化的早期胚胎细胞获得特化细胞（如心脏、肝脏或肌肉细胞）特性的过程。 脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程。 再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株。 外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。 组织培养：植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌 操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或 生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念 （狭义）指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉 组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从 各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成 再生植物。 愈伤组织：指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。 它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组 织的活细胞。 定芽：生长在枝上有一定位置的芽称为定芽。象顶芽、腋芽、副芽
等均在一定部位生出的芽，称为定芽． 不定芽：从叶、根、或茎节间或是离体培养的愈伤组织上等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。 继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织 转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。消毒：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。 人工种子：将组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损 伤的外膜，形成一种类似于种子的结构。 褐变：饲料在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列 反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应，简称褐变。 污染：指自然环境中混入了对人类或其他生物有害的物质，其数量或程度达到或超出环境承载力，从而改变环境正常状态的现象。玻璃化：将某种物质转变成玻璃样无定形体（玻璃态）的过程，是一种介于液态与固态之间的状态，在此形态中没有任何的晶体结 构存在。 体胚：由体细胞发育成的胚。又称体细胞胚。 茎尖培养：把茎尖的分生组织或包括有此分生组织的茎尖分离进行无菌培养的方法。
植物细胞组织培养的基本技术(总结版).
本章主要内容 ●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ●培养基及其配制 ●外植体的选择与培养 ●试管苗的驯化与移载 第一节商业性组织培养实验室和小工厂 的设计与主要设备 ●培养皿的清洗； ●培养基的配制、分装和高压灭菌； ●无菌操作——材料的表面灭菌和接种； ●将培养物放到培养室培养； ●试管苗的驯化、移栽和初期管理。 (一)、洗涤室(cleaning room) ●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ●室内配备： ●大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ●备有塑料筐，用于运输培养器皿。 ●备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。 (二)、准备室(repairing room) ●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ●如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与 培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室 ●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 ●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。 (四)、无菌操作室(transfering room) ●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏 对组织培养成功与否起重要作用。 ●配置：
●在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁 尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 ●接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射 灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对 流。 (五)、培养室(culturing room) ●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、及其他附属设备而定。 ●设计原则： ●充分利用空间和节省 ●能源 ●高度比培养架略高为 ●宜 ●周围墙壁要求有绝热 防火的性能。 (五)、培养室(culturing room) ●培养架大多由金属制成。 ●规格： ●一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左 右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W 的长1m，宽度一般为60cm。 ●培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或 立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。 ●控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。 (六)、驯化室 ●驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、 通风口以及必要的杀菌剂。 (七)、温室 ●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必 要的杀菌杀虫装置及相应药剂。 二、仪器设备和器皿用具 ●常见仪器设备 ●1、超净台 ●2、无菌箱 ●3、空调机
细胞工程 第三章 植物组织与细胞培养
第 3 章植物组织与细胞培养 3.1植物组织培养与细胞培养的区别 习惯上： 由于体外培养技术最初是从培养组织发展起来的，所以在习惯上，动物学和医学上又往往用组织培养这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。 单细胞培养与组织和器官培养在技术上具有较大的区别 严格意义上： 组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长形成组织。 细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 植物组织培养（Plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花未成熟的果实、种子）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎、原生质等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、或者长成完整的植株的技术。 离体培养（culture in vitro) 试管培养（test tube culture) 常用术语 外植体(explant)：植物组织培养中用来进行离体培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织(callus)：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定的疏松的排列的薄壁细胞。继代培养或传代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物枯竭，水分散失，并已积累一些代谢产物，此时需要将其转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。褐变（褐化）：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生的醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致死亡。 玻璃化(vitrification)：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。 不定芽（adventitious buds)：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽。 不定根（adventitious roots)：从现存的根以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的根。 3.2 发展历史 植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展和完善起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 植物细胞发展工程发展历史就是植物组织培养技术的历史。 发展过程大致划分为三个阶段
植物组织培养 (2)
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件 外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性 李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。 1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术 Guha和Maheshwari等——花药培养 Cocking等-原生质体培养
《植物组织培养》试题及答案教学教材
试卷编号NO： 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号：姓名： 一名词解释：（10*2分=20分） 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空：（30*1分=30分） 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面是 和。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径，一种叫做，另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定，对其灭菌时不能进行，而要进行。 5、一般来说，黑暗条件下有利于的增殖，而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短，继代一次；而固体培
养继代时间可以长些，继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来看，小孢子培养通常产生植株，胚 培养通常产生植株，通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中，对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性作用，但是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时，常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题（1*10分=10分） 某培养基的配方是MS＋BA 2.0mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2.5%蔗糖＋0.7％琼脂粉。MS母液的浓度分别是：大量元素２０倍，微量元素500倍，铁盐100倍，有机物５０倍；BA母液浓度1.0 mg/ml ，NAA母液浓度0.1mg/ml。要配制400ml 该培养基，需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？（要求写出计算步骤）四简答题（5*5分=25分） 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
植物组织培养实验报告
如对你有帮助，请购买下载打赏，谢谢！ 院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期2016.3-6 指导老师实验名称植物组织培养综合实验 一、实验目的 1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法 2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法； 3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法； 4.了解组织培养的基本程序； 5.掌握接种的方法和材料的培养过程； 6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术； 7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体； 8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别 二、实验原理 1.植物细胞的全能性 一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。 2.植物细胞表现出全能性的条件 1.离体状态； 2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）； 3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型 3.无菌条件 把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。 4.脱分化与愈伤组织 已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。 5.培养基 植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。 6.生长调节物质 包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分
植物组织培养
第一章植物的快速繁殖技术 一、快速繁殖的概念 植物一般通过有性繁殖和无性繁殖两种方式繁衍后代。很多花卉、果树林木和一部分粮食作物，由于它们的高度杂合性，常通过扦插、埋条、压条、嫁接或种植特殊的营养器官等方法进行营养繁殖，从而得到和亲本遗传性一致的后代；有些种子休眠期特别长的作物，用营养繁殖可以加快繁殖的速度；某些多年生作物用种子繁殖时要经过一个很长的幼年期，如用成年植物材料进行营养繁殖，常可大大缩短生长期。这些都是无性的营养繁殖。用组织培养繁殖植物的技术是一种特殊的营养繁殖方式，现在一般称之为“快速繁殖技术”（rapid propagation）或“微繁殖技术”（mic-ropropagation）。它是在无菌条件下，利用植物体的一部分，包括细胞、组织或器官，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物的方法。这可以看作是常规营养繁殖方式的一种扩展和延伸，它不但保持了常规方法的特点，而且还具有以下几个明显的优点：（1）使用的植物材料极少，往往只要少量的茎尖、叶片、剪切段或其他器官就能在试管中建立起反复增殖的系统。这样就可以节省常规营养繁殖时所需要的大量母本植株和因栽培和保持这些母株所需的土地和人力，对于珍贵稀有的植物材料还可能做到不毁坏原有的植株。(2)由于每个外植体产生的芽或胚状体常多于常规繁殖方法，每一个繁殖周期又比常规繁殖短得多，一般只要1一2个月，加上可以不受季节和气候条件的影响进行周年生产，所以繁殖速度往往比常规方法要高得多，繁殖的数量在一年中常可达几万、几十万甚至上百万倍。另外，由于试管中芽、植株或胚状体的小型化和利用多层的集约化培养架，可以在有限的空间生产大量的植株。在实际应用中，某些技术较完善的作物，每平方米培养面积一年约可生产一万到几万株，一个熟练工人一年约可生产数试管苗。如萱草，从30个外植体开始，在1.8平方米的培养面积上，8个月可以生产二万棵试管苗。（3）由于快速繁殖是在无菌的容器中进行的，在繁殖过程中不受病虫的侵害。如果和去病源技术相结合，可以大量生产高质、均一的无病苗木，而这一点用常规方法是很难做到的。这样的无菌无病的试管苗在远距离的运输中和国际交流中都是极安全和方便的，既可以防止病害的传播又可以免去复杂的检疫手续。（4）对于某些植物，组织培养产生的植株的表现型和从种子或常规营养繁殖方法得到的植株会有所不同，其性状要优于原植株。如波士顿蕨的试管植株由于不表现强烈的顶端优势而能形成更多的分枝，使植株形态更美观。非洲紫罗兰的试管植株呈莲座状，而用常规叶插方法得到的植株，叶柄长，整个植株更为直立，园艺性状也较差。 快速繁殖技术除了有上述明显的优点之外，和常规的营养繁殖方法相比也有其固有的一些特点，这方面常常容易被人们忽视而造成工作的失败或资金的浪费。首先，和常规方法相比较，要建立一个比较完整的组织培养实验室，需要相当的投资。在发达国家目前约要几万美元，在我国如建立一个包括实验室、培养室和有一定温室面积的系统也要投资几万、十几万以至几十万元，而且如完全使用电能调控光照和温度的话，运转费用也是相当可观的（我国大部分地区夏天需要降温，冬天需要升温，潮湿地区又需去温，以及培养的光照，都要消耗大量的电）。其次，此项工作对人员的要求比较高，除了要求能熟练和严格地进行无菌操作之外，对培养物的生长、分化和它的控制方法要有所了解。在探索一种新的植物的快速繁殖时需要进行大量的系统研究，这就要求有一定的理论知识和实践经验。另外，由于这种方法有可能在短时期内从极少量的外植体产生大量的新植株，所以在材料的选择、工艺流程稳定性的控制、周年生产中的各个环节的安排和衔接上要作精心的组织，否则常可能由于某一环节的失误而导致整个工作的失败。如由于选择了不良的原始材料（不良的基因型、未发现的变异体等），或在培养过程中由于培养方法不当，或因其他原因产生的遗传变异未能及早发现等，而导致最后产生大量的具有严重缺陷的植株。这一点在多年生木本植物中的后果 些性状要经过几年以至几十年的时间才表现出来。在某些培养系统中还会出现对于生产不利的遗传变异，如试管苗中残留的细胞分裂素效应常使分枝过多而影响某些作物的经济性状。 二、快速繁殖技术发展史简略
植物细胞组织培养技术
植物细胞组织培养技术实验指导书 生物实验教学中心 主编：杨卫民 2009-06-01
目录 实验一、植物组织培养培养基母液的配制 (1) 实验二、植物组织培养的培养基配制 (5) 实验三、康乃馨的离体快繁 (9) 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 (14) 实验五、组织培养物的继代培养 (18)
实验一组织培养基母液的配制 一、仪器及药品 冰箱、天平（0.0001g） 容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml 广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml 烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类 中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下： 大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L N6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。 铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲
细胞工程知识点填空(附答案)
专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度： 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体 （2）用途：。（3）地位：是培育、培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括等。化学法一般是用 作为诱导剂。（3）意义： （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用 处理分散成→制成→转入培养瓶中进行培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一 定量的，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防 止。 ②：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 等天然成分。 ③：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④：95%＋5%。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用： 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为核移植（比较容易）和核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞； 卵(母)细胞。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（下图） （4）体细胞核移植技术的应用： ①② ③④ ⑤ （5）体细胞核移植技术存在的问题： 克隆动物存在着问题、表现出缺陷等。 3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来细胞遗传信息的单核细胞，称为。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有等。 （3）动物细胞融合的意义：克服了，成为研究 的重要手段。 （4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法 植物体细 胞杂交 细胞膜的流动性去除细胞壁后诱 导原生质体融合 离心、电刺激、 振动，聚乙二醇 等试剂诱导 克服了远缘杂交 的不亲和性，获得 杂种植株 动物细胞 融合 细胞膜的流动性使细胞分散后诱 导细胞融合 除应用植物细胞 杂交手段外，再加 灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体 的技术之一 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种。从血清中分离出的抗体 。 （2）单克隆抗体的制备过程： 注入小鼠 细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 培养基 体内培养体外培养 从腹水提取从培养液提取 单克隆抗体 核移植 胚胎移植
高中生物技术与生物工程第二章细胞工程第2节植物组织培养学案
第二节植物组织培养 1．理解植物细胞全能性的含义。 2．简述植物组织培养的过程。(重点) 3．说出植物组织培养技术的应用。(难点) 1．植物细胞的全能性 (1)含义 植物体的每一个活细胞都具有形成完整植物体的遗传潜能。 (2)物质基础 植物体的全部体细胞都具有发育为完整个体所必需的全套遗传物质。 (3)现实表现 ①在植物体内，细胞分化成为不同的组织和器官。 ②原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 (4)体现全能性的必需条件 ①脱离原来组织器官的束缚，成为游离状态。 ②一定的营养条件和植物激素的诱导。 2．植物组织培养技术 (1)植物组织培养的概念 ①培养对象：外植体(即离体的植物器官、组织或细胞)。 ②条件：a.无菌，b.含有营养物质的培养基，c.适宜的光照、温度、湿度等环境条件。 ③结果：形成完整植株。 ④核心：诱导脱分化和再分化。 (2)原理 植物细胞的全能性。 (3)过程
探讨1：植物的种子能发育成完整的植株，是否体现了细胞的全能性？为什么？ 提示：没有，因为种子中的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，发育成完整植株的过程，相当于植物的长大。 探讨2：美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发 育成了完整植株，培养过程如下图所示。 此实验说明了什么问题？ 提示：分化的植物细胞仍具有全能性。 探讨3：在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的 瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因可能有哪些？ 提示：接种时培养基灭菌不彻底；接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体；培养过程中 保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质和激素的比例。 [思维升华] 1．植物细胞全能性表达所需条件
植物组织培养技术所有名词解释
植物组织培养复习材料 一、名词解释。 1、植物组织培养(plant tissue culture)：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术 2、脱分化（dedifferentiation）：指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。 3、再分化（redifferentiation）：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。 4、外植体(explant)：植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。（如器官、组织、细胞、原生质体、种子等） 5、愈伤组织(callus)：原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。 6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。包括细胞分化和器官形成。 7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。可进一步发育成植株。 8、细胞全能性（cell totipotency）：指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。 9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。 10、极性：细胞（也可指器官或植株）内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。 11、试管苗：通过组织培养产生的植株。 12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。这块愈伤组织被称为看护组织。 13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。 14、悬浮细胞培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。适用于大规模的培养，使细胞工程的基本平台。 15、植板效率=（每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数）*100 16、实验室的组成及功能：1.基本实验室（1）准备室（2）接种室（3）培养室 2.辅助实验室（1）细胞学实验室（2）摄影室及暗室（3）生化分析室（无菌操作室、化学实验室、培养室、细胞学观察室、暗室）。 17、植物种质：物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质，植物种质资源即为携带各种不同遗传物质的植物总称。 18、玻璃化现象：指试管苗的一种生长失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。其苗称为玻璃化苗。 19、基本培养基：包括大量元素和微量元素（无机盐类）、维生素和氨基酸，还有糖和水等。 20、完全培养基：在基本培养基基础上，根据各种不同试验要求，添加各种植物生长调节物质以及其他复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物。21、外植体褐变：在组织培养过程中，外植体向培养基中释放褐色的物质（醌类）致使培养 １
细胞工程知识点
细胞工程知识点 植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→胚状体 ―→植物体 （2）用途：微型繁殖、作物脱毒（材料： ）、制造人工种子（培养至 ）、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产（培养至 ）。 （3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： 注：杂种细胞的染色体数等于两个杂交细胞的 。 （2）原理： （3）诱导融合的方法：物理法包括 等。 化学法一般是用 作为诱导剂。 （4）意义： 。 动物细胞工程
1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（的器官或组织）→剪碎→用处理分散成单个细胞→制成→转入培养瓶中进行 →贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续。原代培养（10代以内）：遗传物质 传代培养（10代以后）：遗传物质 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为（只有一层细胞）。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就 会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①无菌、无毒的环境：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一定量 的，以防培养过程中的污染。此外，应， 防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 ②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、、无机盐、等。通常 需加入等天然成分。 ③温度：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④气体环境：95% ＋5% 。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、、、培养 医学研究的各种细胞。 （
2017-2018年高中生物 第一单元 生物技术与生物工程 第二章 细胞工程 第2节 植物组织培养学
学业分层测评(五) (建议用时：45分钟) [学业达标] 1．下列有关植物细胞全能性的叙述，正确的是( ) A．只有体细胞才具有发育成完整个体所必需的全部基因 B．高度分化的细胞处于离体状态时不能表现出全能性 C．植物细胞的全能性是植物组织培养技术的理论基础之一 D．配子不能表现出全能性的原因是它所含的基因比体细胞减少一半 【解析】配子也具有发育成完整个体所必需的全部基因，花药离体培养证明配子也具有并且能表现出全能性，细胞表达全能性的首要前提是处于离体状态。 【答案】 C 2．通过植物组织培养技术繁育农作物，其优点不包括( ) A．加快繁育速度B．保持亲本优良性状 C．培育出无病毒植株D．改变植物的基因型 【解析】植物组织培养不能改变植物的基因型。 【答案】 D 3．下列属于组织培养的是( ) A．花粉培育成单倍体植株 B．芽发育成枝条 C．根尖分生区发育成成熟区 D．未受精卵发育成植株 【解析】植物组织培养的过程简要概括为：离体的植物器官、组织或细胞经脱分化，形成愈伤组织，然后经再分化，形成根、茎、芽等器官，并进一步培养出完整的植株。花药离体培养是组织培养的新技术，花药细胞具有全能性；芽发育成枝条、根尖分生区发育成成熟区是正常的生长过程；未受精卵发育成植株是孤雌生殖。 【答案】 A 4．要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要( ) A．具有完整细胞核的细胞B．离体状态 C．导入外源基因 D．一定的营养物质和激素 【解析】要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，需要具有完整细胞核的细胞，细胞处于离体状态，培养基中含有一定的营养物质和激素。 【答案】 C 5．离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不