培养基制作
四、培养基的制备
（一）背景知识介绍
细菌和其它生物体一样，在进行培养增殖的过程中，需要一个营养丰富、环境条件适宜的场所。培养基是由适合于细菌生长繁殖的营养物质配制而成的营养基质。制备培养基的目的在于给细菌创造良好的营养条件。由于细菌具有不同的类型，人们对细菌的研究目的也不同，应配制适合不同细菌生长以及按实验要求设计的不同培养基。但从营养角度分析，培养基一般均应含有满足细菌生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐类等。另外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定的缓冲能力。
1.培养基的类型
由于培养基名目繁多，种类各异。一般按培养基的成分、培养基的外观状态、培养基的功能把培养基分为不同的类型。
按培养基成分的了解可分为：
（1）天然培养基：（基本培养基）是指利用动、植物或其提取物制成的培养基，例如，培养细菌的肉膏蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基等。此种培养基取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便。但是其中的成分不甚清楚，不利于做精确的科学实验。我们的实验常使用此类培养基。
（2）组合培养基：（合成培养基）是指用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。例如培养细菌的葡萄糖铵盐培养基；培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基。此培养基价格较贵，配制较烦琐，有利于做精确的科学实验。我们的实验一般都不用。
（3）半合成培养基：是在天然培养基中加入少量已知的化学物质配制而成的。如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。
按培养基外观的物理状态，可分为：
（1）固体培养基：在液体培养基中加入1％～2％琼脂作凝固剂，就可以制成遇热可融化、冷却可凝固的固体培养基。琼脂又名洋菜，其熔点是96℃，凝点是40℃，所以在一般细菌培养温度下呈固体状态。固体培养基在微生物的科研和实验中，具有极其广泛的用途，如菌种的分离鉴定、菌落计数、菌种的保存等。前面的细菌实验研究中，我们主要用此培养基。
（2）液体培养基：是指未加凝固剂、呈液态的培养基。其组成成分均匀，细菌能充分接触和利用养料，适宜作生理研究用。
（3）半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％～0.5％的琼脂制成的培养基，可用于观察细菌的运动。
按培养基的特殊用途可分为：
（1）加富培养基：是指在培养基中加入人血、血清、动植物组织提取液，培养要求比较苛刻的细菌。
（2）选择培养基：根据某一种微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性设计的培养基。利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。如根据某菌对碳源、氮源等营养物质的特殊要求设计的培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物；在培养基中加入某种化学物质，可以抑制不需要的微生物生长繁殖，如青霉素、四环素、链霉素能抑制细菌和放线菌的生长，结晶紫抑制革兰氏阳性细菌的生长等。选择培养的理化因素有温度、氧气、pH值等。
（3）鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。
2.配制培养基的注意事项
首先应注意营养成分的配比要恰当。我们一般按照培养基的配方进行配制即可；其二要注意控制培养条件。各类微生物所要求的pH值不同，细菌生长所需pH
值在中性或微碱性（pH在7.0～7.5）。由于微生物代谢引起培养基酸碱度的变化，往往会造成对生长的抑制。因此，为了保持培养基pH值的相对稳定，要在培养基中加入一些缓冲剂，由K2HPO4和KH2PO4组成的混合物是常用的缓冲剂。其三配制培养基时注意营养物质要有适合的浓度。浓度太低时不能满足生长需要；太高由于渗透压太大，也能抑制生长。
3.配制培养基的过程
称量→溶化→调节pH值→过滤→分装→塞棉塞和包扎→灭菌。
（1）称量：按照培养基配方，准确称取各成分放入烧杯中。有些原料用量少，不易称量，可先配成高浓度溶液，再按比例换算后，取一定量加入烧杯中。
（2）溶化：加入所需要的水量搅匀，然后加热使其溶解。有些原料不易溶解，如蛋白胨、牛肉膏等，可先在小容器中加水少许，加热溶解后倒入烧杯中。配制固体培养基时，在琼脂熔化过程中要不断搅拌，并控制火力，防止培养基溢出或烧焦。当培养基完全熔化后要补足水分。
（3）调酸碱度（pH值）：先用pH试纸进行比色。如果偏酸或偏碱，可用10％HCI和10％NaOH调整pH值至所需范围。
（4）过滤：培养基中有些成分没完全溶解，则需过滤。常用滤纸、纱布（叠成6层）或纱布间加脱脂棉花过滤。加琼脂的培养基要趁热过滤。
（5）分装：根据需要将培养基分装各种不同的容器中。固体培养基都要趁热分装，各容器的量如下：
三角瓶：一般不超过1/2；试管：视需要而定，若制斜面一般装管高的1/5或1/4；倒平板一般是用时再倒。
分装时应避免培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞而引起污染。
（6）塞棉塞和包扎：分装后试管口及瓶口都要塞好棉塞。做棉塞用普通棉花，其形状、大小、松紧与管口和瓶口要吻合，棉塞1/3露于管外，2/3塞进管内。棉塞的制作和塞入的正确方法见图4-7。
棉塞塞好后，外包厚纸（牛皮纸一层或用旧报纸二层），用绳捆扎。包扎的作用是避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞，并防止接种前培养基的水分散失或污染杂菌。
（7）灭菌：经过分装、包扎的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法一般采用高压蒸汽灭菌，如果没有高压灭菌锅，可采用间歇灭菌法。
高压蒸汽灭菌：是常用的灭菌方法，一般培养基、水、玻璃器皿、用具都可用此方法灭菌。其灭菌的原理是：水的沸点可随压力的增加而提高，当水在密闭的高压锅中沸腾时，其蒸汽不能溢出，致使压力增加，水的沸点和温度也随之增高。高压蒸汽灭菌时蒸汽压与温度的关系如下表。
在热蒸汽的条件下，细菌的芽孢在120℃，经20～30分钟可全部被杀死。因此，一般培养基灭菌时，在15磅/英寸2蒸汽压、121℃温度下，30分钟即可达到灭菌目的。如果培养基中有葡萄糖、乳糖、牛奶等不耐高温的物质时，可在8磅/英寸2经15～20分钟也可使用，但这样灭菌的培养基，应经过保温培养，检查无菌生长后，及时使用，不宜存放。
间歇灭菌：在没有高压灭菌锅时，可采用此方法。其方法是在普通蒸锅中放入培养基，在100℃的温度下蒸30～60分钟。然后放入25～30℃环境中24小时后，再蒸第二次；蒸后再放入25～30℃环境中24小时，然后再蒸第三次。
（二）课题提出
细菌是单细胞，其个体又小，所需营养并不多，但非常容易受环境影响。又由于微生物除了细菌外，还有放线菌、真菌等，它们和细菌混杂在一起，构成自然界的微生物群。这几种微小生物对营养物质的要求、培养所需的pH值等都有较大的差异。如营养物质中的碳源和氮源的比例上（碳/氮），细菌约为碳5/氮1，而霉菌则为碳10/氮1。而且碳源和氮源的物质也有区别。细菌所需酸碱度为中性或微碱性（7.0～7.5），霉菌偏酸牲（4.5～6.0）。我们可以根据细菌对营养等方面的要求和与其它微生物的区别，配制不同的培养基，选择我们需要的菌种。就细菌本身来讲，在营养、温度等方面，不同的细菌也有区别。现在对食用细菌的研究、病原细菌的研究及与工业农业有关的细菌研究上，科研人员都是利用细菌的这些特点，培养和筛选出对人们有利的细菌。我们也可以围绕这方面设计一些课题进行研究。如进行水质调查时和土壤细菌的分离时，能否配制不同的培养基，观察哪种对细菌有利；还可以配制不同的酸碱度，了解细菌最适的pH值是多少；还可以改变培养条件如温度、氧气浓度等，都能作为课题进行研究。
（三）活动范例
1.活动范例1
【活动课题】鉴别细菌培养基的配制。
【课题概述】土壤中微生物的种类、数量都很多，其中细菌的量是最多的。那么土壤细菌在哪一种培养基中容易生长呢？
【活动过程】
（1）样品的采集：在肥沃的土壤据地表3～5cm深度采集新鲜土壤，放入干净的容器中。
（2）制备培养基：按下面配方称量。
培养基①：牛肉膏0.3g 蛋白胨1g
NaCI0.5g 琼脂2g
pH7.0～7.5 水100ml
培养基②：（高氏1号）
可溶性淀粉2g 硝酸钾0.1g
磷酸氢二钾0.05g 硫酸镁0.05g
氯化钠0.05g 硫酸亚铁0.001g
琼脂2g 水100ml
pH7.0～7.5
培养基③：（察氏）
蔗糖2g 硝酸钠0.3g
磷酸氢二钾0.1g 氯化钾0.1g
硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g
琼脂2g 水100ml
pH4.5～6.0
备注：量太少无法称的，可先按现量的10倍或100倍配制，再从中取一定量加入培养基中即可；称牛肉膏、蛋白胨时，可先将玻璃棒和一小烧杯称重，然后用玻璃棒沾取后一起称即可。
将上面三种培养基各按配方称量好后，分别放入烧杯中，在酒精灯上分别加热至完全溶化后再放琼脂。继续加热至琼脂溶化（边加热边搅拌）。然后，趁热放入三角瓶中，塞好棉塞，标明是哪种培养基，用牛皮纸或两层旧报纸包好瓶口准备灭菌。
将九套培养皿用牛皮纸包好；接种及稀释土壤用的移液管和无菌用水都包好装好；包装好的、七支各装有9ml水的试管；装有99ml水的三角瓶（包装好）和培养基一起进行灭菌。
（3）灭菌：
①打开灭菌锅盖，向锅内加入适量水。
②将制备好的培养基和需要灭菌的其它用品，一起放入高压灭菌锅中（装有培养基和水的注意要立着放稳）。不要放得太挤，以免影响蒸汽流通。
③盖好锅盖，采用对角形式均匀拧紧盖上的螺旋，使锅密闭。打开放气阀，开始加热。
④当锅内产生蒸汽后，放气阀开始有热气排出，自开始产生热气后约3分钟（锅内冷空气已排尽），再关闭放气阀。此时锅内温度随蒸汽压力增高而上升。待压力上升到15磅/英寸2，温度达到120～121℃时，要控制热源，恒温20～30分钟，此时必须注意勿使压力继续上升或下降。
⑤停止加热，待压力下降至零时，打开放气阀，排出残留蒸汽，打开锅盖，取出灭菌物品。
注意事项：灭菌过程中，一定注意排净锅内的冷空气，冷空气排不净时，锅内温度达不到灭菌温度，会影响灭菌效果；操作时，必须严格按操作规程操作，否则容易发生意外事故，应在教师指导下操作。
（4）菌悬液的制备：方法按细菌的分离范例中10倍稀释方法，将土壤稀释成10-5、10-6、10-7的菌悬液。
（5）接种：将9套培养皿按下面编号。
培养基①：10-5、10-6、10-7
培养基②：10-5、10-6、10-7
培养基③：10-5、10-6、10-7
在酒精灯火焰旁，按编号的稀释浓度用移液管吸取1ml菌悬液，放入相应的培养皿中。然后各倒入15ml温度在50℃（手模瓶壁感到热但不烫手）的培养基，迅速摇动培养皿，使菌液与培养基混均匀，然后平放待其凝固成平板。
（6）培养观察：将制好的平板倒置放在35～37℃的恒温箱中，培养18～24小时，待平板上长出菌落后，进行观察。从三种培养基平板上的菌落数和菌落的特点进行观察，看哪一种培养基细菌的菌落数多，哪一种细菌的菌落数少。观察结果统计如下：
（7）结果的分析。
（8）结论。
2.活动范例2
【活动课题】水中大肠杆菌的检查。
【课题概述】大肠杆菌是肠道的正常菌群，但如果污染了饮用水，就会使人生病，从而影响人们的健康。因此，往往把水中的大肠杆菌数作为水污染的标志。我们利用大肠杆菌分解乳糖时，产生大量的混合酸，能使伊红与美蓝结合成黑色化合物，使大肠杆菌菌落呈紫黑色并带金属光泽的这一特点，检查池水或湖水和自来水中的大肠杆菌。
【活动步骤】
（1）采集水样：从池塘或湖中取水放入干净的容器中；用干净的容器接取自来水，迅速加盖。
（2）制备培养基：称量时称取其配方量的1/10，配制100ml。
乳糖 10g 蛋白胨 5g
NaCI 5g K2HPO4 2g
2％伊红水溶液20ml0.35％美蓝水溶液20ml
琼脂 2g 水 1000ml
Ph 7.2～7.4
先在水中加入乳糖、蛋白胨、NaCl、K2HPO4，调节pH值后，加入伊红、美蓝水溶液和琼脂。放入三角瓶中，塞棉塞包扎。8磅/英寸2灭菌20分钟。
准备6套培养皿；装有9ml水的试管2支；1ml吸管或移液管5支；均包扎好，与培养基一同放入高压锅进行灭菌。
（3）水样稀释：自来水不稀释。将池塘或湖水按10倍稀释法稀释成10-1、10-2备用。
（4）接种制备平板：先将培养皿编号：
池水（湖水）：未稀释、10-1、10-2自来水：①、②、③（三个重复）。
用吸管各吸取1ml水样，放入相对应的编好号的培养皿中。倒入温度在50℃的培养基各15ml，摇匀后放置凝固。倒置于37℃恒温箱中培养24小时。
（5）观察：通过培养，培养基表面长出细菌菌落。菌落中心呈紫黑色，发金属光泽的是大肠杆菌菌落。
首先应辨认大肠杆菌菌落，然后观察对比池塘水或湖水的培养基中，大肠杆菌菌落数量与自来水的进行比较。
（6）结果分析：池塘水或湖水中的大肠杆菌数量标志着水被污染的程度。自来水中应没有或偶尔有一个（标准是不得超过3个/1000ml）。
（7）结论。
（四）问题与思考
1.细菌和其它微生物对酸碱都有一定的要求，在配制培养基时，可将其调成不同的酸碱度，观察在酸性、中性、碱性环境生长状况。观察哪种酸碱度最适细菌生长。
2.培养基中的抗菌素会不会对细菌的生长有抑制作用呢？哪种抗菌素的作用最大。可将不同的抗菌素加入培养基中制成平板培养后观察，或进行液体培养后镜检，通过检查细菌的密度判断对细菌的影响。
3.对培养基进行灭菌时，要将锅内的冷空气排净，那么，不排净会怎样呢？湿热灭菌时，不等冷气排净即关闭放气阀，并达到灭菌压力。24小时后观察结果。
4.培养不同的微生物所需营养物质不同，你培养的细菌最适的培养基是哪一种？除了常用的几种培养基外，根据细菌的营养要求你能设计几种经济、方便、实用的培养基吗？可尝试着作几种进行对比。
5.不同的细菌对温度、无机盐的浓度要求不同。可以从不同的地方如冰箱中、室温、高温环境中采取样品，接种在平板上进行培养观察；也可配制不同盐浓度的培养基，接种细菌进行培养，看细菌生长如何。
【附录】
1.微生物的菌落特征
细菌菌落特征：菌落形态包括大小（差异大，从1mm到铺满整个培养皿）、形状（有圆形、不规则形、卷发状、假根状等）、边缘（整齐、泼状、锯齿状）、隆起（扩展、台状、低凸、乳头状等）、光泽（有或无）、质地（较粘、较脆）、表面（光滑、粗糙等）、颜色（一般呈灰色，也有白、黄、红、绿、棕色等）。
放线菌菌落特征：由菌丝体组成。质地致密，表面呈较密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不广泛延伸。菌落与培养基结合较紧，不易被挑起，或整个菌落被挑起而不致破碎。
酵母菌菌落特征：与细菌相似，但较细菌菌落大而厚些，菌落表面湿润、粘稠，易被挑起。菌落颜色多呈乳白色，只有少数为红色。
霉菌菌落特征：菌落由分支状菌丝组成。菌丝较粗而长，形成的菌落较松，成绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌的菌落大几倍到几十倍。
2.几种常用的培养基
范例中的三种培养基，是常用于培养细菌、放线菌、霉菌的培养基。培养细菌最好用肉膏蛋白胨培养基；培养放线菌用高氏1号培养基；霉菌用察氏培养基。下面再介绍几种天然培养基的配制方法：
（1）马铃薯培养基
马铃薯 200g 蔗糖或葡萄糖 20g
琼脂 15g 水 1000ml
新鲜的马铃薯去皮，称200g，切成小块洗净，加水1000ml煮沸半小时，用纱布过滤后，补足因蒸发而减少的水分，即成20％马铃薯汁。然后在马铃薯汁中加入琼脂，煮沸至溶化，加糖搅匀，补足水分。在15磅/英寸2或8磅/英寸2灭菌20分钟。
此培养基取自然pH值，加入的是蔗糖，可用于培养霉菌；加入的是葡萄糖，用于培养酵母菌。将pH值调至7.2～7.4，加入的是葡萄糖，用于培养细菌或放线菌。
（2）黄豆芽培养基
黄豆芽 100g 蔗糖或葡萄糖 20g
琼脂 15g 水 1000ml
将黄豆芽洗净，加水煮沸30分钟，过滤，加琼脂溶化，加糖搅匀，补足水分，调pH值。15磅/英寸2或8磅/英寸2灭菌20分钟。
自然pH值，培养霉菌和酵母菌；pH值7.2～7.4培养细菌或放线菌。
（3）肉汁蛋白胨培养基
牛肉 500g 蛋白胨 10g
NaCl 5g pH 7.2～7.4
牛肉去脂肪、筋腱后，绞碎或剁碎，加水1000ml浸泡，15℃时放置12小时或50℃下放置30分钟。用纱布过滤，补足失水。加入蛋白胨和氯化钠后加热，调pH值，灭菌。将上述已灭菌的培养基用棉花过滤，滤去凝集的蛋白质，再灭菌即成液体培养基。加入20g琼脂溶化后灭菌，即成固体培养基。用于培养细菌。
食用菌母种制作-实验一
实验一食用菌母种制作 一、目的要求： 1、了解母种培养基制作过程，理解灭菌原理； 2、掌握母种培养基的制备方法； 3、了解无菌操作基本原理，掌握母种的无菌接种培养方法。 4、了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤； 5、熟练分离出栽培用菌种。 二、主要仪器设备及药品材料： 灭菌锅、超净工作台、酒精灯、电炉、铝锅、漏斗、纱布、菜刀、砧板、烧杯、捆扎绳、硅胶试管塞、试管（18x180mm）、手术刀、镊子、75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、平菇子实体。 三、实验步骤与方法: ①培养基的制作 1 PDA培养基配方 马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升. 2. 母种培养基的配制 (1)熬制。马铃薯洗净，挖芽去皮。称取200克，切成玉米大小颗粒或薄 片。量筒量取1000毫升水，铝锅中煮沸后记时30分钟。四层纱布过滤于量杯中。滤液倒入锅中文火加热，加入葡萄糖和琼脂，不断搅拌，直到琼脂溶化。补足水量至1000毫升。
(2)分装试管。将熬制的培养基用小漏斗趁热分装。培养基高度为试管长 度的1/5左右，注意避免培养基沾于试管口外。分装完成后，盖紧硅胶塞。 （3）捆把。7支试管为一捆，用牛皮纸包裹试管口，用捆扎绳扎紧。贴上标签，准备灭菌。 （4）灭菌。注意加足水量和排气，灭菌完成后降压不能太快。 （5）摆斜面，培养基长度约为试管长度的1/2。斜面试管上覆盖洁净的厚毛巾或几层纱布，防止试管产生过多的冷凝水。 ①菌种分离与培养 （1）种菇选择。选取无杂菌感染，无病虫害，出菇均匀，适应性强的子实体，要求个体健壮，朵大肉厚，外形规整，出菇早，约七八成熟的新鲜子实体。子实体采收后切去大部分菌柄，放入干净器皿备用。 （2）母种分离（组织分离法）。在分离前用75%的酒精棉球擦菇体进行表面消毒，在超净工作台将子实体撕开，用消毒刀片在菌盖与菌柄交接处的组织上取一小块（绿豆大小）移至试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上硅胶塞。将分离的试管放在室避光培养7-8天，检查菌丝生长情况。 四、实验结果 每人制作平菇母种一支。记录母种菌丝的生长情况。 五、作业 1.食用菌菌种分离有哪些方法？实际生产中最常用的方法是哪一种？该方法有何优点？
培养基制备的基本方法和注意事项
培养基制备的基本方法和注意事项 1.培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外．一般均应尽量收集有关资料．加以比较核对．再依据自己的使用目的加以选用，记录其来源。 2 ．培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养推各称，配方及其来源．和各种成份的牌号。最终pH 值、消毒的温度和时间制各的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。 3.培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱．最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后．还应进行一次检查。 4.培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化．也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。 待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化．迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。 5.培养塞pH 的初步调整 培养基各成分完全溶解后，应进行pH 的初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH 会有所变化，例如，牛肉浸液约可降低.而肠浸液pH 却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH ，保证培养基的质量。 pH 调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。
8.常用培养基制备.
&项目八：常用培养基制备 学习目标 能力目标：会进行常用细菌培养基的配制；会正确矫正培养基ｐＨ值； 会对物品进行常规消毒和灭菌。 知识目标：明确常用培养基制备原理、种类及其用途；知道常用培养 基制备程序；知道常用消毒、灭菌的方法。 态度目标：严格按照操作规程进行操作，养成良好的习惯；严格无菌 操作，注意生物安全；配制培养基时准确称量，认真操作。 一、知识链接 培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。细菌生长繁殖需要一定的营养物质，不同的细菌对营养的要求不同，但细菌生长需要的营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类、生长因子和水等。 （一）培养基的种类与用途 １．根据培养基的物理性状分类 （１）液体培养基：呈液体状态的培养基为液体培养基。在实验室中主要用于微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体，在发酵生产中绝大多数发酵都采用液体培养基。 （２）固体培养基：呈固体状态的培养基都称为固体培养基。常用的固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂（约２％的琼脂或５％～１２％的明胶），加热至１００℃，然后再冷却凝固而成的。固体培养基主要用于菌种分离、鉴定、菌落计数、抗菌药物敏感试验等。 （３）半固体培养基：半固体培养基是指在液体培养基中加入少量凝固剂（如０．２％～０．５％的琼脂）而制成，可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力、厌氧菌的培养及菌种保藏等。 ２．根据培养基的功能分类 （１）基础培养基：含有微生物需要的最基本营养成分，可供大多数微生物生长。 （２）营养培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细菌生长，如血平板、血清肉汤等。 （３）选择性培养基：是利用不同种类细菌对各种化学物质的敏感性不同，制成有利于选择欲分离的细菌而抑制其它细菌生长的培养基。如在培养基中加胆酸盐能抑制革兰氏阳性菌的生长，有
细菌真菌放线菌培养基配方
。 细菌培养基：肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的一． 培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 肉膏蛋白胨培养基 1.药品比例： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL， PH7.4～7.6 2.实验器材： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡
萄糖、孟加拉红、链霉素、 1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO、NaCl、K HPO·3HO、MgSO·7HO、222434 FeSO·7HO、4.5mL 无菌水6 管，10%酚液，49.5mL 无菌水( 带玻璃珠)124 瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯。电炉、高压蒸气灭菌锅、超净工作台 . 3.配置方法 （1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至．
所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中， 再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补 足所失的水分。 （3）调pH：检测培养基的pH，若pH 偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH 范围。若偏碱，则用lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 （4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4 层纱 布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般
培养基的制备
培养基的制备 一、配制原则和种类 （一）培养基配制原则 １、培养基：培养基是提供食用菌等生物生长发育所需的营养与特定环境条件的基质，如蘑菇菌是有机营养型中的草腐生菌。制备培养基不仅要考虑它所需要的含碳化合物、含氮化合物、矿物盐类、生长因子，还要考虑水与pH环境，同时还应考虑它们培养方式是固体培养还是液体培养。因此，可以把按菌类生长发育需要比例配制的灭菌营养基质，称为培养基。换言之，培养基必须具备三个条件：含有菌株生长发育所需要的营养物质；具有菌类生长环境条件；经过灭菌，并保持无菌状态。 ２、培养基的选择：在整菌种制备过程中，从母种到原种、栽培种，各个阶段的目的要求有所不同，所选用的培养基的配比也应有所区别。一般母种初生菌丝较嫩弱，分解养分能力差，要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应高。须选用易于被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、蛋白胨、无机盐类及生长素等为等而原种、栽培种所需数量较多，且菌丝分解能力强，可利用大量农作物秸秆、粪草、棉籽壳、麸皮、米糠等原料作为培养基。 （二）培养基的种类 １、根据营养物质的来源，可以把培养基分炎天然培养基、半合成培养基和合成培养基。 （１）天然培养基天然培养基是指用化学成分还不清楚或化学成分不恒定天然有机物配制而成的培养基，如各种农副产品及其下脚料──小麦、大豆、玉米粉、麸皮、米糠、作物秸秆、木屑、棉籽壳、甘蔗渣等，以及动植物组织的浸出液──牛肉膏、肉汤、马铃薯汁、麦芽汁、豆芽汁等都可以用来配制天然培养基，这种培养基来源广，成本低，营养丰富，适合于在生产上大规模培养菌类使用，但这些天然有机物质因产地、品种、生长期的不同，化学成分不能宣。每批成分也不稳定，不宜用来做精细的科学实验。以分离驯化食用菌培养基（２）半合成培养基为了促进食用菌菌丝的生长发育，常在天然培养基中添加适量的无机盐类，或在合成培养基中添加适量的某些天然有机物，就成为半合成培养基。这类培养基种类繁多，应用广泛，也是生长菌种和实际栽培最常用的培养基。 （３）合成培养基是指采用化学成分已知的有机物（碳水化合物、含氮化合物、有机酸类）或无机物配制而成的培养基。这类培养基组成和含量明确，价格较贵，一般用于在实验室范围内做有关营养、代谢、菌种鉴定等有关于食用菌的生理生化研究。 ２、根据培养基制成后的物理状态，可将培养基分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。 （１）液体培养基根据食用菌所需的营养物质，扫一定比例配成营养液，叫液体培养基。液体培养基可进行营养源的筛选实验，以及生理生化方面如酶活力等研究，应用液体培养基生产的菌种也可在生产中进行使用。 （２）固化培养基将各种营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂，如琼脂，即可配成固化培养基。利用这种斜面试管可保藏及扩大菌种，同时亦可制成各种平皿固化培养基分离菌种。 （３）固体培养基利用各种富含纤维素和木质素的农林废弃物如木屑、棉籽壳、秸秆、玉米蕊等作为主要原料，再加入适量的米糠或麸皮和无机盐类制成固体培养基。该培养基可作为二、三级菌种生产用的培养基，也可以用它制成发酵草粉保藏菌种用的培养基。 二、一级种培养基 一级种又称母种，其培养基一般用试管作为容器，所以又称试管斜面培养基，这类培养
PDA培养基的配制及试管斜面制作
PDA培养基的配制及试管斜面制作 1.实验材料 1.1试剂材料 土豆，葡萄糖，琼脂，试管，试管架，天平，注射用硫酸链霉素，注射用青霉素钠，三角瓶，灭菌锅，电磁炉，超净工作台，烧杯，1mL移液器，培养皿 1.2PDA培养基配方 土豆（去皮）200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 蒸馏水1000mL pH 自然 2.实验方法与步骤 2.1称量和熬煮 将土豆去皮，按自己所需的量（例如配制1L）称取土豆，将土豆切成小块放入锅内，加入适量的蒸馏水，在电磁炉上加热至沸腾，30min后用4层纱布在大量杯上过滤，弃掉滤渣，滤液用蒸馏水补足1L。 2.2溶解 用天平称取20g葡萄糖加入滤液中，用玻璃棒搅拌，使其完全溶解。 2.3分装 称取8-10g琼脂，加入所用三角瓶中，然后将滤液分装到三角瓶中，每瓶500mL，用玻璃棒将琼脂搅匀。 2.4加棉塞 培养基分装完毕后，在三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性。 2.5包扎 加塞后，在棉塞外用两层报纸包裹，其外用橡皮筋包扎好，标记。 2.6灭菌 将配制完成的培养基，包好的平板及其他所需用品一起放入灭菌锅灭菌（见灭菌锅使用方法）。 3.试管斜面制作方法与步骤
3.1前两步同2.1，2.1步骤 3.2加热溶解 量取500mL滤液到1000mL的烧杯中，再加入8-10g的琼脂，用玻璃棒搅匀，放入微波炉缓慢加热溶解，加热其间注意不要让培养基溢出烧杯，不时用玻璃棒搅拌。 3.3分装 等琼脂溶解后，将培养基分装到事先准备好的试管中。分装量约占试管高度的1/4，管口尽量不要沾染培养基。 3.4加塞 培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞或橡胶塞，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性。 3.5包扎 加塞后，试管7-9支捆用橡皮筋捆好，在塞外用两层报纸包裹，其外用橡皮筋包扎好，标记。 3.6灭菌 将包好的试管和其他所需灭菌物品一同放入灭菌锅灭菌。 3.7摆斜面 灭菌完成后，将试管拿出，在超净工作台下摆成斜面，根据自己需要选择合适的倾斜度。
临床执业医师考试辅导：培养基的组成成分
临床执业医师考试辅导：培养基的组成成分 尽管不同的细菌对营养的要求不同，但细菌需要的营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等，常用的营养物质如下： 1.蛋白胨：蛋白胨是制备培养基时最常用的成分之一，提供细菌生长繁殖所需要的氮源。是动物或植物蛋白质经酶或酸碱分解而成。不管是蛋白质经胃蛋白酶消化而制成的蛋白胨，还是蛋白质经胰蛋白酶在碱性条件下消化而制成的胰蛋白胨，均含胨、多肽和多种氨基酸，为大多数细菌生长所利用，尤其是含大量色氨酸的胰蛋白胨，更适于测靛基质用的蛋白胨。蛋白胨易溶于水，遇酸不沉淀，不因受高温而凝固，并为两性电解质有缓冲作用。但吸水性强，应注意干燥密封保存。中华考试网 2.肉浸液：是用新鲜牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。其中含有可溶性含氮浸出物和非含氮浸出物。还有一些生长因子。肉浸液可为细菌提供氮源和碳源，但肉浸液中所含氮物质过少而不能满足细菌的需要，因此在制备培养基时应再加入l％～2％的蛋白胨和0.5％氯化钠。 3.牛肉膏：由肉浸液经长时间加热浓缩而制成。糖类在加热过程中被破坏，所以其营养价值低于肉浸液，但因无糖可用作肠道杆菌鉴别培养基的基础成分。由于使用方便，常用于制备培养基。 4.糖类、醇类：为细菌生长提供碳源和能源。制备培养基所用的糖类、醇类有多种，常用的糖类有单糖、双糖和多糖；常用的醇类有甘露醇、卫茅醇等。除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。
5.血液：血液中既含有蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐类等营养物质，又能提供辅酶、血红素等特殊生长因子，所以培养基中加入血液用于培养营养要求较高的细菌。另外，还可根据细菌在血液培养基中的溶血现象而进行鉴定。 6.无机盐类：提供细菌生长的各种元素，如：钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。用于制备培养基的无机盐类有多种，其中最常用的有氯化钠和磷酸盐，前者对维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压非常重要，后者是细菌良好的磷源，并在培养基中具有缓冲作用。 7.鸡蛋和动物血清：虽然不是构成培养基的基本成分，但却是某些细菌生长所必需的营养物质，所以仅用于制备一些特殊的培养基，这些细菌直接从鸡蛋和动物血清中获取营养。如培养结核分枝杆菌的鸡蛋培养基和培养白喉杆菌的吕氏血清培养基等。 8.生长因子：是细菌生长所必需的，但需要量很小。在制备培养基时，常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和含血液培养基中加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。 制备固体培养基时，需要在液体中加入凝固物质。最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。 琼脂是从石花菜中提取出来的一种半乳糖胶，当温度达98℃以上时可溶于水，在45℃以下则凝固成凝胶状态，是一种理想的固体培养基赋形剂。因其不被细菌分解利用，故无营养作用。 在制备培养基时常加入抑制剂和指示剂，这些并不是细菌生长繁殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及判断结果的需要。
各种培养基的制作方法
配方一萨氏（Sabouraud's）培养基 蛋白胨10克琼脂20克麦芽糖40克水1000毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 1.营养肉汤培养基 牛肉膏 0.3克 蛋白胨 1.0克 NaCl 0.5克 水 100毫升 pH 7.0～7.2 在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，加热溶化后，调节pH值至7.0～7.2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。常用于培养细菌。 2.营养琼脂培养基 在营养肉汤培养基中增加20克琼脂即成。常用于培养细菌。 3.肉汁蛋白胨液体培养基 牛肉 500克 蛋白胨 10克 NaCl 5克 pH 7.1～7.2 取新鲜牛肉500克，去净脂肪、筋腱后，绞碎或剁碎，加水1000毫升浸泡，15℃下放置12小时或50℃下放置半小时。用纱布将肉汁过滤，补足失水。向肉汁中加入蛋白胨和食盐。将肉汁加热，放入苏打（碳酸钠）至红色，调整pH值。分装，高压蒸汽灭菌。 将上述已灭菌的培养基用棉花滤去凝集的蛋白质，制成液体培养基，如需制成固体培养基，可在每100毫升液体中加入2克琼脂，加热溶化后，分装，再次进行高压蒸汽灭菌。常用于培养细菌。 4.高氏一号培养基（淀粉琼脂培养基） 可溶性淀粉 2克 K2HPO4 0.05克 MgSO4·7H2O 0.05克 KNO3 0.1克 NaCl 0.05克
FeSO4 0.001克 琼脂 2克 水 100毫升 pH 7.2～7.4 在烧杯中加水95毫升，加热至沸腾，取可溶性溶粉2克，用5毫升水调成糊状，倒入沸水中和匀。再称取其它药品，陆续加入烧杯内（待一种药品溶解后，再加入第二种药品）。待全部药品溶解后，停止加热，补足失水，调pH值至7.2～7.4。分装后，高压蒸汽灭菌。本培养基常用于培养放线菌。 5.马铃薯蔗糖培养基 马铃薯 200克 蔗糖 10克 琼脂 20克 水 1000毫升 自然pH 称取200克马铃薯片，加水1000毫升，煮沸半小时，用纱布过滤，补足失水。在上述滤汁中加入10克蔗糖、20克琼脂，加热使琼脂熔化。分装后，高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 6.麦芽汁培养基 将从啤酒厂买来加有啤酒花的麦芽汁，装入锥形瓶中，加塞高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 7.察氏培养基 NaNO3 2克 K2HPO4 1克 KCl 0.5克 MgSO4 0.5克 FeSO4 0.01克 蔗糖 30克 琼脂 15～20克 水 1000毫升 自然pH
培养基配方及配制方法
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
培养基配制的基本过程
培养基配制的基本过程 1.配制溶液 向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。 配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。 2.调节pH值 用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。 3.过滤 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。 4.分装 已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。 装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。 5.加棉塞 分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 6.制作斜面培养基和平板培养基 培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。 (1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。 (2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
斜面培养基的制作方法
斜面培养基制作方法(仅供参考) 1斜面培养基 斜面培养基（agarslantculture-medium ）：固体培养基（solid culture medium ）的一种形式；制作时应趁热定量分装于试管内，并凝固成斜面的称为斜面培养基，用于菌种扩大转管及菌种保藏。其制作流程图如下图1. 图1 2操作要点 倒入培养基的体积以试管1/4左右为宜，斜面的长度不超过试管的一半，一般用15 ×150mm 试管，其容量为5ml。 2.1定型棉塞 将制作松紧适宜的棉塞塞进试管，然后放进鼓风的干热灭菌箱中于160℃定型2小时。定型后切记不能立即打开干热灭苗箱，否则棉塞易燃烧。要让其冷至100℃以下才能打开，接近室温打开更理想。这样制作的棉塞，便于培养基分装及接种，还有利于减少污染。棉塞的制作方法见下图2. 图2-a 图2-b
2.2分装试管 将配制好的培养基按常规方法分装试管，在此过程中切勿将培养基沾到度管上部。若沾到上部，一是影响试管的外观，二是易污染棉塞。如下图3. 图3 2.3捆扎试管 管口堵入棉塞后7或9支试管扎一捆，棉塞部分用牛皮纸包扎。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。如下图4.
图4 2.4灭菌 将手提式高压锅内的水换成干净的自来水，水按要求加入，不能过多。将捆成把的试管立放装进高压锅的内桶中，在试管顶上放适量棉花使之成凸形，再在上面盖上一层牛皮纸，盖上盖进行高压灭菌，在灭苗放冷气的过程中，要尽量慢，以免减压过快，培养基沸腾，打湿棉塞。冷气放彻底后，待压力达到灭苗要求时，稳压一定时间（培养基种类不同，灭苗时间要求不一样）。当达到灭菌时间后、最好让压力自然下降至零时再打开高压锅。打开高压锅时，移去试管上面的牛皮纸和棉花，然后盖上锅盖，并使锅留一条缝隙，让锅内余热烘干棉塞。 2.5摆斜面 试管内的凝聚水主要是高温游离水在培养基凝固过程中遇外界温差过大形成的凝结水和摆放斜面时没有足够的热量烘干棉塞上的水分所致，要摆出高质量的斜面试管，必须在培养基凝固过程中避免温差过大，让其缓慢降温，使高温施离水被培养基所吸收，摆出的斜面才不会出现湿棉塞。具体做法为：首先让培养基在高压锅内把棉塞烘干，待试管冷却至50℃左右时取出摆斜面，然后覆盖保温物，让其自然冷却至室温。如下图5. 图5 2.6接种 经无菌检验，确认无菌后方可进行接种。接种方法见下图6.
细菌真菌放线菌培养基配方
。 一．细菌培养基：肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 肉膏蛋白胨培养基 1. ～7.6 2. 、 6管，10% 3. （1 速。 （2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 （3）调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/LHCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 （4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 （5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以 （6 （7 （8 （9 （10）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 二.放线菌培养基:高氏合成一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基,培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HP04、MgSO4和FeS04作为无机盐等
高氏合成一号培养基 1.药品比例： 可溶性淀粉20g NaCI 0．5g KNO31g K2HPO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 水 pH 2. 3. 成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4．7H2O可先配成高浓度的贮备 液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。 （2）、调pH
食用菌菌种的制作与培养
食用菌菌种的制作与培养 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 一、母种制作 （一）母种培养基制作 1.母种培养基的种类 母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种： （1）马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基 马铃薯（去皮）200克琼脂20克葡萄糖（或蔗 糖）20克水1000毫升 （2）麦芽汁—葡萄糖—琼脂培养基 干麦芽250克琼脂15～20克葡萄糖（或蔗糖）10克水1000毫升 （3）胡萝卜—葡萄糖—琼脂培养基 胡萝卜100克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖）20克水1000毫升 （4）蘑菇汁—葡萄糖一琼脂培养基（适用于蘑菇） 鲜蘑菇250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖）20 克水1000毫升 （5）蛋白胨—葡萄糖—琼脂培养基 蛋白胨2克葡萄糖20克磷酸氢二钾2克维生素B1（硫胺素）0.5毫克磷酸二氢钾0.5克琼脂18克硫酸镁0.5克水l000毫升 2.母种培养基的制法 以最常用的马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基的制法为例介绍如下： 先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块加水1000毫升，煮沸15～20分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。试管口塞上大小合适的棉花塞，塞入试管口内的长度为棉塞总长的3/5。塞好棉塞后，每10
PDA培养基的配制方法
PDA培养基的配制方法 一、目的要求 1．学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2．学习并掌握棉塞的制作方法。 二、培养基的配制原理 培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训 和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不 同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围。 三、实训材料和用具 琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10﹪NaOH，10﹪HCl，1mol／L NaOH，lmol／L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H20，MgSO4·7H20，FeSO4·7H2O；试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布， 四、操作方法与步骤 (一) 培养基的配制 PDA培养基的配制其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。 (1)称量和熬煮药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小 块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁 热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。 (2)加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放 在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再 补充水分至所需量。 (3)分装按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用 三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超 过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。 (4) 加棉塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试 管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。 (5)包扎加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防 止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 (二) 棉塞的制作 棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是可过滤空气，保证通气良好，并可减缓培养基
培养基制作
四、培养基的制备 （一）背景知识介绍 细菌和其它生物体一样，在进行培养增殖的过程中，需要一个营养丰富、环境条件适宜的场所。培养基是由适合于细菌生长繁殖的营养物质配制而成的营养基质。制备培养基的目的在于给细菌创造良好的营养条件。由于细菌具有不同的类型，人们对细菌的研究目的也不同，应配制适合不同细菌生长以及按实验要求设计的不同培养基。但从营养角度分析，培养基一般均应含有满足细菌生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐类等。另外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定的缓冲能力。 1.培养基的类型 由于培养基名目繁多，种类各异。一般按培养基的成分、培养基的外观状态、培养基的功能把培养基分为不同的类型。 按培养基成分的了解可分为： （1）天然培养基：（基本培养基）是指利用动、植物或其提取物制成的培养基，例如，培养细菌的肉膏蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基等。此种培养基取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便。但是其中的成分不甚清楚，不利于做精确的科学实验。我们的实验常使用此类培养基。 （2）组合培养基：（合成培养基）是指用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。例如培养细菌的葡萄糖铵盐培养基；培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基。此培养基价格较贵，配制较烦琐，有利于做精确的科学实验。我们的实验一般都不用。 （3）半合成培养基：是在天然培养基中加入少量已知的化学物质配制而成的。如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。 按培养基外观的物理状态，可分为： （1）固体培养基：在液体培养基中加入1％～2％琼脂作凝固剂，就可以制成遇热可融化、冷却可凝固的固体培养基。琼脂又名洋菜，其熔点是96℃，凝点是40℃，所以在一般细菌培养温度下呈固体状态。固体培养基在微生物的科研和实验中，具有极其广泛的用途，如菌种的分离鉴定、菌落计数、菌种的保存等。前面的细菌实验研究中，我们主要用此培养基。 （2）液体培养基：是指未加凝固剂、呈液态的培养基。其组成成分均匀，细菌能充分接触和利用养料，适宜作生理研究用。 （3）半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％～0.5％的琼脂制成的培养基，可用于观察细菌的运动。
母种培养基的配制
母种培养基的配制 1.器具 试管刀天平铝锅棉塞纱布漏斗烧杯量筒 2.常用的母种培养基配方 ①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200g，葡萄 糖20g。琼脂20g，水1000ml，{如果需要配制250ml的培养 基，那么马铃薯、葡萄糖、琼脂的比例是50:5:5}，也可用蔗糖 取代葡萄糖，即为PSA培养基。还可以添加磷酸二氢钾3g，硫 酸镁1.5g，维生素B1 10㎎，即为马铃薯综合培养基。广泛适 用于各种食用菌母种的分离，培养和保藏。 ②马铃薯玉米粉培养基：马铃薯（去皮）200g，蔗糖20g，玉米 粉50g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，水1000ml。 本配方适合于香菇、黑木耳、猴头菌的培养。 ③马铃薯黄豆粉培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，黄 豆粉20g，碳酸钙10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，水1000ml。 适用于蘑菇、草菇。 ④葡萄糖蛋白胨琼脂培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，琼脂20g， 水1000ml。 ⑤蛋白胨、酵母、葡萄糖琼脂培养基：蛋白胨2g，酵母膏2g， 硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1g，葡萄糖20g，维生素B1 20㎎，琼脂20g，水1000ml。
具体步骤 1.计算。按照选定的培养基配方，计算各种成分的用量。 2.称量。用天平秤取各种物质，马铃薯去皮去芽眼，削掉青绿部分， 对不易称量的成分，可用玻棒和烧杯称重，微量元素等需要量少，难以称准时，可先配成较浓的原液，再从中取出需要的量。 3.配制。若配制合成培养基，先量取蒸馏水，加入琼脂，加热溶化； 再加入称好的其他物质。为避免发生沉淀造成营养损失，加入的顺序一般是先加缓冲剂，再依次加入主要元素、微量元素和维生素等； 若各种成分均不发生沉淀，也可一起加入。 4.煮汁，去滤液。马铃薯切成1㎝见方的小块或2~3㎜厚的薄片，加 水约1200ml煮沸，再用文火保持20~30分钟、并适当搅拌，使营养物质充分溶解出来，然后用4层预湿的纱布过滤，取其滤液。5.补足水量，加药品溶化。补足水量至1000ml，然后往滤液中加入琼 脂，小火加热，搅拌至琼脂完全溶解，再加入葡萄糖和其他营养物质使其溶化后，用PH试纸检测其PH值，可根据需要使用氢氧化钠和盐酸，调整适宜的酸碱度，进行分装。注意开锅搅拌，防止溢出或焦底。 6.分装试管。制备好的培养基应趁热分装，可用玻璃试管，首先把较 大的玻璃漏斗固定在滴定架上，下接一段乳胶管和玻璃管，用弹簧夹夹住胶管。手拿试管，分装量掌握在试管长度的四分之一。注意分装时，培养基不能粘在试管口壁上，否则会污染棉塞。 7.赛棉塞。注意要松紧适度8.高压锅灭菌30分钟
各种培养基的制作方法
配方一萨氏(Sabouraud's)培养基 蛋白胨10克琼脂20克麦芽糖40克水1000毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40克麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使它溶解,然后分装,灭菌,备用。 1、营养肉汤培养基 牛肉膏 0.3克 蛋白胨 1.0克 NaCl 0.5克 水 100毫升 pH 7、0～7、2 在烧杯中加水,称取牛肉膏、蛋白胨与NaCl,加热溶化后,调节pH值至7、0～7、2。分装,加棉塞,高压蒸汽灭菌即成。常用于培养细菌。 2、营养琼脂培养基 在营养肉汤培养基中增加20克琼脂即成。常用于培养细菌。 3、肉汁蛋白胨液体培养基 牛肉 500克 蛋白胨 10克 NaCl 5克 pH 7、1～7、2 取新鲜牛肉500克,去净脂肪、筋腱后,绞碎或剁碎,加水1000毫升浸泡,15℃下放置12小时或50℃下放置半小时。用纱布将肉汁过滤,补足失水。向肉汁中加入蛋白胨与食盐。将肉汁加热,放入苏打(碳酸钠)至红色,调整pH值。分装,高压蒸汽灭菌。 将上述已灭菌得培养基用棉花滤去凝集得蛋白质,制成液体培养基,如需制成固体培养基,可在每100毫升液体中加入2克琼脂,加热溶化后,分装,再次进行高压蒸汽灭菌。常用于培养细菌。 4、高氏一号培养基(淀粉琼脂培养基) 可溶性淀粉 2克 K2HPO4 0.05克 MgSO4·7H2O 0.05克 KNO3 0.1克 NaCl 0.05克
FeSO4 0.001克 琼脂 2克 水 100毫升 pH 7、2～7、4 在烧杯中加水95毫升,加热至沸腾,取可溶性溶粉2克,用5毫升水调成糊状,倒入沸水中与匀。再称取其它药品,陆续加入烧杯内(待一种药品溶解后,再加入第二种药品)。待全部药品溶解后,停止加热,补足失水,调pH值至7、2～7、4。分装后,高压蒸汽灭菌。本培养基常用于培养放线菌。 5、马铃薯蔗糖培养基 马铃薯 200克 蔗糖 10克 琼脂 20克 水 1000毫升 自然pH 称取200克马铃薯片,加水1000毫升,煮沸半小时,用纱布过滤,补足失水。在上述滤汁中加入10克蔗糖、20克琼脂,加热使琼脂熔化。分装后,高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 6、麦芽汁培养基 将从啤酒厂买来加有啤酒花得麦芽汁,装入锥形瓶中,加塞高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 7、察氏培养基 NaNO3 2克 K2HPO4 1克 KCl 0.5克 MgSO4 0.5克 FeSO4 0.01克 蔗糖 30克 琼脂 15～20克 水 1000毫升 自然pH 分装,加棉塞,高压蒸汽灭菌。常用于培养霉菌。
母种培养基制作
实验二武陵山野生食用菌母种的制作与培养 一.目的 1.了解食用菌菌种的来源，菌种的分离方法。 2.掌握PDA培养基的配制、分装、灭菌的方法和食用菌菌种的培养方法。 3.熟悉和掌握无菌操作的原理和操作方法。 二.原理 首先是制作菌种，即通过孢子或组织分离出菌丝体，菌丝体扩大繁殖成为生产菌种；其次是将菌种接种于基质中，生产出食用菌的子实体。食用菌菌种是食用菌菌种生产和科研工作的基本材料。食用菌生产的菌种来源于野生食用菌资源，我国丰富的食用菌资源为我国食用菌产业的发展奠定了坚实的基础。食用菌菌种的最初来源是来自于野生食用菌资源，采用孢子或组织分离法分离得到食用菌菌种，然后把该菌种进行人工驯化、菌种选育，得到具有生产价值的食用菌菌种。母种是食用菌生产的经菌丝体，菌丝体扩大繁殖成为生产菌种；而该过程必须在无菌环境中以无菌操作进行，以防杂菌污染。一般在接种箱，无菌室或超净工作台上进行接种。 接种前要对环境进行消毒，一般是用37%~40%甲醛溶液于接种前按5ml/m3 的量熏蒸半小时。也可用紫外灯照射半小时，以杀死空气中的微生物。 适合食用菌生长繁殖的混合培养料称培养基，由于不同的食用菌生长繁殖需要相应的营养条件及适宜的酸碱度。因此，在配制培养基
时，还要根据所使用的配方，按次序配制培养基，并调节pH等。在液体培养基中加入琼脂等凝固剂后，就可制成试管斜面或在培养皿内倒成平板，成为用途广泛的食用菌母种培养基。 三.实验材料 1.野生食用菌标本。 2.量筒、试管、玻棒、铝锅、电炉、天平、高压灭菌锅、超净工作台、接种钩、酒精灯、火柴、蒸发皿、甲醛、高锰酸钾、70%酒精、无菌平皿 3.培养基配方 （1）PDA培养基马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18~25g 和水1000ml （2）完全培养基蛋白胨2.0g、酵母膏2.0g、葡萄糖20g 、MgSO4H2O 0.5g、K2HPO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、琼脂20g、水1000ml 四.方法与步骤 （一）培养基的配制 1.把马铃薯洗干净，去皮，挖掉芽眼，切成大约1cm3 的小方块， 在天平上称取200g。 2.把切好的马铃薯小块倒入铝锅中，加水1000ml，煮沸15~30min。 3.用纱布（2~3层）过滤。 4.滤液加水至1000ml，加入蔗糖及琼脂。 5.加热使琼脂完全熔化。 6.趁热加入分装筒。分装于试管中（装量为1/5），塞棉花塞。