政院国家科学委员会专题研究计画成果报告
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
合成新的黃酮類衍生物在免疫及癌症預防藥物的研究Synthesis, Investigation on Immunity and Cancer Prevention of New Flavonoid
Derivatives
計畫編號：NSC 95-2113-M-415-004
執行期限：95年8月1日至96年7月31日
計畫主持人：吳進益國立嘉義大學生物藥學研究所
計畫共同主持人：陳俊憲國立嘉義大學生物藥學研究所計畫參與人員：蔡睿勳、柯昭宇國立嘉義大學生物藥學研究所
一、中英文摘要：
黃酮素類，廣泛存在於許多植物中，具有相當高的生物活性之一，包括抗氧化性、抗過敏性、抗發炎、及抗癌等。在天然物中，黃酮類存在於蔬菜、水果及其他植物中相當多。傳統中草藥黃芩(Scutellaria baicalensis Gerorgi)主要有效成分黃酮素類部份包括baicalein、baicalin、oroxylin A、wogonin和chrysin等，具有許多生物及藥理活性，例如：抗氧化、抗發炎、抑制腫瘤細胞生長及抗癌等活性。本計劃研究是針對黃芩主要有效成分baicalein、wogonin和chrysin與萜類反應合成一系列新型衍生物，分別在wogonin及chyrsin在A環上C7-OH位置，而baicalein則在A環C6-OH位置以半萜、單萜和倍半萜進行取代反應。這些化合物以細胞外的抗氧化試驗包括清除DPPH自由基能力與ABTS?+清除能力，結果顯示baicalein衍生物在細胞外抗氧化活性具有較佳的自由基清除能力。另外從流式細胞儀(flow cytometry)技術分析baicalein衍生物在人類單核球細胞株(THP-1)進行細胞內抗氧化活性試驗，結果發現baicalein系列的衍生物較有顯著抑制外加cumene hydroperoxide與H2O2在細胞內ROS (reactive oxygen species)的含量，而在抑制外加menadione (Vit K3)所引起細胞內的超氧陰離子試驗則無明
顯的效果。同時，baicalein系列的衍生物對於由cumene hydroperoxide所引起細胞內誘導的麩胱甘肽(glutathione, GSH)消耗均具有抑制作用。最後，以西方墨點法(Western blotting)分析與細胞內產生ROS (reactive oxygen species)有關的抗氧化蛋白質Bcl-2及與細胞凋亡(apoptosis)有關的蛋白質Bax的表現，其實驗結果顯示baicalein系列衍生物皆能抑制cumene hydroperoxide所誘導Bax蛋白質的表現。綜合以上在細胞外和細胞內抗氧化能力結果顯示，baicalein及其衍生物對於細胞外清除DPPH自由基與ABTS?+清除能力，具有較明顯的活性效果，其對於細胞由cumene hydroperoxide、H2O2、menadione(Vit K3)在細胞內的含量有抑制作用，可以作為未來保健食品及抗癌藥物的開發。
關鍵字：黃酮素類、抗氧化活性、活性氧物質、人類單核球細胞、免疫調節、抗癌藥物
Baicalein, one of the major flavones, was found to be responsible for antioxidant activity of the traditional Chinese medicinal herb, Huang-Qin (Scutellaria baicalensis Georgi), which is widely used as an antioxidant, anti-inflammatory, and antitumor agents. The hydroxyl groups of the A ring of the baicalein was alkylated at position 6 with terpenoids such as prenyl, geranyl and farnesyl groups, and their free radical scavenging activity and glutathione depletion capacity were examined. The free radical scavenging activity was measured by the ABTS?+ and DPPH scavenging method. We found that baicalein and newly synthesized baicalein derivatives were better good free radical scavengers than that of the derivatives of wogonin and chyrsin in vitro. Flow cytometrical method was employed to measure the intracellular antioxidative activity and glutathione (GSH) depletion capacity of these derivatives in human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). We found that baicalein and its derivatives could decrease the level of exogenous cumene hydroperoxide and H2O2 in
the THP-1 cells. These compounds also could significantly inhibit the intracellular glutathione (GSH) depletion induced by cumene hydroperoxide in THP-1 cells. The production of cumene hydroperoxide-induced Bax, a pro-apoptotic related protein, could also be inhibited by baicalein and its derivatives. These results suggested that baicalein and its derivatives could be used as a health food supplement.
Keywords: Flavonoids, Antioxidant Activity, Reactive Oxygen Species, Immunomodulation, Anticancer drugs
二、計畫緣由及目的：
多酚類(polyphenols)化合物廣泛分布在植物及中草藥成分中，其中黃酮素類(flavonoids)是多酚類常見的具有生物活性成分之一，文獻研究在體內試驗及體外
試驗均有相當多報導，包括抗過敏、抗發炎、抗癌等生物活性。在二十一世紀的
現在，儘管科技及科學日新月異及醫藥技術有相當進步，但對許多重大疾病像癌
症及腦血管異常相關疾病如中風、高血壓、心臟病等造成健康危害或死亡。在西
方醫藥學中仍缺乏有效的治療或預防方式，但反觀我們具有數千年悠久歷史的中
國傳統醫藥學，目前有許多研究有相當多，能夠提出相關科學化的證據以確定真
正的醫療機制。所以自傳統中草藥中篩選並具有療效潛力的有效成分及研究其作
用機制，幫助中草藥能進入國際市場及具有挑戰性及前瞻性的研究領域。本計畫
是整合中草藥成分萃取、鑑定、藥效分析及其衍生物合成，以幫助我們對化合物
在結構與活性關係(structure-activity relationships)的探討，結合免疫及癌細胞培養
方式研究對抗發炎反應及抗癌活性的探討以幫助我們尋找更有效地藥物分子。
在先前研究顯示，黃酮類中在B ring上有氫氧基在抗氧化能力較有提升，在
A ring上有氫氧基對抗氧化能力比較沒有顯著差異。我們從黃芩根部用丙酮進行
萃取可得到baicalein、wogonin及chrysin等化合物，對免疫細胞利用LPS誘導
造成NO產生均有抑制效果，同時對正常肝細胞在100 μM濃度下仍有80％存活
率，但在相同條件下肝癌細胞存活只剩下43％，顯示這類黃酮類素有抑制癌症生長的效果。本計畫主要先利用合成一系列baicalein、wogonin及chrysin等衍生物，在清除自由基DPPH及ABTS?+方法測定這些衍生物對抗氧化活性在結構及-OH官能基數量多寡的差異性。特別針對wogonin衍生物使用流式細胞儀測定方法對免疫細胞增生活性對結構與活性關係的探討，能夠針對抗發炎活性在lipopolysaccharide誘導NO與prostaglandin E2產生的抑制效果進行研究。值得我們對這一類化合物進行衍生物的開發及對抗發炎及抗癌的機制進一步的研究Baicalein、wogonin及chrysin是黃酮素類的一種，廣泛存在於許多植物中，具有相當高的生物活性，包括抗氧化性、抗過敏性、抗發炎、抗癌及防癌等，但對有些生物活性尚未完全瞭解。在天然物中，黃酮類存在於蔬菜、水果及其他植物中相當多。在許多文獻報導黃酮類化合物具有生物活性如：抗氧化作用及清除自由基的能力，自由基的種類相當多，包括：一氧化氮、氫氧基、過氧化氫、超氧自由基等，而其中一氧化氮(NO)在發炎反應的過程中扮演相當重要角色。NO 生成主要是經由活化一氧化氮合成酵素(NOS)而將細胞內之L-arginine轉變成為L-citrulin及NO自由基的釋放。細胞內 NOS主要分為兩大類；一為結構性NOS (constitutive NOS; cNOS)，另一種為誘導型NOS (inducible NOS; iNOS)。 cNOS 產生固定量之NO為維持體內正常運作之重要訊息傳遞因子，NO會藉由促使GDP轉變為cGMP進而誘發一連串之生理反應，包括血管擴張、子宮平滑肌鬆弛及抑制血小板凝集等作用。相反的，iNOS所誘導出之大量NO自由基則會造成細胞的傷害與血管過度的舒張最後造成嚴重的發炎反應及併發症，如敗血性休克、中風、DNA受損、突變所造成細胞的癌化等疾病。因此, 從天然物多酚類中篩選出具有抑制iNOS所產生的NO，而本身對cNOS所產生的NO沒有影響之黃酮類衍合物是我們研究方向之一。例如在感染的過程中, 葛蘭氏陰性與陽性菌細胞壁成份中之lipopolysaccharde (LPS)與lipoteic acid (LTA)。均會誘導大量NO、PGE2與細胞激素的產生而進而引起發炎反應，嚴重時甚至會引發敗血性休克而造成病人的死亡。中藥黃芩中的主要成份有發現某些天然黃酮類化合物如：
baicalein 、wogonin 和chrysin 等對RAW264.7巨噬細胞能有抑制LPS 誘導的誘導型NOS 之產生。其結構如圖一：
O O OH HO O wogonin O O OH HO chrysin O
O
OH HO baicalein HO
圖一：Baicalein 、wogonin 及chrysin 之化學結構。
最近這幾年，有相當多文獻的報導指出，萜類(terpeniod)具有癌症化學預防及抗癌等活性，主要是因抑制3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA)活性，而HMG-CoA 還原酶是催化mevalonate 的形成，mevalonate 則是細胞增生所需要的膽固醇的前趨物，因此，阻止mevalonate 的產生，進而抑制癌細胞的生長以達到癌症的預防。而farnesol 和geraniol 等萜類化合物均有文獻報導化學治療的活性，包括胰臟癌、乳癌、肝癌等化學治療的研究。因此，利用有機合成方法結合baicalein 、wogonin 及chrysin 等化合物與farnesol 、geraniol 及isoprenol 等官能基，以增加二者的活性之可能性，這些合成之衍生物增加細胞膜的穿透性而更容易進入細胞膜以提升藥物的活性，達到降抵藥物使用劑量、減少抗藥性的產生及使藥物療效的提升。我們希望結合二種化合物的優點並減少之間的副作用，研發新的藥物分子及有效治療癌症等相關議題之研究，本計畫希望得到的結果以提供結合二種不同天然化合物對藥物開發及提升療效的研究能幫助癌症等重大疾病的治療。
多酚類像(+)-catechin 、rutin 、gallic acid 等有抑制linoleic acid 過氧化作用及有效清除自由基DPPH 的能力。國內外學者文獻報導指出新的黃酮素類的合成物具有更有抗氧化活性及抗癌活性的研究，提供利用有機合成方式合成新的黃酮素類以尋找更有效藥物開發，透過天然物具有活性的化合物進行結構的改變，縮短
新藥開發時間及節省成本的費用，加上從天然物萃取出來對人體毒性相對於新藥有較少現象，因此，天然藥物進行官能基改變可以增加在新藥開發機會，同時減少生理活性及臨床試驗的時間。近十年來癌症在國人十大死因排行榜中的第一名，許多科學家們在癌症的研究上也投注相當多的時間與心力，但目前為止仍然有許多問題如抗藥性或癌轉移等問題無法克服，因此，研究方向主要以篩選或開發能專一性誘導癌細胞進行細胞凋亡(apoptosis)作用，而對正常細胞產生的毒性卻不高的藥物；另一種研究方式主要是研究如何利用天然藥物來預防或降低癌症的發生。因此，抗癌藥物及有癌症預防藥物是目前二大重要的治療癌症的研究方向。癌細胞開始轉移鄰近正常組織，進而危害其他組織或器官。因此能夠在阻斷癌細胞生長及預防癌症的發生，都是我們尋找天然抗癌藥物的重要目標。
三、研究方法實驗：
1. 黃芩根部萃取與分離：
取黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)根部乾燥切碎用丙酮以10倍體積在室溫靜置，萃取2星期，一部分萃取物濃縮後以silica gel管柱層析用CHCl3和CHCl3-MeOH進行沖提分離，產物再以silica gel管柱層析用hexane-acetone進行沖提分離得到wogonin。一部分從CHCl3-MeOH沖提分離得到產物再以Sephadex LH-20用MeOH沖提可以得到baicalein。天然化合物須經由1H-, 13C-NMR與EI-MS光譜鑑定，純度以高效能層析儀(HPLC)鑑定。(22, 23)
2. Baicalein, wogonin和chrysin衍生物合成方法：
取baicalein, wogonin和chrysin (2 mmol)加入alkyl bromide或iodide (2 mmol)與無水K2CO3 (2 mmol) 在無水丙酮加熱迴流4 ~ 24小時，冷卻、過濾、濃縮以乙醇再結晶或以silica gel管柱層析用hexane-EtOAc進行沖提分離得到baicalein, wogonin和chrysin衍生物。有文獻報導，在這一類黃酮類化合物中7-OH的反應性比5-OH來得高，當溴或碘烷基化合物在一當量下烷基只會接在7-OH上，因
為5-OH 會與分子中carbonyl 基形成分子內的氫鍵而降低其反應性，但是baicalein 反應結果由NMR 光譜分析發現在6-OH 位置上為主要產物與wogonin 及chrysin 結果不同。(24, 25) 其反應結果如圖二所示：
O O OH HO
O O O OH RO O
K 2CO 3 / Acetone,
reflux, 8 ~ 24 hr
RBr or RI wogonin
O
O OH HO O
O OH RO K 2CO 3 / Acetone,
RBr or RI chrysin O
O
OH HO O O OH HO K 2CO 3 / Acetone, RBr or RI R = Me, Et, prenyl, geranyl, farnesyl
baicalein
HO
RO baicalein derivatives wogonin derivatives chrysin derivatives
圖二：O -Alkylation of baicalein, wogonin 和chrysin 的反應式。
3. 細胞外抗氧化活性試驗：
(1) 清除DPPH 自由基能力測定：
取100 μL 不同濃度的樣品加入100 μL 新鮮配製的100 μM DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)乙醇溶液，震盪混合均勻於室溫下靜置30 min 後，使用分光光度計檢測517 nm 之吸收值。清除率(scavenging effect %) = [1-(樣品於517 nm 之吸光值)/(未添加樣品之控制組於517 nm 之吸光值)] ×100。
(2) Trolox 當量的抗氧化能力測定(TEAC Assay)：
利用ABTS (2,2’-azino-bis-(3-ethylbenthiazoline sulfonic acid)與K 2S 2O 8反應
而產生ABTS?+，是相當穩定的藍綠色物質，用分光光度計偵測波長734 nm的吸收值，抗氧化物質會抑制此顏色的產生，當吸收值越低其抗氧化效果越佳。方法是取7 mM ABTS溶液與2.45 mM K2S2O8均勻混合，在暗處下放置12~16小時後產生安定藍綠色物質之ABTS?+陽離子自由基，利用稀釋至在734 nm吸收值為0.70±0.05，加入不同濃度的trolox樣品，以分光光度計量測734 nm的吸收值，以作成trolox之標準曲線，樣品以相同方法量測其734 nm的吸收值，換算其相當的濃度。
4. 細胞內抗氧化活性試驗：
(1) 人類單核球細胞(THP-1)內過氧化自由基含量試驗：
將7×105 cells/ml THP-1細胞量培養於10 cm dish，在 37℃下以 5% CO2細胞培養箱中培養過夜，並以含Ca2+的緩衝液洗滌，加入20 μM DCFH-DA置於37℃下以5%CO2細胞培養箱中培養十分鐘後，處理不同濃度之baicalein及衍生物並於37℃下以5%CO2細胞培養箱中培養十分鐘，隨後加入20 μM cumene hydroperoxide處理二十分鐘，再以含Ca2+的緩衝液洗滌一次，收集細胞後加入4 μg/ml propidium iodide (PI)，以flow cytometry分析細胞內peroxide自由基含量。
(2) 人類單核球細胞(THP-1)內過氧化氫自由基含量試驗：
將7×105 cells/ml THP-1細胞培養於10 cm dish，在37℃下以5% CO2細胞培養箱中培養過夜，並以含Ca2+的緩衝液洗滌，加入20 μM DCFH-DA置於37℃ 5% CO2細胞培養箱中培養十分鐘後，加入不同濃度之baicalein及衍生物並置於37℃下以5% CO2細胞培養箱中培養十分鐘，隨後加入1600 μM H2O2處理三十分鐘，再以含Ca2+的緩衝液洗滌一次，收集細胞後加入4 μg/ml propidium iodide (PI)，以flow cytometry分析細胞內H2O2自由基的產生量。
(3) 人類單核球細胞(THP-1)內超氧自由基含量試驗：
將7×105 cells/ml THP-1 細胞培養於10 cm dish，在37℃下以5% CO2細胞培養箱中培養過夜，並以含Ca2+的緩衝液洗滌，加入15 μM HE 置於37℃5% CO2細胞培養箱中培養十五分鐘，處理不同濃度之baicalein及衍生物並置於37℃下以5%CO2細胞培養箱中培養保護十分鐘，隨後加入30 μM menadione (2-Methyl- 1,4-naphthoguinone; Vitamin K3) 處理適當時間，再以含Ca2+的緩衝液洗滌一次，收集細胞後，以flow cytometry分析細胞內superoxide自由基的產生量。
(4) 細胞內麩胱甘肽(Glutathione, GSH)含量的試驗：
將7×105 cells/ml THP-1細胞培養於10 cm dish，在37℃下以5%CO2細胞培養箱中培養過夜，並以含Ca2+的緩衝液洗滌，處理適當濃度之baicalein及衍生物並置於37 ℃下以5%CO2細胞培養箱中培養一小時，隨後加入cumene hydroperoxide處理三小時，再以25 μM CMF-DA反應二十分鐘，再以Ca2+的緩衝液洗滌一次，收集細胞後加入4 μg/ml propidium iodide (PI)，以flow cytometry 分析細胞內GSH的含量。
(5) 西方墨點法(Western blotting)：
將1.5×106 cells/ml THP-1細胞培養於10 cm dish，在37℃下以5% CO2細胞培養箱中培養過夜，並分盤培養在RPMI medium中。加入不同濃度之baicalein 及其衍生物，在37℃下以5%CO2細胞培養箱中培養一小時，隨後加入cumene hydroperoxide處理三小時，分別收集細胞到15 ml離心管，在室溫下以1500 rpm 離心五分鐘去除上清液，敲散細胞並用3 ml 1X PBS清洗細胞，再以1500 rpm 離心五分鐘去除上清液，之後加入1 ml 1X PBS將細胞轉移到1.5 ml的微量離心管中，在室溫下以2500 g離心五分鐘，盡量將上清液清除，避免PBS影響定量蛋白質濃度的干擾，之後加入適當體積Lysis buffer (Complete Lysis-M, Roche)，並且在不產生氣泡原則下用微量吸管(micropipette)充分地混合細胞沉澱物，且在
4 ℃以 12000 g離心15分鐘，之後用微量滴管抽取上清液到新的1.
5 ml微量離心管，即可以收集到細胞內的蛋白質，並儲存在–80℃冷凍冰箱中備用。在96-well plate中，每個well依序加入1 μl的待測蛋白質溶液及4 μl 二次水和200 μl Bio-Rad染劑混合均勻，同時使用BSA (bovine serum albumin)作一標準曲線，在室溫下避光靜置10分鐘，再以 ELISA reader讀取波長 595 nm的吸光值。分析使用BSA所做出來的吸光值來作標準迴歸直線，求出此直線的方程式(迴歸直線的R2>0.95)，將樣本蛋白質的吸光值代入此方程式，求出相對應的蛋白質濃度。
(6) 免疫墨點法(Immunoblotting)：
在九十分鐘轉印完成後，將PVDF membrane取出，用美工刀剪裁所需的部份，並放置於Blocking buffer中，在室溫下緩慢搖晃一小時，以PBST (1X PBS, 0.05% Tween-20)洗滌PVDF membrane三次，每次10分鐘，目的在去除一些非特異性蛋白質的結合。之後將欲測蛋白質(Bcl-2、Bax)的一次抗體用PBS稀釋到適當的濃度，在4℃下緩慢搖晃overnight，隔天再用PBST洗滌PVDF membrane 五次，後三次各洗10分鐘，之後依照一次抗體的種類，加入特異作用的二次抗體(HRP conjugated anti-mouse IgG 或HRP conjugated anti-rabbit IgG)，在室溫下用震盪器緩慢搖晃一小時，之後以PBST洗滌PVDF membrane三次，每次各洗十分鐘，目的在於減少非特異性蛋白質結合。再將已沾染上蛋白質的 PVDF membrane先以正面沾 ECL (enhanced-chemiluminescence)溶液，大約沾染一分鐘，之後用擦手紙將PVDF membrane上多餘的ECL溶液吸乾，再以平整且沒有氣泡的狀態下，將 PVDF membrane平放在投影片上，放入冷光儀中偵測蛋白質及照相。
5. 統計分析
實驗所得到數據皆以平均值 ± 標準差(mean ± SD)表示，並使用Student’s
t-test來分析對照組與實驗組之間的差異。# p＜0.05表示在統計學上具有顯著差異，## p＜0.01則表示在統計學上具有極顯著差異。
四、結果與討論：
一、Wogonin、chrysin、baicalein衍生物之合成：
在wogonin、chrysin、baicalein這三系列衍生物的合成方法是相似的，尤其是wogonin、chrysin系列衍生物利用烷基反應進行合成，預期都在A環C7-OH 位置上作修飾，分別以半萜(prenyl)、單貼(geranyl) 和倍半萜(farnesyl)作為取代，經由物理性質及NMR分析結果確定是接在A環C7-OH位置上，而不是A環C5-OH位置，這結果也與文獻相符合，即在A環上C5-OH會與C環上C4 C=O (酮基)之間形成分子內氫鍵 (hydrogen bond)的產生穩定結構不易被進行代反應另外， baicalein 系列衍生物則是在 A 環 C6-OH 位置上以半萜 (prenyl)、單貼(geranyl)和倍半萜 (farnesyl) 作為取代，也經由核磁共振儀(1H及13C NMR)確定結構，且也有文獻研究在baicalein上作修飾，也是在A環C6-OH位置上作取代。
二、Wogonin、chrysin、baicalein及其衍生物在細胞外抗氧化能力之結果探討：
1. 清除DPPH自由基能力分析：
在wogonin、chrysin的A環C7-OH位置上分別以半萜 (prenyl)、單萜(geranyl)和倍半萜(farnesyl)作為取代，baicalein的A環C6-OH位置上分別以半萜、單萜和倍半萜作為取代，依各化合物不同濃度清除 DPPH 自由基能力的變化得到結果。首先由結果顯示出wogonin、chrysin及其衍生物的結果，可以發現wogonin、chrysin及其衍生物的IC50值皆大於200 μM，在200 μM濃度下清除率約只有0~10% 無法達到百分之五十的清除能力(IC50)，證明wogonin、chrysin及其衍生物均沒有明顯清除DPPH自由基的效果。另外，由baicalein 系列顯示baicalein
(IC50 = 15.3 μM) 及其衍生物Bai-C5 (IC50 = 18.4 μM)、Bai-C10 (IC50 = 19.7 μM)、Bai-C15 (IC50 = 18.1 μM)，雖然合成出來 baicalein衍生物清除DPPH自由基效果沒有比baicalein更好，但其百分之五十的清除能力 (IC50) 比維生素C (Ascorbic acid, IC50 = 27.3 μM)更具清除的能力，所以也証實了具有明顯清除DPPH自由基的效果。
2. 清除ABTS?+自由基能力分析：
由結果顯示wogonin (IC50 = 8.0 μM)、W-C5 (IC50 = 7.7 μM)、chrysin (IC50 = 4.0 μM)、C-C5 (IC50 = 10.3 μM)。但在A環C7位置上以單萜(geranyl) 和倍半萜(farnesyl)作為取代的衍生物(W-C10、W-C15、C-C10、C-C15) 的IC50值皆大於200 μM，表示沒有明顯清除ABTS?+自由基的效果。另外，由baicalein系列顯示baicalein (IC50 = 4.7 μM)及其衍生物B-C5 (IC50 = 9.0 μM)、B-C10 (IC50 = 9.3 μM)、B-C15 (IC50 = 10.9 μM)，雖然合成出來衍生物清除ABTS?+自由基效果沒有比baicalein更好，但其百分之五十的清除能力(IC50)比對照組的trolox (IC50 = 12.6 μM)和維生素C (ascorbic acid, IC50 = 18.3 μM) 更有清除的能力，因此仍具有明顯清除ABTS?+自由基的效果。由此推斷，baicalein在A環C6位置以半萜(prenyl)、單萜(geranyl)和倍半萜 (farnesyl) 作為取代的衍生物，比起wogonin 和chrysin一樣在A 環C7位置上作取代，仍具有高的清除ABTS?+自由基效果，其中的原因可能是baicalein 比 wogonin和 chrysin 多一個羥基(-OH)可以形成quinone形式，提供氫質子與電子來還原自由基。
中草藥黃芩有效成分在細胞外的抗氧化能力，包括清除DPPH自由基與清除ABTS?+試驗中baicalein比起wogonin及chrysin有較強的清除效果。baicalein原本A 環即有三個羥基，而其衍生物則是在A環C6位置上以半萜、單萜、倍半萜作修飾，這樣還是擁有兩個羥基存在，比起wogonin及chrysin的衍生物在A 環C7位置上作修飾，這樣的衍生物只剩下一個羥基存在A環C5位置，相對的抗氧化能力較弱。
三、Baicalein 及其衍生物對於抑制細胞內自由基含量之結果探討：
由於細胞外清除DPPH自由基的結果顯示，baicalein系列衍生物的抗氧化能力比wogonin和chrysin系列衍生物更強，加上過去已有文獻研究指出baicalein 可以降低心肌細胞因外加ROS產生的氧化壓力，於是選擇baicalein系列衍生物作為人類單核球細胞 (Human acute monocytic leukemia cell line, THP-1)外加cumene hydroperoxide、H2O2、menadione誘導產生人類單核球細胞內氧化壓力的化合物之試驗，而這些產生的活性氧物質(ROS)包括：peroxide (ROO?)、hydrogen peroxide (H2O2)、superoxide anion (O2?－)。
Figure 1. Effect of baicalein and its derivatives on intracellular cumene hydroperoxide in THP-1 cells. THP-1 cells (106 cells/ml) were incubated with 20 μM of DCFH-DA in the 5% CO2 incubator for 10 minutes, then treated with 5, 10, and 20 μM of baicalein and baicalein derivatives for 10 minutes at 370C in 5% CO2 incubator, and then treated with 20 μM cumene hydroperoxide for another 20 minutes. Data represent the fluorescence intensity within the THP-1 cells. Values shown are mean ±
standard deviation (n = 3-8 of individual experiments). # Statistically significant, p < 0.05 to untreated group.
在人類單核球細胞 (THP-1) 處理DCFH-DA (20 μM)後，分別加入最後濃
度為5, 10, 20 μM的baicalein及其衍生物，並處理十分鐘，隨後加入20 μM cumene hydroperoxide 處理二十分鐘，以flow cytometry分析。由圖一顯示cumene hydroperoxide 所引起過氧化物 DCF螢光值為215.9 ± 12.2與空白組(untreated)的DCF螢光值95.1± 4.7相比較，得知20 μM cumene hydroperoxide即
可造成THP-1細胞內過氧化物(ROO?)的增加。分別加入baicalein及其衍生物三
種濃度(5, 10, 20 μM)，baicalein由低濃度到高濃度DCF螢光值為150.6 ±12.5
到130.6 ± 17.3，Bai-C5由低濃度到高濃度DCF螢光值為82.7±11.2到60.28 ± 18.7，Bai-C10由低濃度到高濃度DCF螢光值為127.9±7.7到113.9±7.1，可以發
現隨著濃度的增加baicalein及其衍生物抑制THP-1細胞內過氧化物生成的能力
越強。另外，Bai-C15的DCF 螢光值為158.3 ± 6.3，雖然抑制效果不及Bai-C5，
但也具有抑制細胞內過氧化物(peroxide)的能力，這可能是Bai-C5屬於疏水性(hydrophobic)，需要長時間去保護才會有清除過氧化物(peroxide)的能力呈現。
在人類單核球細胞(THP-1)處理DCFH-DA (20 μM)後，分別加入最後濃度為5, 10, 20 μM的baicalein及其衍生物，並處理十分鐘，隨後加入H2O2處理三十
分鐘，以flow cytometry分析。實驗數據代表THP-1細胞內DCF螢光強度。由
圖二顯示THP-1細胞經由H2O2誘導產生的DCF螢光值為206.5 ±7.8與空白組(untreated)的DCF螢光值101.1 ± 3.9作比較，得知1600 μM H2O2即會造成THP-1
細胞內過氧化氫的增加。分別加入baicalein及其衍生物三種濃度(5、10、20 μM)，baicalein由低濃度到高濃度DCF螢光值為135.1 ± 8.9到114.3 ± 11.0，Bai-C5由
低濃度到高濃度DCF螢光值為118.6±9.3到91.8±8.1，Bai-C10由低濃度到高濃
度DCF螢光值為122.3 ± 6.9到107.5 ± 7.3，Bai-C15 由低濃度到高濃度 DCF 螢
光值為 176.8±13.7到144.2±18.7，可以發現隨著濃度的增加baicalein及其衍生
物對於抑制THP-1細胞內過氧化氫(H2O2)生成的能力越強。
Figure 2. Effect of baicalein and its derivatives on intracellular H2O2 in THP-1 cells. THP-1 cells (106 cells/ml) were incubated with 20 μM of DCFH-DA in the 5% CO2 incubator for 10 minutes, then treated with 5, 10, and 20 μM of baicalein and its derivatives for 10 minutes at 370C in 5% CO2 incubator, and then treated with 1600 μM H2O2 for another 30 minutes. Data represent the fluorescence intensity within the THP-1 cells. Values shown are mean ±standard deviation (n = 3-8 of individual experiments). # and ## Statistically significant, p < 0.05 and p < 0.01 to untreated group, respectively.
在人類單核球細胞(THP-1)處理HE (hydroethidine) (15 μM)後，分別加入最後濃度為5, 10, 20 μM的baicalein及其衍生物，處理十分鐘，隨後加入30 μM menadione 處理三十分鐘，以 flow cytometry分析。實驗數據代表THP-1細胞內HE螢光強度。由圖三結果顯示，利用menadione誘導THP-1細胞內之superoxide
增加，menadione 的HE螢光值為163.8 ± 10.5與空白組(untreated)的HE螢光值99.9±5.8作比較，結果得知由30 μM menadione可造成THP-1細胞內超氧陰離子的增加。分別加入baicalein及其衍生物三種不同濃度(5, 10, 20 μM)，可以發現對於抑制細胞內superoxide自由基的能力，僅有 baicalein在20 μM下對HE螢光值可減少到 126.0 ± 18.2以及B-C15在10 μM下DCF螢光值減少到 111.8 ± 3.9，其餘baicalein衍生物皆不顯著抑制細胞內產生superoxide自由基的能力。
Figure 3. Effect of baicalein and its derivatives on intracellular superoxide in THP-1 cells. THP-1 (106 cells/ml) cells were incubated with 15 μM of hydroethidine in the 5% CO2 incubator for 15 minutes, then treated with 5, 10, and 20 μM of baicalein and its derivatives for 15 minutes at 370C in 5% CO2 incubator, and then treated with 30 μM menadione for another 30 minutes. Data represent the fluorescence intensity within the THP-1 cells. Values shown are mean ± standard deviation (n = 3-8 of individual experiments). # and ## Statistically significant, p < 0.05 and p < 0.01 to untreated group, respectively.
在THP-1細胞加入最後濃度為10 μM的baicalein及其衍生物，並處理一小時，隨後加入500 μM cumene hydroperoxide處理三小時，之後再處理25 μM CMF-DA二十分鐘，以flow cytometry分析細胞內麩胱甘肽(GSH)消耗量。由圖四顯示cumene hydroperoxide會促使GSH耗損41%，而空白組(untreated) GSH 的耗損只有7.9%，得知500 μM cumene hydroperoxide 即會造成人類單核球細胞內麩胱甘肽(glutathione, GSH)的耗損。經由baicalein處理的THP-1其GSH-negative細胞減少24.4%，Bai-C5、Bai-C10、Bai-C15處理GSH-negative THP-1細胞其GSH-negative細胞分別減少到25.3%, 27.1%, 21.7%。証明baicalein 及其衍生物具有顯著降低 cumene hydroperoxide誘導細胞內GSH的消耗能力。細胞內具備有抵抗和清除這些過渡產生活性氧的抗氧化系統，此為人體在對抗活性氧的第一道防線，可以保護細胞免於ROS引起氧化壓力的傷害，其中麩胱甘肽(GSH)抗氧化物已有文獻研究指出，當麩胱甘肽消耗即是因氧化壓力引起細胞凋亡的事前現象，所以麩胱甘肽因ROS引起細胞凋亡產生的傷害有關。本結果也顯示，人類單核球細胞(THP-1)經由cumene hydroperoxide誘導，會導致麩胱甘肽的消耗，間接引起細胞凋亡，一旦經由baicalein及其衍生物的保護皆可以有效降低麩胱甘肽的消耗，也證實了baicalein及其衍生物能保護細胞免受到自由基的傷害。
Figure 4. Effect of baicalein and its derivatives on cumene hydroperoxide-induced GSH depletion in THP-1 cells. THP-1 (106 cells/ml) cells were incubated with 10 μM of baicalein and baicalein derivatives for 1 h at 370C in 5% CO2 incubator, and then treated with 500 μM cumene hydroperoxide for another 3 h. After drugs treatment, the THP-1 cells were incubated with 25 μM of CMF-DA for 20 minutes at 370C in the CO2 incubator. (A) Data in each panel represent the percentages of GSH-negative cells. (B) Data represent the percentages of GSH-negative cells. Values shown are mean ± standard deviation (n = 3-8 of individual experiments). # Statistically significant, p < 0.05 to untreated group.
由圖五A結果顯示，以baicalein及其衍生物處理人類單核球細胞(THP-1) 一小時後，再利用cumene hydroperoxide誘導THP-1細胞三小時，可以發現單獨加入500 μM cumene hydroperoxide會造成Bax蛋白質的表現量大於空白組(untreated)，而有加baicalein及其衍生物則會降低蛋白質表現量，回到空白組狀態。由以上結果能判斷baicalein及其衍生物可以抑制cumene hydroperoxide誘導THP-1細胞的apoptosis 相關蛋白質Bax的表現。由圖五B結果顯示，以baicalein及其衍生物處理人類單核球細胞(THP-1)一小時後，再利用cumene hydroperoxide誘導THP-1細胞三小時，可以發現單獨加入cumene hydroperoxide 會造成粒線體上(mitochondria) Bcl-2蛋白質的表現量大於空白組 (untreated)，而有加baicalein及其衍生物則會降低蛋白質表現量。過去已有研究指出Bcl-2蛋白質也能扮演抗氧化的功能來抑制細胞凋亡的產生，在Bcl-2 蛋白質過度表現時(overexpression)可以抑制自由基的產生，或降低細胞內ROS含量。由結果顯示，baicalein和B-C5會促使Bcl-2 蛋白質大量表現，這可能是在抑制細胞內自由基的產生。