植物抗虫基因工程研究进展

植物抗虫基因工程研究进展

摘要植物抗虫基因工程为防治农业害虫提供了一条崭新途径。本文对植物抗虫基因工程近年来所取得的某些研究进展，包括目前已发现和利用的抗虫基因、提高抗虫基因在植物体内表达的方法以及防止或延缓害虫产生抗性的策略等方面进行了综合评述，并对植物抗虫基因工程中有待解决的问题和发展前景提出了自己的看法。

关键词植物，抗虫基因，基因工程

虫害是造成农业减产的重要原因。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达30％以上。化学农药和生物农药的使用虽然可以减轻害虫对农作物的危害，但长期而大量的使用农药已使害虫产生了极高的抗性。同时，化学农药的过量使用，还带来了严重的人畜中毒和环境污染等问题。植物抗虫基因工程的诞生，为防治害虫提供了一条崭新的途径。由于该方法具有安全、有效、可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因而，自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。一方面，已经发现了大量可利用的抗虫基因，并有40多种抗虫基因已被导入植物体。另一方面，对于如何提高抗虫基因的表达以及防止害虫产生抗性的问题日益受到重视，并进行了多方面研究，已经取得许多重要的研究成果。本文试图对上述几个方面的进展作一综述。

⒈微生物来源的抗虫基因

苏云金芽孢杆菌的毒蛋白（简称Bt-toxin)基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因，Bt-toxin是是苏云金芽孢杆菌在孢子形成时期所产生的一种杀虫毒素，是一类分子量为130~160KD的蛋白质。当被昆虫吞食后，在昆虫中肠碱性环境下，经蛋白酶的作用Bt-toxin 被讲解产生的60KD左右的毒性小肽，并和中肠上皮细胞纹缘膜上的受体特异结合，然后插入细胞膜造成细胞膜穿孔，破坏细胞内外的渗透平衡，导致细胞膨胀而裂解，使得昆虫停止取食并最终死亡。

第一个Bt-toxin基因是1981年由Schnepf和Whiteley分离克隆的，到目前为止，已经有近180个不同的Bt-toxin基因被克隆和测序，并且新的Bt-toxin基因还在不断的被克隆和分析。根据Crickmore等人（1998）所提出的新的命名法则，这些已克隆的基因被划分为30大类，不同的Bt-toxin基因具有不同的杀虫谱。截止1999年7月，在所发现的Bt-toxin基因中，已有40余种获得了专利。

自第一次分离克隆到Bt-toxin基因以后，人们一直在试图将该基因转移进植物体并实现表达，以获得能够抗虫的转基因植物。1987年，世界上有四家实验室首次获得了转Bt-toxin基因的烟草或番茄（Barton等，1987；Fischhoff等，1987；Hilder等，1987；Vaeck 等，1987）。由于所用的基因是完整的野生型Bt-toxin基因或截短了3’端的野生型基因，所获得的转基因植株抗虫性都很弱，在转基因植物中毒蛋白的表达量只有0.001％或几乎检测不到毒蛋白的表达。进一步的研究发现，Bt-toxin基因在植物体内表达量过低是由于野

生型基因的mRNA不稳定造成的(Murry等，1991）。此外，Bt-toxin基因是原核基因，在植物中进行翻译时由于某些种类的tRNA含量过少而降低了翻译效率。于是，在后来的工作中，人们把注意力集中在了Bt-toxin基因的改造上。美国Monsanto公司的Fischhoff小组在这方面做出了出色的工作。该研究组的Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对cry 1 Ab基因进行了部分改造和完全改造，选用了植物偏爱的密码子，去除了原序列中存在的类似植物内含子、多腺苷酸信号序列或富含AT的ATTTA等不稳定元件（Perlak等，1991），然后将改造的基因转入番茄和烟草中，结果转基因植株的毒蛋白表达量增加了30100倍，有些植株的毒蛋白可高达可溶性蛋白的0.2％～0.3％。此外，Fischhoff小组还利用完全改造的Bt-cry1Ab基因首次获得了在大田中具有明显抗虫性的棉花(Perlak等，1993），利用完全改造的cryⅢA基因获得了抗鞘翅目害虫的马铃薯。

继Monsanto公司人工改造 Bt-toxin基因之后，国内外广泛开展了Bt基因的改造和转化研究。可以说，利用改造或人工合成的 Bt-toxin基因进行遗传转化已成为植物抗虫基因工程的主流，近几年已有大量的相关研究被报道。Iannacone等（1997）将Bt cry3基因进行改造，去除了影响表达的不稳定元件，选用了植物偏爱的密码子，极大地提高了毒蛋白的表达水平，获得了高抗鞘翅目甲虫的茄子。Maqbool等（1998）通过基因枪将人工合成的Bt cry2A 基因转入水稻，毒蛋白的表达量可高达1％某些植株的杀虫率达到100％另

外，Cornelisson等（1991）、Adang等（1995）、Bosch等（1995）、Stewart等（1996）以及 Cao 等（1999）也分别利用人工改造的 Bt-toxin基因得到了抗虫转基因植株，其中有些研究已获得专利。我国在以 Bt基因为基础的植物抗虫基因工程领域也取得了丰硕成果,，范云六领导的研究小组将3’端截短了的 Bt-toxin基因导入棉花和水稻，均已获得转基因植株。另外，他们还将天然的 Bt cry1 Ab基因进行改造，获得了适合于植物高效表达的毒蛋白基因（王京红等，1994）。郭三堆等人的研究小组人工合成了全长1824bp的 cry1 Ab和cry1 Ac融合的 GFM cry1A 基因，转基因烟草能显著抑制棉铃虫的生长发育，表现出有效的杀虫活性（黄其满等，1998；)。田颖川等人的研究小组和白永延等

人的研究小组也先后合成和部分改造了 cry1A基因，并导入烟草、甘蓝和油菜等，均获得了抗虫转基因植株（田颖川等，1991；毛慧珠等，1996；李学宝等，1999）。

大量的研究表明，Bt-toxin基因在经改造或重新合成以后其抗虫效果大为提高，与其它抗虫基因相比，在同等表达量之下,Bt类基因产物的抗虫能力最强（Schuler等，1998），因此，迄今为止，所获得的抗虫转基因植物大多都被引入了 Bt-toxin 基因，目前在美国已经商品化的三种抗虫作物（棉花、玉米、马铃薯）也无一例外地都使用了 Bt-toxin基因。值的一提的是，最近Selvapandiyan等（1998）从苏云金杆菌中克隆了一种新的 Bt-toxin基因cry1Ia5，发现该基因不经改造即可直接在植物体内高效表达，表达量与经改造的其它类 Bt 基因相近，杀虫效果非常明显。这一结果对于深入研究和发现新型 Bt 基因不无启发。

除了苏云金芽孢杆菌的 Bt-toxin基因以外，来自根癌农杆菌的异戊烯转移酶(isopen-tenyl-transferase）基因是另一类被证明具有抗虫性的基因。该基因的编码产物是细胞分裂素生物合成过程中的关键酶，当被导入烟草和番茄，发现能减轻由烟草天蛾（Manduca sexta)所造成的危害（Carozzi和Koziel，1997）。来自链霉菌的胆固醇氧化酶（cholesterol-oxidase）基因也被转入烟草，发现对烟青虫和棉铃象（ Anthonomus grandis）有较强毒杀效果（Purcell等，1993）。

2 植物来源的抗虫基因

2.1 蛋白酶抑制剂基因

蛋白酶抑制剂是一类存在于某些植物中的蛋白质，它能抑制昆虫或动物消化系统的

蛋白酶活性，对植物起着天然保护作用。昆虫体内的蛋白酶负责食物中蛋白质的消化，将蛋白酶抑制剂基因引入植物，即可通过影响昆虫的消化作用而致昆虫死亡。据最近的研究，蛋白酶抑制剂的直接抗消化作用似乎不是导致昆虫死亡的主要原因，更重要的是，由于蛋白酶抑制剂的存在，引起了昆虫体内蛋白酶的过量产生，从而造成昆虫体内必需氨基酸的亏空而致昆虫死亡（Gatehouse等，1992）。除此之外，蛋白酶抑制剂还可影响昆虫体内的水分平衡、酶的调节以及昆虫的蜕皮等。然而，有研究表明，在蛋白酶抑制剂的作用下，某些昆虫会被诱导产生一种适应机制，即通过产生新型的蛋白酶而避开抑制剂的影响（Jongsma等，1995）。

迄今所发现的蛋白酶抑制剂主要有4类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂。目前已有多种蛋白酶抑制剂（主要是丝氨酸蛋白酶抑制剂）基因被导入植物，有些已获得专利（Lee，1992；Acedo等，1994；Confalonieri 等，1998；Lee等，1999;Altpeter；1999等，1999）。其中豇豆的胰蛋白酶抑制剂（简称 CpTI）被认为是最有效的蛋白酶抑制剂。这种抑制剂具有广谱抗虫性，对鳞翅目、鞘翅目及直翅目的许多昆虫都有毒杀活性。CpTI基因目前已被转入至少10种植物。例如：CpTI 基因转化的烟草、油菜、马铃薯和水稻等对鳞翅目和鞘翅目害虫均具有良好的抗虫效果（刘春明等，1992；Mckersie和Brown,1997)。

2.2 淀粉酶抑制剂基因

淀粉酶抑制剂是应用于植物抗虫基因工程的第二类酶抑制剂。这类抑制剂在植物界广泛存在，可以抑制动物、微生物的淀粉酶活性而对植物本身的淀粉酶不起作用。目前了解较多的是来自菜豆（Phaseolus vulgaris）的α-淀粉酶抑制剂（αAI-Pv），它是一种热稳定的糖蛋白，能够与昆虫或哺乳动物的α-淀粉酶1:1形成复合物。实验表明转αAI-Pv 基因的烟草和豌豆均能阻止鞘翅目幼虫的生长发育（Altabella和Chrispeels，1990；Schroeder等，1995）。

2.3外源凝集素基因

外源凝集素是存在于植物中的能够与糖类复合物上的糖基结合的蛋白质。目前发现

有些外源凝集素对同翅目、鞘翅目、鳞翅目和双翅目的昆虫有毒性。导致昆虫中毒的机理虽然未有完全搞清，但已知外源凝集素是通过结合于昆虫中肠纹缘膜细胞而发挥作用的，很可能是影响了昆虫对营养物质的消化吸收，使昆虫饥饿直至死亡。某些外源凝集素不

仅对昆虫有毒性，对哺乳动物也有强毒性。但来自豌豆和雪花莲的外源凝集素对哺乳动

物却是低毒的，因此，近年来利用这两类凝集素基因所进行的基因转化工作日渐增多，已在包括马铃薯、小麦、陆地棉等多种植物中得到表达，并增强了转基因作物的抗虫性（Birch；等，1999；Stoger等，1999；王伟等，1999）。

2.4 来自植物的其它抗虫基因

豆科植物的几丁质酶基因曾被引入马铃薯，但并未发现对鳞翅目害虫具有抗虫性，只是对蚜虫有较弱的抑制生长作用（Gatehouse等，1996）。用来自烟草的阴离子过氧化物酶（anionic peroxidase）基因导入番茄等植物中，结果发现对鳞翅目和鞘翅目的某些害虫有显著的抗虫效果(Carozzi和Koziel，1997）。另外，来自长春花的色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase,TDC)基因被导入烟草，转基因烟草能使粉虱（Bemisia tabaci）的繁殖力降低97％（Thomas等，1995a）。以上几种基因虽然都表现出了一定的抗虫性，但其抗虫机理并不清楚，抗虫效果还有待于更多的实例加以验证。

3 动物来源的抗虫基因

在这一类基因中，研究较多的是来自哺乳动物和烟草天蛾（Manduca sexta）的蛋白酶抑制剂基因。经体外抑制实验发现来自牛的三种蛋白酶抑制剂（BPTI、α1AT和SI）均能显著抑制昆虫中肠提取物的蛋白质降解，然而，当把这些基因转入马铃薯，并未出现预期的抗虫效果，以转基因马铃薯饲喂的幼虫其体重反而超过了对照（Schuler等，1998）。与牛的蛋白酶抑制剂不同，来自烟草天蛾的蛋白酶抑制剂基因被导入棉花和烟草均表现出了

一定的抗虫性（Thomas等，1995b）。

另一类研究较多的是由蝎和蜘蛛所产生的毒素。这些毒素一般都能专一性作用于昆

虫而对哺乳动物无害或毒性很小。Barton（1990）曾将5种蝎毒基因导入烟草，发现转基因烟草对棉铃虫和烟青虫具有很高的致死性。我国学者蒋红等人（1996）人工合成并克隆了一种编码37个氨基酸的蜘蛛毒素基因，转基因烟草杀虫率可达30％～45％，并能显著抑

制昆虫蜕皮和生长发育，表现出了明显的抗虫作用。

第三类来自动物的抗虫基因是几丁质酶基因。从目前的研究来看，这类基因的抗虫

效果并不明显。例如：来自烟草天蛾的几丁质酶基因被转入烟草，转基因烟草对鳞翅目害虫几乎没有表现出抗性（Estruch等，1997）。

4 提高外源抗虫基因在植物体内的表达

以上所列的抗虫毒素根据其来源不同，对害虫的毒性也有所不同。但无论哪一种毒素，用于抗虫基因工程首要考虑的问题就是提高其表达量。表达量越高，抗虫效果就越好。因此，如何提高外源抗虫基因在植物体内的表达，将是植物抗虫基因工程的一个重要研究方向。

4.1基因改造

对于来自原核生物或动物的抗虫基因，在不改变氨基酸序列的前提下，通过人工改造或重新合成可以大大提高其在植物体的表达量。例如前面所述的Bt-toxin基因，在改造

过程中通过采用植物偏爱的密码子，增加GC含量，去除不合适的拼接位点及poly（A）等不稳定元件，其表达量可自野生型的0.001％提高到0.2％甚至更高，抗虫能力也得到了极大的增强（Perlak等，1991；Maqbool等，1998；Cao等，1999）。

4.2 利用定位信号提高基因表达

真核细胞内存在许多与蛋白质定位运输有关的信号序列。其中有些信号已被用于提高外源基因的表达。在抗虫转基因方面，Wang等（1992）将来自拟南芥Rubisco小亚基的转运肽序列连接于Bt-toxin基因之前，发现能使Bt基因的表达量提高10~20倍。另外,有些学者还发现内质网定位信号能显著提高外源基因表达产物的稳定性，例如，Wandelt等（1992）和Schouten等（1996）将内质网定位序列（四肽 KDEL的编码序列）与外源基因相连接，发现外源蛋白因大量积累于内质网腔而提高了稳定性。但内质网定位序列在抗虫基因方面的应用还未见报道。

4.3利用基质结合区提高基因表达

基质结合区（matrix association regions,MARs）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的 DNA 序列。近几年的研究表明，MARs可能是一种新的顺式作用元件，可减少转基因在个体之间表达的差异，并能显著提高转基因的表达水平。例如Allen（1993）用烟草作为材料，研究了异源 MARs（来自酵母）和同源 MARs（来自烟草）对GUS基因在烟草中表达的影响，发现酵母的 MARs能使转基因的平均表达水平提高 12 倍，而烟草本身的 MARs能使转基因的平均表达水平提高60倍。这一令人振奋的结果为解决抗虫转基因表达水平低的问题提供了新的努力方向。近年来国内外有些学者已开始着手将MARs 应用于植物抗虫基因工程，可望显著提高抗虫基因在植物体内的表达水平和抗虫能力。

4.4叶绿体转化

高等植物的叶绿体转化开始于90年代初期，由于叶绿体基因组拷贝数非常大，整合于其中的外源基因可以实现高效表达。并且由于叶绿体的基因结构与原核生物类似，来自原核生物的抗虫基因无需改造，以及可以实现定点整合等许多优点，使得叶绿体基因转化开始成为植物基因工程中新的研究热点。在抗虫基因工程中，应用这一转化系统，已经实现了外源基因的超常量表达。例如，Mcbride等（1995）将未经改造的Bt-toxin基因转入烟草叶绿体，Bt-toxin的表达量高达叶子总蛋白的5％杀虫效果极为显著。而经改造的 Bt基因利用核转化系统通常只能达到0.1％~0.6％本实验室已利用野生型Bt-toxin基因成功构建了油菜的叶绿体表达载体，并已完成了基因转化，抗虫基因的表达水平及转基因油菜的抗虫性正在检测中。

5 防止害虫产生抗性的策略

害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低了对某一种杀虫剂的敏感性。害虫对常规化学杀虫剂产生抗性已是一个众所周知且为全世界所普遍关注的问题，对 Bt类微生物杀虫剂或Bt毒素的抗性也已有大量报道，并发现这种抗性能够遗传给后代（Tabashnik等）。

抗虫转基因作物的大田推广在近几年才刚刚开始，如不加以防范，害虫对这些转基因作物产生抗性似乎是必然趋势。因此，如何防止或延缓害虫产生抗性，这已经成为植物抗虫基因工程的另一重要研究内容。

5.1 启动子的选择

在目前的抗虫转基因植物中，使用最多的是CaMV 35S启动子。这种启动子的组成型表达特点，使得抗虫基因的表达产物在植物生长发育的全周期以及植物的各种组织中都将存在，昆虫在长期的选择压作用下，无疑将会大大提高对转基因植物产生抗性的几率。为了解决这一问题，近年来人们逐渐使用了组织特异性表达启动子（Shi等，1994）和损伤诱导启动子（Pierpoint和Sherwry,1996）等特殊的启动子。这样可以使抗虫基因只在特定部位、特定时间或者只在植物受到损伤时进行表达，短时间内杀死害虫，减少害虫处于选择压下的时间，从而可以延迟或阻止害虫产生抗性。

5.2 联合使用两种以上的抗虫基因

迄今为止，大多数的研究工作都是将单一的抗虫基因转入植物，例如Bt-toxin基因、蛋白酶抑制剂基因等。除非这种单一的抗虫物质在植物体内表达量非常高，使接触到的害虫全部死亡，否则容易使害虫产生耐受性。解决这一问题的比较有效的方法就是同时使用两种或两种以上的抗虫基因转化植物，例如两种不同的Bt-toxin基因或Bt-toxin基因与其它来源的抗虫基因联用等，这样的转基因植物同时表达两个具有不同作用机制的毒素，即使害虫对其中一种毒素产生了抗性，转基因植物的抗虫能力也不至于丧失。Barton（1990）把Bt-toxin基因和蝎毒素基因同时导入烟草，其抗虫性及防止产生抗性的能力大为提高。我国学者王伟等（1999）将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，得到了含双价抗虫基因的转化植株。Sachs等（1998）将分别含有cryIA（b）和cryIA（c）的棉花进行杂交，得到了同时含两种Bt-toxin的棉花，从而提高了抗虫性。最近，我国学者赵建周等（1999）对转双基因的烟草延缓棉铃虫抗性的作用进行了评价，首次在室内人工汰选条件下证明了转双基因烟草可以显著延缓棉铃虫的抗性形成。由此看来，同时使用两种以上的抗虫基因将是今后防止昆虫产生抗性的一个重要方向。

5.3 提供“避难所”

防止害虫产生抗性是一项系统性的工作，除了上述在基因构建方面所应用的几种策

略以外，能否在种植模式上进一步控制昆虫的抗性，也是一个值得考虑的问题。最近，Peferoen(1997)提出了一种“高毒/避难所”（high-dose/refuge）的种植模式，即在高水平表达毒蛋白的转基因作物大田附近种植一小区非抗虫的同类作物作为“避难所”，这样只有抗性纯合体昆虫才能在大田中存活，而敏感昆虫只能在“避难所”存活。如果能够通过某种机制吸引（或强迫）抗性纯合体和敏感昆虫在“避难所”交配，那么其杂合体后代都将被抗虫作物毒害致死。可见，这种种植模式在一定程度上避免了抗性纯合体之间的交配，因而能使抗性基因逐渐稀释以至消除，降低了抗性基因在昆虫种群内产生的几率。然而，这种模式有两个关键问题需要解决，一是要求转基因作物高水平表达毒蛋白，二是要促使抗性纯合体与敏感昆虫之间进行交配繁殖。如果这两个问题能加以解决，它对防止害虫产生抗

性确实是一个值得尝试的新途径。

6 问题和展望

植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了丰硕成果，抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯的商业化推广证明了这项技术的实用性。为了更好地推进这项技术的发展和应用，在今后的研究中应着重解决以下问题：(1)继续发现新型、高效的抗虫基因，并深入研究其抗虫机制。这是抗虫基因工程发展的基础。(2)应加强对抗虫基因在转基因植株后代中的遗传、表达稳定性的研究，积极探索定点整合的方法，减少抗虫转基因对植物的正常生长发育所造成的不利影响。目前这方面的研究还很少。(3)深入研究害虫产生抗性的机制并制定确实有效的反抗性措施。害虫的抗性已成为制约抗虫作物推广应用的潜在因素，这一问题如不能有效解决，将使植物抗虫基因工程的研究功亏一篑。

尽管存在许多有待进一步解决的问题，但应该看到，植物抗虫基因工程的发展速度是非常快的。可以相信，随着研究的不断深入，必将有更多的抗虫作物新品种从实验室走向大田。在即将到来的二十一世纪，植物抗虫基因工程将为世界农业的发展发挥积极的推

动作用。

黎天慧

药学11级

20110207059