分子试验的验证要求

临床分子诊断 方法学验证要求
关 明
复 大学附属华山医院检验医学科 复旦大学附属华山医院检验医学科

主要内容 ? 什么是验证？ 自建项目 ？ 商业化项目？ ? 如何做验证？ 步骤和实施路径 ? 举例说明
JAK2 V617F突变方法的建立 V617F突变方法的建立

分子诊断面临的挑战
? 涉及方法较多，如PCR、荧光定量PCR、MLPA、测序等； ? 实验步骤较多，包括标本的分离保存、处理、检测； ? 手工程度较高，自动化程度普遍偏低，较多依赖手工，不同 的实验室条件和操作者等因素对实验结果的影响较大； ? 尚未建立公认的质量管理标准等； ? 更高的准确性要求； ? 结果报告缺乏标准化； ? ……

这些基地将为个体化医学相关检测工作制 这些基地将为个体化医学相关检测 作制 定国家行业标准，并面向相关从业人员展 开规范化、标准化的培训工作，为我国个 体化医学研究与应用提供宝贵经验，大大 加快我国分子诊断的进程。

CONTENTS
? ? ? ? ? ? ? SUMMARY OF CHANGES UNDERSTANDING THE 2010 CAP ACCREDITATION CHECKLIST COMPONENTS HOW TO INSPECT USING R.O.A.D INSPECTION TECHNIQUE ADDITIONAL INFORMATION APPLICABILITY C PROFICIENCY TESTING QUALITY MANAGEMENT AND QUALITY CONTROL GENERAL ISSUES PROCEDURE MANUAL ASSAY VALIDATION REQUISITIONS SPECIMEN HANDLING SPECIMEN PROCESSING QUANTITATIVE ASSAYS: CALIBRATION AND STANDARD REAGENTS CONTROLS ANALYSIS Extraction A lifi ti Amplification Restriction Endonucleases Sequencing Detection Methods Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Arrays

“Verification Verification”和 和“Validation Validation”
Verification (确认） “通过提供客观证据证明特定的要求已得到满足” ? 当已经存在合适的性能参数时候，有必要明确在实验室内新 的试验符合参数规定，这个过程叫确认。 ? 正确地做某个试验（ the th test t t is i being b i performed f d correctly tl ）. ? 其他确认的应用包括：采用某个实验室已经建立的技术开展 新试验（为 个新的基因测序） 或者开展某个已经在其他 新试验（为一个新的基因测序）；或者开展某个已经在其他 实验室验证过试验。

“Verification”和“Validation”
Validation(验证)
“通过提供客观证据证明预期的使用或应用要求已得到 满足”
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当没有合适的性能参数可供参考时需要验证。 当没有合适的性能参数可供参考时需要验证 与”金标准“和参考试验相比较去评估性能 做正确的试验（performing the correct test) 在医学分子诊断领域，由于往往缺乏参考方法 或者参考物质 通常将最可靠的方法作为标准 或者参考物质，通常将最可靠的方法作为标准 。

不同认可体系对方法学验证的要求
? CAP的“方法学验证（assay validation）”和ISO15189中的“诊断性验证（ diagnostic validation）” 共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断之前必须进行方法学验证，以了 解该检测的临床表现 保证实验结果可信度[1-3]。 解该检测的临床表现，保证实验结果可信度 CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数” ，还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液 、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告 范围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。
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[1]Guzel O, Guner EI. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory I. Clin Biochem,2009,42: 274-278. [6]Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory II. Clin Bi h 2009 42 279-283. Biochem,2009,42: 279 283 [7]Jennings L, Van DV, Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests. Arch Pathol Lab Med,2009,133: 743755.

方法学验证的要求的修正和改进

IVDs And LDTs. IVDs. LDTs
? I In vitro it diagnostics di ti (IVDs): (IVD ) 商业化生产试剂盒； 商业化生产试剂盒 通过FDA 510(k) clearance or PMA (premarket approval)。 ? Laboratory-developed Laboratory developed tests (LDTs): 自建项目； 局限于实验室内使用。 ? Many of these clinically important LDTs are unlikely to ever become FDA cleared or approved because low test volumes make it economically go through the FDA cleared: In vitro diagnostics unfeasible that have gone throughto and passed a 510(k) trial. FDA approved: An IVD that has gone through and PMA passed a PMA trial. current FDA 510(k) or approval process. 510(k) trials are designed to show that an IVD is substantially equivalent to a legally marketed
predicate device. 510(k) trials are less involved and less expensive than PMA trials. Premarket approval trials are required for class III medical devices or if there is no predicate device available for comparison. They are significantly more expensive to perform than 510(k) trials.
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Verification/确认试验
? 使用范围：主要用于商业化试剂盒（in vitro diagnostics， IVDs）项目，指已经商业化生产，并已经通过美国 ）项目 指已经商业化生产 并已经通过美国FDA 510(k) clearance 或approval过程的分子诊断项目。
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主要目的：确证厂家提供的数据在本实验室的的实际效果 主要指标：准确性、精确性、参考范围和可报告范围 主要指标 准确性 精确性 参考范围和可报告范围 （这些指标通常在厂商的说明书中提及）。
PARR (precision, accuracy, reportable range, and reference range).

Validation/验证试验
? ? ? 使用范围：自建项目（LDTs）和修改项目 （modified FDAcleared/approved tests） 主要目的：验证本试验在临床使用的各项性能指标及其实际效果 主要指标： 准确性、精确性、参考范围和可以接受范围（与确证实验要求相同） 分析敏感性、分析特异性（验证试验要求） 其他涉及的重要的评价指标（标本稳定性、干扰物质、线性……） （验证试验要求） 与确诊试验相比相对复杂
PARR+AS+AS (precision, accuracy, reportable range, reference range, analytic sensitivity and analytic specificity) sensitivity, 和其他涉及的重要的临床评价指标
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Clinical validity/临床验证
? ? 主要包括：临床敏感性（clinical sensitivity）和临床特异性（clinical specificity) 。 临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为 阳性的结果中 用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来说） 阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来说）； 临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异常的比 例，强调实验结果与临床诊断的一致性。 临床特异性也不同于分析特异性：分析特异性主要指参考方法检测结果 为阴性的结果中，用实验方法得到阴性结果的一致性（对定性试验来 说 ；临床特异性 要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾 说）；临床特异性主要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾 病或异常的比例，也强调实验结果与临床诊断的一致性。如果是定量实 验，则分析敏感性的定义接近于最低检测浓度的概念。 某些罕见的疾病，由于阳性病例的数量有限，实验室进行临床敏感性评 价存有一定难度，这时可以引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理 论支撑。 临床特异性：正常对照容易收集，故容易实现。
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