鸡蛋中溶菌酶的提取

鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定

李莹姝蒋华云*

（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）

摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。溶菌酶得率为0.0474mg/100ml

（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。

关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGE

Extraction, purification and purity of Egg lysozyme

Yings Li Huay Jiang*

(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)

Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.

Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE

溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂, 在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。[1] [2]

溶菌酶来源广泛, 人、动物、植物和微生物中均有发现, 其中鸡蛋清中含量较高, 因此, 工业生产溶菌酶常以鸡。蛋清为原料鸡蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶[3]，其化学性质稳定，纯品为白色或微黄色结晶体，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一种分子量在14～15kD，等

电点pH 值在11.0 左右，最适效应温度在50℃，最适pH 值为6.0～7.0 的碱性球蛋白。它的生

物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。溶菌酶的抗菌及抗病毒活力与pH 值有关，在酸性介质中，活力显著增强。当前, 溶菌酶的制备有多种方法，最常用的是离子交换树脂吸附法[4]。

溶菌酶的用途很多，由于它本身是一种天然蛋白质，无毒性，可以作为防腐剂、保鲜剂。在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学。溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取，在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于破坏细胞壁，制备无菌提取液。溶菌酶所具有的广泛用途吸引了国内外众多学者对其进行研究，已发表不少关于溶菌酶的试验报道。

1材料和方法

1.1材料与仪器

新鲜鸡蛋3颗,购自市场；724型酸性阳离子交换树脂；灭菌纱布；1 mol/L NaOH ，1 mol/L HCl ；蒸馏水（实验室桶装水）；磷酸缓冲液（pH 6.5，0.15M ）；10％（NH 4）2SO 4溶液；固体（NH 4）2SO 4 ；BaCl 2 ； 12﹪分离胶；4﹪浓缩胶；Tris-甘氨酸电极缓冲液； loading Buffer ；标准蛋白Marker ；

染色液（考马斯亮蓝G-250）；脱色液（冰乙酸，甲醇）；葡聚糖凝胶（SephadexG-75）；蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL ）； G-75洗脱液（KCl ，HAc ）

电子分析天平；真空泵；超声振荡器；布氏漏斗，循环水式多用真空抽滤泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通离心机，高速冷冻离心机；透析袋，磁子，磁力搅拌器，玻璃层析柱（20mm×15cm），恒流泵，细滴管，Bio-Rad 层析系统设置，部分收集器；水浴锅；Bio-Rad 垂直电泳系统（制胶系统、电泳槽）；脱色摇床；可见分光光度计(UV-1100型)；紫外分光光度计；微量移液器；4℃冰箱；容量瓶；精密pH 试纸；等。

部分试剂详细配方及配法见附录I

1.2实验方法

1.2.1阳离子交换法提取溶菌酶

树脂预处理：干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质； 1 mol/L 的HCl 浸泡2 h ，去离子水洗3次至至近中性；抽滤收集树脂,1 mol/L 的NaOH 溶液浸泡2 h ，去离子水洗3次至近中性；抽滤收集树脂,加0.15 mol/L 、pH 值为6．5的磷酸缓冲液平衡过夜待用。 蛋清制备：将3个新鲜鸡蛋洗净干燥，小端敲一个小洞，大端打一个小孔进气，分离得鸡蛋清，用1 mol/L HCl 调节PH 到7。过滤前称量烧杯重48.7g ，缓慢搅拌用灭菌的两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，蛋清与烧杯总重207.5g ，蛋清净重158.8g 。用1 mol/L 的HCl 溶液调pH 值至7.0，量蛋清体积为100 ml 。在调节PH 时蛋清中出现少量白色沉淀，可能为部分蛋白由于局部过酸而变性。

吸附：蛋清在不断搅拌下加入抽滤好的724树脂25g （相当蛋清四分之一体积的树脂），冰水浴中磁力搅拌器缓慢搅拌（使树脂全部悬浮在鸡蛋清中，搅拌不能起泡）吸附2.5 h ，4℃静置1.5h 。然后3000r/min 离心15min 分层，收集树脂，回收蛋清（留样A ）。

去除杂蛋白：收集树脂用去离子水振荡水洗直至洗液澄清（至无白沫为止），吸管轻吸去洗液，以去除杂蛋白。（每洗1次，离心1次，总共3次）冰浴中用等体积的0.15mol/L 、pH =6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min ，抽滤，重复洗三次，注意防止树脂流失。最后一次抽滤滤除树脂水分至干燥。

洗脱溶菌酶：树脂中加入35ml （等体积）的10％（NH 4）2SO 4溶液搅拌洗脱30 min ，抽滤,使

溶菌酶从树脂上洗脱下来，重复两次，合并收集洗脱液（留样），洗脱液过滤后，准确量取体积100ml 。（留样B ）

盐析:每83mL 洗脱液加32g 磨细的固体（NH4）2SO4，本实验中总量为38.55g 。缓慢加入（NH 4）2SO 4搅拌待完全溶解后保鲜膜封口，置于4℃冰箱盐析过夜。

透析:待白色沉淀析出，3000r/min 离心15 min ，收集沉淀，用去离子水将沉淀洗下并全部溶解（4.5ml 去离子水），装于透析袋中，于去离子水中透析（冰浴），期间2次更换去离子水，直至用BaCl 2检测透析完全。透析装置中加入磁子，于磁力搅拌器中搅拌加快透析速度。

去杂质蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl 调整pH4.6，产生少量白色沉淀（留样D ），可能为杂蛋白。3000r/min 离心10min ，收集上清液（留样C 20ul ）。

浓缩：用PEG-20000浓缩上清液至1.5ml （留样E ，20ul ，加loading buffer,出现黄色（可能为浓缩时透析袋中渗入了PEG-20000）。[5] [6]

凝胶溶胀及预处理:取足量SephaexG-75于烧杯中加入20倍体积洗脱液，置室温溶胀2天。反复倾泻去掉细颗粒，并泵脱气；洗脱液用超声脱气完全。

测柱床总体（Vt）：取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在距柱上端约3cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt=32.5 ml。

装柱：在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度），将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。

预加样：在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为26.5ml。吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取1.0 mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，柱上端再用洗脱液充满后用0.5mL/min的速度开始洗脱。收集洗脱液没管1.0 ml。手动记录时间与对应

的OD280并绘制曲线。葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液(1倍床体积)继续平衡一段时间。

加样和洗脱：按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液1.0 mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约0.5mL/min的速度洗脱并收集洗脱液每管0.5 ml。手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。将收集管编号置于4℃冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。（预先测得记录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值处样品。）

制胶：电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。静置20min，将水倒去。将 4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。（取下胶版放入PE手套，加适量蒸馏水4℃保存）点样：将样品与loading Buffer 1:1混匀。将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5ul。接通电源先恒压130V电泳，待各样品从浓缩胶进入分离胶后恒压220V继续电泳，直到溴酚蓝距凝胶边缘5mm是停止电泳，关闭电源。

染色及脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，小心用塑料板开启电泳厚板和薄板，使胶片完整取下。用塑料板切去浓缩胶部分，分离胶放入大的培养皿用考马斯亮蓝R-250摇床染色20min,回收考马斯亮蓝R-250，在培养皿中加脱色液脱色过夜（期间多次更换脱色液直至背景清楚，条带清晰），并对电泳图谱拍照记录。

采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。[7]先用牛血清清蛋白（BSA）及考马斯亮蓝G-250制作蛋白质标准曲线，再根据标准曲线回归方程计算目的蛋白浓度。

附：具体组分加样量见附录II

2结果和分析

2.1凝胶层析纯化

图1和图2分别为蓝色葡聚糖和蛋白样品的凝胶层析洗脱图谱。

图1层析条件流速0.5ml/min,每2min收集一管。曲线呈明显的尖峰，而且范围狭窄，说明

层析柱性能很好。OD280在7、8、9号管出现峰值，根据收集管颜色判断9、10、11号管为峰值，由此推断从经过紫外检测器测得OD值到由部分收集器收集到该样品推迟体积为2ml。

图1 蓝色葡聚糖凝胶层析洗脱图谱

图2上可以看出，在样品峰值之前有其他的杂蛋白洗脱出来，可能为清蛋白、朊蛋白或PEG浓缩时混入的PEG。在层析过程中第25分钟时出现重大失误，发现凝胶柱干裂，停止洗脱，虽然记录到峰值，但由于存在2ml延迟，未收集到峰值处洗脱液，只收集到第19和20min的洗脱样品（24和25号管收集液,），该处样品处于多个蛋白洗脱峰之间，由此推断成分复杂，目的蛋白不纯。

图2蛋白样品凝胶层析洗脱图谱

2.2蛋白质纯度

图3和图4分别为凝胶层析纯化之前和之后的SDS-PAGE电泳图谱。图3中由于留样A（树脂吸附后蛋白上清液）浓度太大并可能部分发生凝固，且未稀释，影响了蛋白Maker及其他样品泳道的效果。但仍然可以分辨出蛋白Maker的六条带，最下面一条为溶菌酶的条带，分子量为14．3kD。对应的4号和6号泳道蛋白样品中分离得到的溶菌酶的条带颜色较深，证明粗提取得到了浓度较高的溶菌酶，但含有大量杂蛋白，主要为卵清蛋白（45kD）、卵白蛋白（66.4 kD）及其他杂蛋白，还含有少量的PEG（20.1kD处）。留样A显然含有大量杂志蛋白，分子量主要分布在44.3到97.2 kD之间。

从图4可以看出，6号和7号泳道的第19和20min的洗脱样品即24和25号管收集液，因为处于杂蛋白峰值和溶菌酶峰值之间，成分复杂，显然是不纯的，主要有两条带，除溶菌酶外还有少量卵清蛋白。8号泳道为借用其他组较好的层析后样品，可以看出纯化效果较好，五杂蛋白。9号泳道的留样A稀释100倍后电泳效果较好，主要成分为杂蛋白。

两图中杂蛋白样品的条带中也有少量溶菌酶，证明溶菌酶在每一步都会不可避免的损失。随着纯度越高，得率越低。条带颜色的深浅一方面与酶浓度有关，另一方面与染料的选择及浓度和染色时间有关，一般染料浓度越高，染色时间越长，染色越深，但脱色也更难。在本试验中，加样量在5 μL 左右、固定染色20min 比较合适，脱色时在摇床上洗脱过夜效果最好。

图3溶菌酶产品的

SDS-PAGE电泳图谱

1.标准蛋白Marker

2.留样A （未稀释）树脂吸附后蛋白上清液

3.留样B 10％（NH4）2SO4溶液洗脱树脂的洗脱液

4.留样C 透析液去杂蛋白离心后的样品

5.留样D 透析液调节PH至4.6后产生的白色杂蛋白

6.留样E PEG浓缩后的样品

图4层析后溶菌酶产品的SDS-PAGE电泳图谱

1. 标准蛋白Marker

2. 留样B 10％（NH4）2SO4溶液树脂的洗脱液

3. 留样C 透析液去杂蛋白离心后的样品

4. 留样D 透析液调节PH至4.6后产生的白色杂蛋白

5. 留样E PEG浓缩后的样品

6. 层析24号管收集样品

7. 层析25号管收集样品

8. 其他实验小组层析较好的收集样品

9. 留样A（稀释100倍）树脂吸附后蛋白上清液

2.3蛋白质浓度

图5所示为蛋白质标准曲线，相关系数R达0.985，表明线性关系较高，符合实验要求。利用此标准曲线可计算样品的溶菌酶浓度、得率等。

图5 蛋白质标准曲线

提取的蛋白样品稀释10倍后的OD595=0.2905，代入回归方程得到该蛋白样品浓度为

3.16mg/ml。由此计算蛋清中溶菌酶的得率为：

3.16mg/ml × 1.5ml

得率= __________________________ =0.0474mg/100ml

100ml

但据参考文献，蛋清溶菌酶提取率可达0.4g/100ml。[5]但采用本实验的提取方法, 实验的酶得率非常低。可能原因是离子交换剂选择的不同，提取个步骤中损失较多。张文会等使用将D125阳离子交换树脂的Na+型、H+型混合，本实验使用724型酸性阳离子交换树脂，吸附能力可能存在一定差异。在粗提取中用1mol/L的HCl调节PH时局部过酸使部分溶菌酶变性凝固；在蛋清的树脂吸附使用磁力搅拌而不是手动搅拌，影响了吸附效果，电泳结果显示有微量的溶菌酶残留在蛋清上清液中；在去除杂蛋白的过程中流失了少量树脂也损失了溶菌酶；其他个步骤中都有少量含溶菌酶的溶液残留在容器壁上，造成溶菌酶损失。

3 讨论

3.1 树脂吸附

实验后得知在阳离子交换层析吸附过程中,不能用磁力搅拌器搅拌, 需要手动搅拌,且不能搅动太快，不能出现泡沫。因为磁力搅拌器是靠摩擦力搅拌, 易将树脂打碎, 影响溶菌酶的吸附效果。本实验吸附过程使用了磁力搅拌器搅拌，对实验造成了影响，直接影响了溶菌酶的得率。

3.2 调节PH及盐析

在用调节蛋清PH时使用了1mol/l的HCl，可能酸度过高滴加速度过快，导致了部分蛋白局部过酸变性，影响的得率。吸取这次教训，在用硫酸铵固体盐析溶菌酶之前，要把硫酸铵固体结晶研磨成细微的粉末状，加入时要缓慢加入，不断搅拌防止局部盐度过高导致蛋白局部变性。由此可见，在提取蛋白过程中加入任何溶液或固体都要极缓慢的加入，并且搅拌，防止局部浓度过高对蛋白活性产生影响。

3.3透析与浓缩

因为洗脱溶解蛋白样品时没能控制好蒸馏水用量，且透析过程使样品溶液体积进一步增加，因此用PEG-20000浓缩蛋白样品。可能是由于透析袋没有扎紧或透析袋本身的问题，PEG-20000进入到透析袋，与蛋白样品混在一起，这样必然影响目的蛋白的纯度并可能影响溶菌酶的活性。

3.4溶菌酶凝胶层析

本实验凝胶层析中凝胶柱是自己手动填充的，这一步非常重要，装柱的质量直接关系到分离样品的成败。柱子应固定在稳定的支架上,并保证其垂直，同时需寻找合适体积的洗脱液与凝胶灌入柱中，注意不能出现断层现象，再经常压平衡过夜，加压平衡2小时，用蓝色葡聚糖-2000检验，蓝色色带狭窄均匀，才算顺利制备出凝胶柱。本实验凝胶柱制备非常成功，凝胶柱性能良好。

层析过程所用的洗脱液一定要超声脱气1小时以上，脱气后不要震荡，不要倾倒混合，一面在此混入气体，已脱气的要用保鲜膜封口，以免混入杂质。层析系统的入口管要保证完全没入洗脱液。

实验最大的遗憾是在样品层析时发生凝胶柱干裂，虽然已记录到峰值，但由于体积延迟未收集到峰值处电泳纯的样品。分析原因可能是系统接口处漏气，凝胶柱产生负压而进入空气。当时两名同学忙于记录数据及收集样品，未及时发现问题。这是一次深刻的教训，任何实验中如果出现一点差错，就可能前功尽弃，

3.5 SDS-PAGE电泳

电泳是本实验的眼睛，用来检测每一步骤中样品是否存在，纯度如何，以及去除的杂蛋白成分如何，多条电泳条带进行多重、两两比较、横向及纵向比较，帮助分析提取效果，凝胶层析纯化及蛋白质得率。出现问题可以从电泳图谱上寻找问题的根源。电泳过程中还要注意的是点样的蛋白样品的浓

3、 Tris-甘氨酸电极缓冲液：5×Tris-Gly Buffer稀释5倍后使用。

5×Tris-Gly Buffer：

附录II 考马斯亮蓝G-250法蛋白质标准曲线